硝酸根转运蛋白及其编码基因在提高作物毛状根根瘤数量上的应用

1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种是一种硝酸根转运蛋白及其编码基因在提高作物毛状根根瘤数量上的应用，从而提高作物的结瘤固氮能力。


背景技术：

2.植物主要通过3种方式从自然界中获取所需的氮源：将吸收的no
3-还原为有机氮，直接吸收利用土壤中的铵或有机氮，或通过固氮菌固定空气中的n2并转化为植物可利用的形式。
3.对于大多数非豆科植物，no
3-是最主要的氮素利用形式。植物为了适应土壤中氮素的变化，进化出了低亲和转运体系（lats）和高亲和转运体系（hats）两套转运系统。nrt1.5是一种定位于质膜中的低亲和双向转运蛋白，在靠近木质部的中柱鞘细胞中表达。降低或抑制nrt1.5的表达会减少硝酸盐从根部到茎部的运输，这表明nrt1.5参与了根木质部中硝酸盐的运输。豆科植物和根瘤菌在长期进化过程中建立了良好的共生关系，豆科植物通过形成独特的根瘤结构进行共生固氮。在农业生产中，高效率的共生固氮体系可以为大豆提供生长发育所需总氮素的50%-60%。
4.根瘤菌-豆科植物共生固氮体系是自然界中十分高效的氮素利用系统，解析该体系的运作模式一直都是科学研究中的热点与难点，通过鉴定大豆结瘤及共生固氮中的功能基因，对增强豆科植物特别是重要粮油经济作物大豆的共生固氮能力具有重要意义。同时也对生产中减少氮肥施用量增加大豆产量提供了更大的可能。
5.目前的研究发现nrt1.5作为低亲和双向转运蛋白介导no
3-向木质部的装载及其向地上部的长距离运输，拟南芥中的研究结果显示nrt1.5也是一个k+/h+反向转运蛋白，直接参与细胞k+的外排。但是，目前尚未有其在提高豆科植物及作物根瘤数量方面的研究和报道。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种提高作物毛状根根瘤数量的方法。
7.为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
8.一种提高作物毛状根根瘤数量的方法，在植物体内过表达序列表中seq id no：1所示的核苷酸序列或者与seq id no：1具有同种功能的核苷酸序列，获得与野生植物相比毛状根上的根瘤数目增多的转基因植物。
9.作为本发明的一种优选技术方案，首先构建含有seq id no：1所示核苷酸序列的过表达载体，然后利用此过表达载体构建转化体，再利用所得转化体侵染受体植物根系，筛选阳性植株，获得与正常植物相比毛状根上的根瘤数目增多的转基因植物。
10.作为本发明的一种优选技术方案，所述过表达载体以pegad为骨架载体。
11.作为本发明的一种优选技术方案，所述过表达载体上连接有35s启动子。
12.作为本发明的一种优选技术方案，对seq id no：1所示的核苷酸序列进行pcr扩增时，其正向扩增引物如序列表中的seq id no：2所示，其反向扩增引物如序列表中的seq id no：3所示。
13.作为本发明的一种优选技术方案，利用所述过表达载体转化发根农杆菌k599获得转化体，然后再利用发根农杆菌k599介导的毛状根转化法获得转基因植物，筛选阳性植株得到与正常植物相比毛状根上的根瘤数目增多的转基因植物。
14.作为本发明的一种优选技术方案，所述目的植物为蝶形花科植物。
15.作为本发明的一种优选技术方案，所述目的植物为大豆。
16.seq id no：1所编码的蛋白及其在提高作物毛状根根瘤数目上的应用。
17.包含seq id no：1所示核苷酸序列的重组表达载体或重组菌及其在提高作物毛状根根瘤数目上的应用。
18.采用上述技术方案所产生的有益效果在于：经试验验证，利用本发明构建的过表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的毛状根根瘤数量，对于提高大豆的结瘤固氮能力和提高大豆产量具有重要的科研及实用意义。
附图说明
19.图1为35s::gmnrt1.5c与空载体的大豆毛状根转化植株根部的gmnrt1.5c相对表达量、结瘤表型与结瘤数目等相关的试验结果图。图中，a为在大豆gmnrt1.5c过表达与空载体转化毛状根材料中检测根中gmnrt1.5c的相对表达量；b为大豆gmnrt1.5c过表达与空载体转化毛状根材料的地下结瘤表型；图c为大豆gmnrt1.5c过表达与空载体转化毛状根材料根部结瘤数目的统计。
具体实施方式
20.以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
21.实施例1、基因本实施例涉及大豆gmnrt1.5c基因，其cdna阅读框的核苷酸序列如seq id no：1所示。与此基因对应的与seq id no：1完全互补配对的序列、在seq id no：1所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述cdna阅读框的碱基序列进行适当修改，也是本发明技术方案的一种体现方式。
22.实施例2、蛋白本实施例涉及与实施例1的核苷酸序列对应的蛋白。在不影响大豆gmnrt1.5c蛋白结构和活性的前提下，对大豆gmnrt1.5c蛋白的氨基酸序列进行各种取代、缺失或增加一个或多个氨基酸，或末端修饰，也是本发明技术方案的一种体现方式。
23.实施例3、基因序列的获取
大豆gmnrt1.5c基因的cdna阅读框可通过以下方法获得：以实验室的大豆品种williams 82为材料，提取其rna，反转录为cdna，根据已有的williams 82基因组序列设计引物克隆大豆中gmnrt1.5c基因cds，所述引物包括如seq id no：2所示的上游引物和seq id no：3所示的下游引物。利用dna高保真酶进行pcr扩增，pcr反应体系为：cdna模板：1 μl；前引物（f）：0.5 μl；后引物（r）：0.5 μl；buffer：15 μl；ddh2o：19 μl；dntp：5 μl总反应体系30 μl。反应条件：94
°
c：2 min，98
ꢀ°
c：20 s，56
ꢀ°
c：30 s，68
ꢀ°
c：2 min，68
ꢀ°
c：10 min，16
ꢀ°
c：∞；其中，98
ꢀ°
c：20 s，56
ꢀ°
c：30 s，68
ꢀ°
c：2 min三步设定38个循环。将30 μl pcr扩增产物进行1 ％的琼脂糖凝胶电泳分析。采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1791 bp左右的条带，所得gmnrt1.5c基因的cds序列如seq id no：1所示。
24.实施例4、大豆转基因毛状根的创制本实例提供一种gmnrt1.5c基因过表达的大豆转基因毛状根创制方法。具体操作步骤如下。
25.（1）发根农杆菌的转化，采用液氮冻融法转化农杆菌，具体操作如下：a.取出冻存的200 μl感受态细胞，融化后加入5-10 μl质粒dna，轻弹管壁混匀，冰上放20-30 min；b.放入液氮中5 min后取出，将管转入37℃融化5 min后，加入1 ml lb（无抗性）液体培养基，28℃低速振荡（150 r/min）1.5-2 h；c. 4000 r/min，30 sec，去上清，加100 μl lb液体培养基，悬浮菌体后涂板（含50 mg/ml卡那霉素和50 mg/ml链霉素）；d.置28℃培养至长出单克隆，用于毛状根的转化。
26.（2）发根农杆菌k599介导的毛状根转化：a.以大豆品种williams 82为材料，在蛭石中萌发72 h，待子叶刚要张开时，在子叶下端0.1-0.2 cm下胚轴处切开，浸在活化的农杆菌k599中侵染1 h（od
600 =0.8）；b.将外植体转至浸满1/10 ms培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.39%mes，0.044% murashige & skoog modified basal medium with gamborg vitamins（货号：m404），ph调至5.4）的滤纸上共培生长3-4天；c.毛状根长出愈伤后，将外植体移栽到蛭石中。
27.实施例5、大豆转基因毛状根材料的阳性鉴定本实例提供一种gmnrt1.5c基因过表达的大豆转基因毛状根材料的阳性鉴定方法。具体操作步骤如下。
28.（1）gmnrt1.5c转基因毛状根的根组织总dna提取：a.取植物组织0.1-0.2 g放到2 ml ep 管中，加入钢珠，液氮速冻后用打样机研磨至粉状。加入500 μl ctab，65℃ 放置30 min使其充分裂解；b.加入200 μl氯仿，剧烈震荡混匀后，11000 rpm离心15 min；c. 取上清于新的 1.5 ml ep管中，加入两倍体积无水乙醇，震荡混匀，-20℃ 放半小时以上后， 11000 rpm离心 15 min；d.去上清，离心，干燥，溶于 40 μl水中，4℃冰箱保存。以dna为模板，采用聚合酶链反应（pcr）对毛状根dna中bar基因的存在进行验证，并以相应空载体转化的毛状根为阴性对照。
29.bar基因的扩增引物如下：bar-f： ctacatcgagacaagcacggtcaa（seq id no：4）bar-r： agaaacccacgtcatgccagttc（seq id no：5）实施例6、大豆转基因毛状根材料的基因相对表达量本实例提供一种gmnrt1.5c基因过表达的大豆转基因毛状根材料的gmnrt1.5c基
因相对表达量测定方法。具体操作步骤如下。
30.（1）gmnrt1.5c转基因毛状根的根组织总rna提取：该过程中所涉及的ep管和枪头都是使用购买的rnase free的进口耗材。a. 植物组织液氮速冻研磨。取植物组织0.1-0.2 g放到2 ml ep管中，加入钢珠，于液氮中速冻，研磨至粉状；b. 加1 ml trizol试剂，震荡混匀，室温放置 5-10 min以利于核酸蛋白复合体的分离；c. 加入200 μl的氯仿，剧烈震荡15 s，室温静置2-3 min；d.4
°
c 12000 rpm 离心 10-15 min；e. 吸取上清于rnase free的1.5 ml ep管中，加入等体积的异丙醇（一般为 400-450 μl）；f. 轻柔混匀后，-20
°
c放半小时以上；g. 4
°
c， 12000 rpm离心10 min，弃上清，rna沉于管底；h. 加1 ml预冷的70%乙醇清洗沉淀，4
°
c，12000 rpm离心3-5 min；i. 弃上清，室温干燥，沉淀溶于20 μl depc h2o中；j. 电泳检测提取的 rna 是否完好。取1 μl rna，2 μl loading buffer，200 v电压电泳5 min，其余rna样品-80
°
c保存备用。
31.（2）反转录pcr：a. 在用depc处理过的200 μl pcr管中顺序加入5 μl rna，2 μl 5x gdna digester buffer，1 μl gdna digester，2 μl rnase free ddh2o，42℃温育2 min后迅速置于冰上冷却；b. 在上步反应的管中直接加2 x honor ii supermix plus（novogene公司出品）10 μl；c. 将上述反应液混匀，25℃反应5 min，42℃反应30 min，85℃反应5 min；d. 反应结束后，反应合成的cdna可用作qpcr反应模板。
32.（3）实时荧光定量pcr：按如下反应体系，混好体系，然后分装入96孔光学板中，并覆盖上专用光学膜。扩增使用的仪器为bio-rad公司的荧光定量pcr仪。
33.扩增程序为：95℃ 5 min；95℃ 10 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s，40 cycles；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，10 μl反应体系配制如下：2
×
sybr green mix 5 μl， forward primer（10 μm）0.2 μl，reverse primer（10 μm）0.2 μl，cdna 0.2 μl，ddh2o 4.4 μl。
34.gmnrt1.5c基因的定量引物序列如下：gmnrt1.5c-f：gccttgacatcgatagacttgatcgc（seq id no：6）gmnrt1.5c-r：gtctcatcaatctctccagttttgg（seq id no：7）结果如图1，表明通过创制gmnrt1.5c过表达的转基因大豆毛状根株系显著上调了gmnrt1.5c的相对表达水平。在完全相同的实验环境下，同空载体转化的转基因根系（ev）相比，上调表达gmnrt1.5c的转基因大豆毛状根株系根瘤数目明显增多。说明上调表达gmnrt1.5c基因能有效增强大豆结瘤固氮的能力。
35.以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。