一株植物乳杆菌Z43及其在低盐发酵香肠中的应用

一株植物乳杆菌z43及其在低盐发酵香肠中的应用
技术领域
1.本发明涉及微生物及肉类食品发酵领域，具体涉及一株植物乳杆菌z43及其在低盐发酵香肠中的应用。


背景技术：

2.发酵香肠是一种传统肉制品，是指将绞碎的肉同糖、盐和发酵剂等混合后灌进肠衣，经过微生物发酵而制成的具有稳定微生物特性和典型发酵香味的肉制品。我国传统发酵香肠以自然发酵为主，发酵周期长达8-10个月，生产成本高；没有明确的技术指标，通常产品质量参差不齐，安全性也难以保证；传统发酵香肠还有着含盐量高、存在有害微生物以及易腐败变质等问题。在传统发酵香肠现代化研究中，利用微生物发酵剂控制原料肉中的不良微生物，保障产品风味、品质，提升安全性和质量稳定性，控制产品发酵进程，从而得到质量更好、安全性更高的产品受到关注。植物乳杆菌可以通过产酸降低ph值，抑制腐败微生物的生长，保障产品质量，提升产品的安全性，是近年来肉用发酵剂开发的主要微生物菌种。但由于植物乳杆菌抑菌效果不十分显著等原因，需要与较高浓度的食盐、糖、酒等配合使用才能达到较为理想的效果，所以该类产品食盐或糖等的添加量较高；而且用单一的植物乳杆菌所制备的发酵香肠存在酸味过重、风味较差等问题。现有技术中，专利申请号201811111254.5的中国专利《植物乳杆菌cq02-108及其在发酵香肠制备中的应用》将植物乳杆菌cq02-108应用到了发酵香肠中，专利申请号201710498700.1的中国专利《一种植物乳杆菌及其在中式猪肉发酵香肠制备中的应用》将植物乳杆菌njau-01应用到中式猪肉发酵香肠中，上述专利中，其发酵香肠的制作时间都较长，盐含量均较高，并未使用冻干菌粉直投式发酵剂，且并未对发酵香肠的风味物质进行分析。随着人们健康意识的增强以及对风味的更高追求，以上述为代表的现有技术中，发酵香肠的发酵过程中存在含盐量高问题以及风味口感有待进一步提高。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一株植物乳杆菌z43及其在低盐发酵香肠中的应用。本发明的目的是提供改善发酵香肠风味和降低发酵香肠含盐量的植物乳杆菌z43，还公开了植物乳杆菌z43的冻干菌粉直投式发酵剂以及植物乳杆菌z43在低盐发酵香肠中的应用。
4.本发明采用的技术方案是：本发明提供了一株植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)z43，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23962。
5.本发明还提供了一种植物乳杆菌z43的冻干菌粉直投式发酵剂，所述冻干菌粉直投式发酵剂采用权利要求1所述的植物乳杆菌z43制备。
6.进一步地，所述冻干菌粉直投式发酵剂由植物乳杆菌z43、脱脂乳粉、海藻糖、甘油以及蒸馏水制备。
7.进一步地，所述冻干菌粉直投式发酵剂的制备方法包括以下步骤：
8.(1)将植物乳杆菌z43菌株接种到mrs液体培养基中37℃培养16h，所述植物乳杆菌z43菌株接种到mrs液体培养基的浓度为107cfu/ml，得到植物乳杆菌z43发酵液；
9.(2)将步骤(1)得到的所述植物乳杆菌z43发酵液在4℃下8000r/min离心5min，收集菌体沉淀；将所述菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤，4℃下8000r/min离心5min，重复两次；
10.(3)将步骤(2)得到的菌体与复合冻干保护剂，混合所述复合冻干保护剂的组成为：脱脂乳粉8g，海藻糖13g，甘油3g以及蒸馏水100ml，115℃灭菌30min。
11.(4)将步骤(2)得到的菌体与步骤(3)得到的复合冻干保护剂混合重悬，所述复合冻干保护剂体积为步骤(1)中植物乳杆菌z43发酵液体积的1/5，重悬后在-20℃预冻5h，-70℃冷冻12h，再真空冷冻干燥24h，得到冻干菌粉直投式发酵剂。
12.进一步地，步骤(1)中，mrs液体培养基组成为蛋白胨10.0g，牛肉粉8.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0g，醋酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g以及硫酸锰0.05g，加蒸馏水至1000ml，ph为6.2
±
0.1，121℃灭菌20min。
13.本发明还提供了上述植物乳杆菌z43在低盐发酵香肠中的应用。
14.进一步地，所述低盐发酵香肠的食盐添加量为1.5％。
15.本发明的有益效果是：
16.(1)本发明的植物乳杆菌z43筛选自风干广味肠，来源于发酵肉制品，安全性高，适应香肠发酵环境。
17.(2)接种本发明植物乳杆菌z43可以快速生长、快速产生抑菌物质、快速产酸降低产品ph值，降低挥发性盐基氮的产生，抑制肠杆菌的生长，使产品质量更优。
18.(3)本发明将植物乳杆菌z43通过特定的组配和制备工艺冻干后得到植物乳杆菌z43的冻干菌粉直投式发酵剂。本发明提供的植物乳杆菌z43直投式发酵剂安全无毒，兼具抑菌、防腐功能。使用时，通过添加该直投式发酵剂可快速降低ph，抑制腐败微生物的生长，防止发酵香肠的腐败变质，缩短发酵周期，提高发酵香肠的安全性，提高发酵香肠产品质量，增加产品香味。
19.(4)本发明以植物乳杆菌z43作为单菌肉制品发酵剂制备发酵香肠，在香肠发酵结束时，乳酸菌数可达10
8.32
，可有效抑制腐败微生物和病原菌的生长，提高了产品的安全性。
20.(5)本发明使用植物乳杆菌z43作为单菌肉制品发酵剂制作发酵香肠，在保证安全的基础上，明显改善了产品的感官质量，使产品拥有了更好的风味和外观，增加了消费者接受度。
21.(6)本发明发酵周期短，接入本发明直投式发酵剂，有效缩短了发酵香肠的制作周期，3天时间即可完成发酵。
22.(7)使用本发明的发酵香肠产品盐含量更低，食盐添加量仅为1.5％。
附图说明
23.图1菌株z43个体形态；
24.图2发酵香肠样品的ph值测定结果；
25.图3发酵香肠样品的tvbn值测定结果；
26.图4发酵香肠样品的乳酸菌数测定结果；
27.图5发酵香肠样品的肠杆菌数测定结果；
rdna鉴定结果显示菌株z43与ncbi数据库中的多株植物乳杆菌的相似性为99％。
43.经过以上鉴定，可以确定菌株z43属于植物乳杆菌，因此重新将其命名为植物乳杆菌z43。
44.2、菌株的保藏：植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)z43，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号：cgmcc no.23962，保藏日期：2021年11月24日。
45.实施例2、植物乳杆菌z43冻干菌粉的制备
46.将植物乳杆菌z43菌株接种到mrs液体培养基中37℃培养16h，所述活化好的植物乳杆菌z43菌株接种到mrs液体培养基的浓度为107cfu/ml，得到植物乳杆菌z43发酵液。
47.步骤(1)中，mrs液体培养基包括组成为蛋白胨10.0g，牛肉粉8.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0g，醋酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g以及硫酸锰0.05g，加蒸馏水至1000ml，ph为6.2
±
0.1，121℃灭菌20min。
48.(2)将步骤(1)得到的所述植物乳杆菌z43发酵液在4℃8000r/min离心5min，收集菌体沉淀。将所述菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤，4℃下8000r/min离心5min，重复两次。
49.(3)将步骤(2)得到的菌体与复合冻干保护剂混合，所述复合冻干保护剂的组成为：脱脂乳粉8g，海藻糖13g，甘油3g以及蒸馏水100ml，115℃灭菌30min。
50.(4)将步骤(2)得到的菌体与步骤(3)得到的复合冻干保护剂混合重悬，所述复合冻干保护剂体积为步骤(1)中植物乳杆菌z43发酵液体积的1/5，重悬后在-20℃预冻5h，-70℃冷冻12h，再真空冷冻干燥24h，得到植物乳杆菌z43的冻干菌粉，即为直投式发酵剂。该复合冻干保护剂对植物乳杆菌z43菌株具有良好的冻干保护作用，冻干存活率可达91.5％，保证了不同批次发酵香肠产品质量的一致性。
51.本发明还给出了所述植物乳杆菌z43在低盐发酵香肠中的应用，所述低盐发酵香肠的食盐添加量为1.5％。
52.实施例3、发酵香肠的制备及效果评价
53.一、发酵香肠的制备
54.1、发酵香肠工艺流程
55.原料预处理
→
拌入调味料
→
加入发酵剂
→
灌肠
→
发酵
→
成品
→
贮存。
56.2、原料预处理
57.将购于超市的猪肉绞碎，按肥∶瘦＝3∶7的比例搅拌均匀备用。
58.3、拌入调味料
59.将盐15g、糖15g、味精3g、肉制品护色剂2g、十三香2.5g、淀粉4g溶于10ml无菌水中，然后再与1kg肉混匀。
60.4、加入发酵剂
61.设置三个接种组：将植物乳杆菌z43的冻干菌粉直投式发酵剂用适量无菌生理盐水(5ml/kg肉)混合后，与拌入调味料的肉混匀，接种量为107cfu/g，成品即为“植物乳杆菌”组；将商业发酵剂vop-92(乳酸片球菌)用上述等量无菌生理盐水溶解，与肉混匀，成品即为“商业发酵剂”组；用上述等量无菌生理盐水与肉混匀，成品即为“空白”对照组。
62.5、灌肠
63.选取质量良好的猪肠衣，用灌肠器将上述肉料灌入肠衣，灌好后用棉线扎成等长
度的肠体，并用针扎孔排气，做好标记。
64.6、发酵
65.将灌好的香肠放入培养箱，37℃发酵72h后得到发酵香肠。
66.二、发酵香肠的效果评价
67.(1)感官评价
68.取发酵香肠样品，放锅里蒸煮30min后，参照“牛雪峰.发酵火腿中产香葡萄球菌的筛选及在发酵香肠中的应用[d].哈尔滨商业大学，2020.”对肉样进行感官评定，评价指标包括外观、组织状态、色泽、质地、风味与口感等。评价标准见表1，评价结果见表2。
[0069]
表1发酵香肠感官评价标准
[0070][0071]
表2发酵香肠感官评价结果
[0072][0073]
注：不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)。下同。
[0074]
选出10人按表1进行发酵香肠的感官评价。结果如表2所示。发酵完成后，接种植物乳杆菌z43的“植物乳杆菌”组综合评分为8.41
±
0.25，“空白”对照组和“商业发酵剂”组分别仅为5.67
±
0.36和7.73
±
0.31，这说明植物乳杆菌z43发酵能够改善发酵香肠的感官品质。且接种植物乳杆菌z43组各项指标均显著好于“空白”对照组。与“空白”对照组相比，接种植物乳杆菌z43组发酵香肠肠体饱满，色泽更加鲜亮，组织更加紧密，切片性更好，酸味、咸味适中，滋味鲜美，香气柔和，回味较好，有弹性，咀嚼性好。与“商业发酵剂”组相比，接种植物乳杆菌z43组的风味与口感更优。说明植物乳杆菌z43可以有效改善发酵香肠风味、口
感以及品质。
[0075]
(2)发酵香肠ph值的测定
[0076]
用ph计直接插入发酵香肠进行测定。结果如图2所示。在发酵1天，各组ph值均显著下降，接种植物乳杆菌z43的“植物乳杆菌”组下降最多至5.08
±
0.06，说明加入本发明冻干菌粉直投式发酵剂可以使发酵香肠产品ph值迅速下降，从而抑制有害微生物生长。在发酵过程中，接种植物乳杆菌z43明显降低了发酵香肠的ph值，这不仅利于抑制腐败微生物生长，还可以促进香肠形成良好风味，提高发酵香肠产品的安全性。
[0077]
(3)测定发酵香肠挥发性盐基氮。根据gb 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》测定挥发性盐基氮。结果如图3所示。在发酵过程中，各组挥发性盐基氮值均上升，但植物乳杆菌组上升较缓慢，且总是显著低于商业发酵剂组和空白组。在发酵结束时，接种植物乳杆菌z43的“植物乳杆菌”组挥发性盐基氮含量为27.711
±
0.603mg/100g，显著低于“商业发酵剂”组和“空白”对照组。说明加入植物乳杆菌z43能显著延缓发酵香肠腐败速度，从而提高产品安全性，延长货架期。
[0078]
(4)发酵香肠中乳酸菌数测定
[0079]
根据gb 4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物检验乳酸菌检验》中的检测方法测定。结果如图4所示。在发酵过程中，各组乳酸菌数均显著上升，接种植物乳杆菌z43的“植物乳杆菌”组乳酸菌数最高。发酵结束时，“植物乳杆菌”组的活菌数对数值达到8.32lg cfu/g，说明接种的植物乳杆菌z43能够适应发酵香肠的生态条件，生长良好，从而保证了产品质量。
[0080]
(5)发酵香肠中肠杆菌测定
[0081]
根据gb4789.41—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验》中的方法进行测定。结果如图5所示。0天时，肉中含有肠杆菌数相近，约为3.7lg cfu/g。在发酵过程中，“植物乳杆菌”组和“商业发酵剂”组，肠杆菌数明显下降，说明接种的发酵剂抑制了肠杆菌的生长。在发酵结束后，接种植物乳杆菌的“植物乳杆菌”组肠杆菌数降至1.46lg cfu/g，“商业发酵剂”组降至2.56lg cfu/g，而“空白”对照组肠杆菌数在发酵过程中显著上升，发酵结束时肠杆菌数为7.13lg cfu/g。接种本发明植物乳杆菌z-43的冻干菌粉直投式发酵剂，肠杆菌数显著下降，这大大降低了食品安全的风险，同时也保障了产品质量。
[0082]
实施例4、植物乳杆菌z-43的冻干菌粉直投式发酵剂发酵香肠风味成分分析
[0083]
将盐15g、糖15g、味精3g、肉制品护色剂2g、十三香2.5g、淀粉4g溶于10ml无菌水中，然后再与1kg肉混匀。
[0084]
将植物乳杆菌z-43的冻干菌粉直投式发酵剂(107cfu/g肉)用适量无菌生理盐水(5ml/kg肉)混合后，与拌入调味料的肉混匀，灌入肠衣，37℃发酵72h后得到发酵香肠。
[0085]
将发酵0天和3天的样品保存于-80℃，采用风味分析仪对发酵香肠进行挥发性风味物质测定。香肠取2g置于20ml顶空瓶中，60℃孵育15分钟后进样。气相-离子迁移谱单元条件为：分析时间30min；色谱柱类型：mxt-wax，柱长30m，内径0.53mm，膜厚1.0μm(美国restek公司)；柱温60℃；载气n2；ims温度45℃。自动顶空进样单元条件为：进样体积200μl；孵育时间15min；孵育温度60℃；进样针温度85℃；孵化转速500rpm。结果见图6，其中图中每一行为一种样品，图中每一列为同一迁移时间下挥发性有机物组分信号峰。颜色越深表示含量越高。结果表明，植物乳杆菌z43直投式功能发酵剂发酵香肠共检出44种挥
发性风味物质。其中醇类11种(丁醇、乙醇、2-丙醇单聚体、2-丙醇二聚体、3-甲基-3-丁烯-1-醇单聚体、3-甲基-3-丁烯-1-醇二聚体、叔丁醇、3-甲基-1-丁醇单聚体、3-甲基-1-丁醇二聚体、1-丙醇单聚体、1-丙醇二聚体)；醛类12种(乙醛、丙醛单聚体、丙醛二聚体、3-甲基丁醛、戊醛、2-甲基丁醛单聚体、2-甲基丁醛二聚体、己醛单聚体、庚醛、3-甲基-2-丁烯醛、2-甲基丙醛单聚体、2-甲基丙醛二聚体)；酯类8种(乳酸乙酯、乙酸甲酯单聚体、乙酸甲酯二聚体、乙酸乙酯单聚体、乙酸乙酯二聚体、乙酸丁酯、3-甲基丁酸乙酯单聚体、巴豆酸乙酯)；烯烃类4种(α-萜品烯、柠檬烯单聚体、柠檬烯二聚体、β-罗勒烯、)；酸类2种(乙酸单聚体、乙酸二聚体)；醚类1种(二甲基硫醚)；酮类6种(丙酮、丁酮单聚体、丁酮二聚体、2,3-丁二酮、乙偶姻单聚体、乙偶姻二聚体)。其中乙偶姻、2,3-丁二酮具有黄油味、奶油味，乙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸丁酯、丁醇具有水果香气，2-甲基丙醛、3-甲基-1-丁醇、3-甲基丁醛、戊醛具有麦芽香气，己醛、庚醛具有油脂香气，2-甲基丁醛具有可可香气。本发明植物乳杆菌z-43的冻干菌粉直投式发酵剂适合低盐发酵香肠的生产，以该发酵剂生产低盐发酵香肠，发酵周期短，挥发性盐基氮明显低于同期生产的未添加发酵剂以及添加商业发酵剂的产品，且酸味、咸味适中，滋味鲜美，香气柔和，回味较好，有弹性，咀嚼性好，具有良好的发酵风味和感官特性，其香气成分主要为：乙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁醛、乙偶姻、2,3-丁二酮、2-甲基丁醛、3-甲基-1-丁醇、戊醛。
[0086]
本发明的植物乳杆菌z43筛选自风干广味肠，来源于发酵肉制品，安全性高，适应香肠发酵环境。不仅满足肉品发酵剂的基本标准，还能产生抑菌物质，抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌的生长。
[0087]
本发明应用一株分离自风干广味肠的具有抑菌功能的植物乳杆菌单菌种发酵香肠，降低产品含盐量，缩短生产周期，改善发酵香肠的品质，且有效抑制产品挥发性盐基氮的产生，提升产品安全性。
[0088]
利用本发明的植物乳杆菌制备单菌种直投式功能发酵剂，生产低盐发酵香肠，风味、感官品质优于自然发酵香肠和商业发酵剂发酵香肠，并且生产周期短，同时能够有效抑制挥发性盐基氮的产生，质量安全、稳定。
[0089]
用本发明植物乳杆菌z43的冻干菌粉直投式发酵剂制备发酵香肠，具有广阔的应用前景。
[0090]
目前，本发明的技术方案已经进行了中试，即产品在大规模量产前的小规模实验；中试完成后，在小范围内开展了用户使用调研，调研结果表明用户满意度较高；现在已经着手准备产品正式投产进行产业化(包括知识产权风险预警调研)。
[0091]
以上所述实施方式为本发明的优选实施例，而非本发明可行实施的穷举。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，做出的各种改进，都应当被认为包含在本发明的保护范围内。