重组幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶突变体及应用的制作方法

1.本发明涉及一种蛋白突变体，属于多肽技术领域。


背景技术：

2.糖基化是碳水化合物与目标分子（通常为蛋白质和脂质）共价连接的过程，蛋白质分子的糖基化是最丰富的翻译后修饰之一。这种修饰具有多种功能，例如，参与蛋白质分子的正确折叠， 调节蛋白质的热力学和动力学稳定性，参与分子间相互作用和细胞间粘附，参与免疫识别或者免疫逃逸。与dna转录或蛋白质翻译不同，蛋白质的糖基化过程没有模板，是一种是酶促反应，供体分子通常是一种活化的核苷酸糖，在糖基转移酶的作用下，对受体位点（羟基或其它官能团）进行特异的糖缀合物的反应。岩藻糖作为糖蛋白中糖链的组成部分，广泛存在于各类细胞表面的质膜上。岩藻糖基转移酶是将l-岩藻糖从gdp-岩藻糖（鸟苷二磷酸岩藻糖）供体底物转移到受体底物的酶。据目前的各种文献报道，岩藻糖基转移酶的主要供体底物都是分子量比较小的gdp-岩藻糖（gdp-fucose）。原核生物的岩藻糖基转移酶，目前经过验证的主要来自幽门螺杆菌（helicobacter pylori），包括6条序列（uniprot：http://www.cazy.org/gt10.html）。
3.细胞表面的分子决定了细胞如何与其它细胞以及周围环境相互作用。肿瘤的治疗性抗体例如抗-cd20, 抗-vegfr等通过结合t淋巴细胞和nk细胞表面的fcgr，同时结合肿瘤细胞表面的抗原，使得t和nk细胞发挥肿瘤杀伤作用（adcc）。受其启发，肿瘤免疫疗法近年来有了突变进展 —— 嵌合抗原受体t细胞免疫疗法， chimeric antigen receptor t-cell immunotherapy （car-t），其中kymriah是第一款被美国批准用于治疗b细胞前体急性淋巴细胞白血病。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，用生物技术把辨识癌细胞表面cd19抗原的car基因插到t细胞膜表面上，直接识别肿瘤细胞，激活t细胞进行肿瘤杀伤。但car-t的技术工艺复杂，价格昂贵。类似car-t这样的细胞工程的主要技术挑战是在不干扰细胞内源性功能的情况下赋予被操纵细胞新的特性。作为目前最常见和最稳健的细胞工程方法，首先受到技术复杂性和安全问题的限制，如原代细胞病毒转导效率的再现性不一致、car基因的异质表达水平，以及内源性基因被破坏的可能性。因此，使用化学生物学工具直接修饰细胞表面已成为细胞治疗的一种补充和普遍适用的方法，其中包括bertozzi等人开发的代谢寡糖修饰法（moe）和细菌转肽酶sortases催化的转肽反应。（stephan,等.nano today 2011, 6, 309
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325.；griffin等. cell chem. biol. 2016, 23, 108
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121. ；hudak等 chem. biol. 2014, 21, 16
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37. ；bi, x等. engineering. chem.
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eur. j. 2018, 24, 8042
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8050.））此外，wu等利用幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶成功地将抗体类大分子蛋白转移到细胞膜表面的多糖上例如lacnac和α2,3 sialyl lacnac。利用这种技术，wu等构建了两种类型的工程细胞
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使用自然杀伤细胞系（nk-92mi）和小鼠原代cd8
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ot-1t细胞，通过岩藻糖基转移酶将her2抗体和pd-l1的抗体分别转移至nk-92mi和cd8
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ot-1t细胞，并在小鼠模型中展示了特异性肿瘤靶向性和对抗肿瘤细胞产生的抑制信号（参见li j,等. acs cent sci. 2018 dec 26;4(12):1633-1641. ）。因此利用岩藻糖基转移酶将与供体底物相
结合的目的分子标记到携带有受体底物的目的细胞将使得诸如car-t这样的细胞治疗的效果得到大幅提升。
4.糖苷转移酶(glycotransferase)能够在中性条件下，尤其是哺乳细胞无损伤的反应条件下作用，对于细胞学工程是一个无以比拟的长处。但是无论是细菌来源的还是人源的岩藻糖基转移酶对于大分子的供体底物的酶活性并不好。本发明人在研究中发现，相比小分子gdp-fucose而言，岩藻糖基转移酶对于大分子的供体底物的酶活性降低近千倍，不能满足临床治疗的需求。因此，本发明的目的就是提供一种对于大分子的供体底物转移具有优异酶活性的岩藻糖基转移酶突变体。


技术实现要素：

5.基于上述目的，本发明首先提供了一种幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶的突变体，所述突变体为序列如seq id no. 15所示的野生型幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶去除包括435-476位氨基酸残基的疏水末端，以及逐一去除365-434位氨基酸残基的tandem 重复单位d-d-l-r-v-n-y直至第405位氨基酸形成的突变体。
6.在一个优选的实施方案中，所述突变体的氨基酸序列如seq id no. 1、3、5、7、9 、11或13所示。
7.其次，本发明提供了一种上述重组岩藻糖基转移酶突变体的多核苷酸，所述多核苷酸的序列如seq id no. 2、4、6、8、10、12或14所示。
8.第三，本发明提供了一种含有上述多核苷酸的表达载体。
9.第四，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。
10.在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
11.第五，本发明提供了一种应用上述的重组岩藻糖基转移酶突变体将靶分子标记于目的细胞或者目的蛋白质的方法，所述方法包括：（1）将供体底物与靶分子相缀合获得连接复合物；（2）在所述的重组岩藻糖基转移酶突变体存在的条件下，使步骤（1）获得的连接复合物与含有glcnac受体分子的目的细胞或者目的蛋白质一起孵育，获得被标记了靶分子的目的细胞。
12.在一个优选的实施方案中，所述供体底物的分子量为500d 至150kd的gdp-fucose-(peg4)n，所述n为0-10的整数。
13.在一个更为优选的实施方案中，所述靶分子为igg，所述n=2。
14.第六，本发明提供了一种根据上述方法标记的细胞或者蛋白质。
15.最后，本发明提供了上述的细胞或者蛋白质在制备疾病治疗药物中的应用。
16.在一个优选的实施方案中，所述疾病为肿瘤、炎症性疾病、代谢类疾病或需要酶替代治疗的罕见病。
17.本发明对幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶的特定位点和片段进行替换、增减、或删除后，改变岩藻糖基转移活性，对于含有鸟苷二磷酸岩藻糖(gdp-fucose)的抗体作为供体分子时，酶活性提高了数十倍。本发明显示利用重组的突变体fuctd可以将分子量500d （例如gdp-fucose）至 150kd (例如gdp-fucose-免疫球蛋白)的供体分子，催化转移到含有glcnac的受体分子上，例如将gdp-fucose-(peg4)n-igg有效地转移至hek293细胞表面。利
用这种方法，不仅可以使得细胞迅速获取新的细胞表面信号分子，通过和效应细胞相互作用，用于激活或者抑制，例如t细胞表面偶联pd-l1的抗体用于拮抗肿瘤细胞传递给t细胞的抑制作用；也可以通过nk细胞表面偶联肿瘤相关抗原（taas）的抗体，例如抗her2，efgr，vegfr，cd19等加强nk细胞的靶向性、提高抗肿瘤的效果。此外，还可以通过偶联一种或者数种肿瘤特异识别抗原，改善car-t的靶向性，减少car-t的脱靶副作用。此外，还可以将代谢相关的酶偶联在血液细胞表面，例如尿酸氧化酶，清除血液和组织中的尿酸，治疗难治性痛风。
附图说明
18.图1. 重组幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶的突变体表达产物活性检测图；图2. 重组幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶的突变体fuctd的 液相色谱-质谱法鉴定；图3. 重组幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶的突变体以小分子为供体底物时km值的比较；图4. 重组幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶的突变体以大分子为供体底物时酶活性km的比较；图5.岩藻糖基转移酶的突变体催化的供体底物标记hek293的流式细胞术检测图。
具体实施方式
19.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
20.实施例1，alfa-1,3岩藻糖基转移酶变异体的制备幽门螺杆菌的alfa-1,3岩藻糖基转移酶(strain atcc 700392 / 26695) （fuct） 催化岩藻糖从供体gdp-岩藻糖到受体n-乙酰乳糖胺的糖基, 产生lewis x和lewis y表位抗原，以模拟胃上皮细胞的碳水化合物抗原，从而避免被宿主免疫系统检测到。fuct全长476个氨基酸（uniprotkb
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o25366），序列如seq id no. 15所示，365-434是由10个连续的7个氨基酸组成的重复片段d-d-l-r-v-n-y，435-476是一段疏水的氨基酸。 文献报道，fuct的c末端的80个氨基酸残基都可以删除掉，在结构和酶活性上没有明显变化[ref 2006-carboxyl terminus of helicobacter pylori r1,3-fucosyltransferase determines the structure and stability]，但在大肠杆菌e.coli中的表达量却明显升高了。我们尝试表达时，首先去除了疏水末端包括435-478位（fuct-dm），随后逐一去除tandem repeat of d-d-l-r-v-n-y，直至第405位氨基酸，形成如下截短体，fuct-d m（序列如seq id no. 1所示，核苷酸序列如seq id no. 2所示）,fuct-d1r（序列如seq id no. 3所示，核苷酸序列如seq id no. 4所示）, fuct-d2r（序列如seq id no. 5所示，核苷酸序列如seq id no. 6所示）, fuct-d3r（序列如 seq id no. 7所示，核苷酸序列如seq id no. 8所示）, fuct-d4r（序列如seq id no. 9所示，核苷酸序列如seq id no. 10所示）, fuct-d5r（序列如seq id no. 11所示，核苷酸序列如seq id no. 12所示）, fuctd（序列如seq id no. 13所示，核苷酸序列如seq id no. 14所示）。这7个截短体分别在ecoli中进行表达，纯化，具体步骤
如下文所述。
[0021]
1. 质粒制备委托苏州君跻生物科技有限公司合成质粒dna，并克隆至载体pet41a（milliporesigma
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pet-41a(+) dna vector，目录号：70-556-3）上，分别用于表达fuct-dm、fuct-d1r、fuct-d2r、fuct-d3r、fuct-d4r、fuct-d5r、fuctd重组蛋白，构建成表达质粒fuct-dm-pet41a、fuct-d1r-pet41a、fuct-d2r-pet41a、fuct-d3r-pet41a、fuct-d4r-pet41a、fuct-d5r-pet41a、fuctd-pet41a。具体操作方法参照《分子克隆实验指南》，质粒先转化dh10b、测序、保菌和菌液培养。按照《qiagen mini-prep kit》和《qiagen endofree maxi-prep kit》提到的操作方法，进行质粒的制备。
[0022]
2.fuct的截短体蛋白表达：2.1 转化bl21(de3)2.1.1 取2 ul质粒加入100 ul bl21(de3)感受态细胞中（(thermofisher, 目录号:ec0114），立即混匀，冰上放置30 min；2.1.2 42℃热激90 s，迅速冰浴2 min；2.1.3 加入500 ul lb培养基，37℃，rpm《=200振荡培养60 min；2.1.4 6000rpm离心1min，弃去大部分上清，留约100-150 ul，重悬菌体后，涂于含amp的lb平板上，37℃过夜培养。
[0023]
2.2 小量表达2.2.1 保菌：挑取1个单克隆于1 ml amp抗性的lb培养基中，37 ℃，220 rpm振荡培养约5h，加入1ml 40%甘油，分装2管，冻存于-80℃；2.2.2 在上一步管中加入2.5ml 含amp的lb液体培养基，37 ℃，220 rpm振荡培养过夜；2.2.3 将过夜培养的菌液按1:50比例转接到20ml含amp的lb培养基中，37℃，220 rpm，培养至od
600
=0.6 (约3h)，加入终浓度0.5mm iptg，37℃，220 rpm培养3h；2.3 sds-page鉴定表达量2.3.1 测定培养液的od
600
，取10od菌液，10000rpm，2min离心，去掉上清；2.3.2 用1 ml 裂解液 (10mm tris-hcl, ph 8.0)重悬菌体，置于冰上进行超声裂解细胞，超声条件：130w、4min、on 3s、off 3s；2.4 纯化超声结束后，裂解液12000rpm, 10min离心得到上清(lysis supernatant)；将上清液在4
°
c下以125000g超速离心。根据使用手册，将上清液应用于hitrap螯合hp柱，并用20mm咪唑溶液进行洗脱。将洗脱液汇集并通过透析将溶剂更换为50 mm tris缓冲液（ph 8.0），然后再经过凝胶过滤层析（superdex200，ge healthcare）进行进一步纯化得到纯度较高的蛋白，产生具有98%以上均一性的蛋白质。以牛血清白蛋白为标准，使用基于bradford法的bio-rad蛋白质分析试剂盒测定蛋白质浓度。
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图1显示了 fuct的6种截短体，经过纯化后，按照《分子克隆实验指南》描述的方法进行sds-page分析的图谱。 80ul 经过纯化的重组蛋白分别加入20ul 5
×
reduce loading buffer，95 ℃加热5 min，每个样品取12.5ul(0.1od)进行sds-page电泳。
[0025]
图2为液相色谱-质谱(lc-ms)法鉴定fuctd。fuctd的理论分子量为48555 delton，
fuctd-his
×
6, fut6-mut6, fut6-mut17，在4度或者室温下，孵育20
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30分钟后，用cpda-1（citrate phosphate dextrose adenine）清洗细胞两次。利用流式细胞仪和针对igg的荧光抗体分析细胞标记的效率，结果显示，在30分钟内，超过90%的细胞被有效地标记了igg。
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在100万hek293活细胞中加入供体底物gdp-fucose-(peg4)n-igg，并加入岩藻糖转移酶fuctd，在室温下孵育30分钟后对细胞进行检测。没有进行处理的hek293细胞（mock）作为阴性对照，同时转染了higg和migg的hek293细胞作为阳性对照（hek transfected w/ surface-higg and surface-migg）。用anti-human igg二抗检测higg在细胞表面的呈现，用anti-mouse igg二抗检测migg在细胞表面的呈现。 结果显示在岩藻糖转移酶fuctd的作用下，供体底物gdp-fucose-(peg4)n-igg转移至hek293细胞表面，并能够被anti-higg二抗识别（参见图5）。