能够回收发酵液中乳酸菌的发酵柱及发酵罐和发酵方法

能够回收发酵液中乳酸菌的发酵柱及发酵罐和发酵方法
1.技术领域：本发明属于食品微生物发酵技术领域，具体是一种能够回收发酵液中乳酸菌的发酵柱及其发酵罐和发酵方法。
2.技术背景：石榴汁乳酸菌饮料具有独特的风味与保健效果。目前石榴汁乳酸菌饮料发酵工艺主要是传统的菌种直投式发酵方法，即将乳酸菌种按照一定比例投入到石榴汁中进行厌氧发酵。
3.菌种直投式发酵方法在生产中存在一定的缺陷，投入的菌种无法回收重复利用，但乳酸菌种格较为昂贵，因此石榴汁乳酸菌发酵饮料的生产成本较高。
4.目前可回收菌种的发酵设备不多，适合石榴汁发酵液的也没有。
5.

技术实现要素：
本发明的目的是提供一种可回收乳酸菌菌种的方法，菌种可多次重复利用，降低石榴汁乳酸菌发酵饮料的生产成本。
6.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明能够回收发酵液中乳酸菌的发酵柱，包括，发酵柱，为空心的筒状结构，顶部为开口，底部为封闭端，筒状结构的表面布满通气孔；半透膜，内部包裹菌种发酵液，半透膜的孔径限制乳酸菌的自由进出，半透膜包裹菌种发酵液后放置到发酵柱的空心结构中；封闭塞，将发酵柱的顶部开口堵塞，封闭塞的中部设有通气通道，通气通道内设有单向密封结构，通气通道联通半透膜包裹内结构与外部自然空气。
7.作为优选，该半透膜为袋状，是一种透析膜材料制作，顶部开口一种向外套在发酵柱的开口边缘上，封闭塞塞入半透膜的顶部开口中。
8.进一步的优选，封闭塞为具有弹性的食品级硅胶材质，通气通道连接有单向密封结构，单向密封结构为u形管，u形管的联通通气通道的进气口和出气口，u形管内灌有封闭液，发酵气体从袋状的半透膜中扩散到外部自然空气中，反之密封。
9.进一步的优选，发酵柱为食品级不锈钢材质制作，柱体上设有固定件，固定用于柱体与放置该发酵柱的发酵设备之间的固定。
10.本发明设有发酵柱的发酵罐，该发酵罐为食品级不锈钢材质制作的罐体，顶部开口放置该发酵柱，发酵柱与罐体内设有固定结构，固定结构将发酵柱固定在罐体内不移动，罐体内为石榴汁。
11.作为发酵罐结构的优选，固定结构为铷磁铁，发酵柱的内部底端和发酵罐内的底部分别设有一组铷磁铁，发酵柱放入发酵罐中后两组铷磁铁吸引固定，将发酵柱固定在发酵罐中，发酵柱顶部的封闭塞上方设有密封盖，密封盖将发酵罐的顶部开口完全密封，密封盖的顶部开口连接所述的u形管。
12.本发明使用发酵罐进行石榴汁发酵的方法，包括以下步骤，（1）培育植物乳酸菌菌种，在无菌台上，挑取生长饱满的单菌落至无菌的肉汤培养基中培养，培养条件为37℃、48 h、静置厌氧培养，培养完毕，在无菌台上弃去培养液的上层澄清液体，并离心富集培养液下部菌体沉淀，使用无菌水重悬洗涤菌体并离心收集，离心条件为室温、3000 rpm
.
min-1
、5 min，重复洗涤菌体三次，尽去除培养基成分，最终对弃去上清液的植物乳杆菌菌体进行称重，最终获得大量植物乳杆菌种；（2）发酵罐杀菌，将发酵罐内部清洗干净，向发酵罐内倒入食用酒精进行杀菌，杀菌后将发酵罐内酒精抽出，倒入无菌水进行冲洗数次，直至罐内没有酒精味道，至此发酵罐内杀菌清洗过程结束；（3）石榴汁装罐将新鲜的石榴籽粒剥出，使用干净的纱布榨取石榴籽粒中的石榴汁，同时确保石榴种子不能破损，使用食品级na2co3调整石榴汁ph至7.5~8.0范围，随后加热石榴汁至微微沸腾，撇去浮沫，趁热装入发酵罐内，发酵罐内要置留出十分之一的空间，随后适当密封发酵罐，待石榴汁降温至37℃时方可进行下一步操作；（4）启动发酵加入离心过的植物乳杆菌菌体，菌体添加量以发酵液重量的1
‰
为准，随后加入透析袋三分之一体积的无菌水，并将透析袋固定在发酵柱内部，最终将发酵柱缓慢的放入发酵罐中，此时透析袋中多余的气体会通过发酵柱通气管道缓慢排出，发酵罐液面不可没过发酵柱通气管道下部，最后组装发酵罐的其余零部件，包括密封盖、通气管道所连的u形管，管内需添加适量体积的惰性液体，至此石榴汁植物乳杆菌发酵正式启动。
13.（5）发酵控制，在发酵过程中，发酵温度控制在18-20℃，避光，厌氧发酵，罐中发酵时间为20天，发酵结束检测不同发酵罐发酵液的ph值、甜度、乳酸菌数量、色泽以及感官测评，获得石榴汁发酵液；（6）产品灌装与贮藏发酵结束后，将产品转入无菌容器，并于4℃条件下避光密封保存，进行无菌灌装即可出品；（7）发酵柱中乳酸菌回收及再利用，当发酵罐内的石榴汁发酵完毕时，可将发酵柱部分拆卸至另一个石榴汁发酵罐内继续发酵，达到乳酸菌回收再利用。
14.作为石榴汁发酵的方法的优选，发酵柱中半透明为md77透析袋，裁剪底部封口的md77透析袋，裁剪长度长度与发酵柱高度相一致，放入蒸馏水中煮沸1 h充分杀菌，在无菌条件下取出再使用。
15.作为石榴汁发酵的方法的优选，步骤1）培育植物乳酸菌菌种，在无菌台上，用接种环挑取植物乳杆菌，放入细菌培养箱倒置培养，并在mrs琼脂培养基平板上划线。，使用parafilm封口膜封板，培养条件为37℃、48 h、静置厌氧培养，然后挑取生长饱满的单菌落至无菌的mrs肉汤培养基中培养。
16.作为石榴汁发酵的方法的优选步骤2）发酵罐杀菌，向发酵罐内倒入食用酒精，酒精浓度为75%，酒精液面要完全没过罐口，同时密封
罐口，室温下静置72 h，完成发酵罐杀菌过程，将发酵罐内酒精抽出，倒入无菌水进行冲洗数次，直至罐内没有酒精味道，取出发酵柱结构并放置在无菌环境下以备用。
17.本发明研发出的可回收乳酸菌种发酵柱及发酵罐和发酵方法，将乳酸菌种加入到一端封口的透析袋中，并将部分透析袋没入石榴汁中，通过一定的方式对透析袋进行固定，使其在石榴汁中悬空。随着发酵进行，石榴汁缓慢渗透入透析袋中，随后乳酸菌对透析袋内石榴汁中有效成分进行厌氧发酵，发酵产物通过自由扩散方式透过透析袋进入外侧发酵液，而乳酸菌却不能自由进出透析袋。该方法把乳酸菌种限制在透析袋内。发酵结束时，将乳酸菌种加入到一端封口的透析袋中，并将部分透析袋没入石榴汁中，通过一定的方式对透析袋进行固定，使其在石榴汁中悬空。可以将发酵罐中的透析袋转入新的发酵罐，从而实现乳酸菌重复利用，降低生产成本。
附图说明
18.图1是本发明的发酵柱的结构图，图2是本发明的发酵罐的结构图。
19.附图标记：1、发酵柱，2、通气孔，3、半透膜，4、菌种发酵液，5、封闭塞，6、通气通道，7、u形管，8、封闭液，9、发酵罐，10发酵柱内铷磁铁，11、密封盖，12、空气滤口，13、罐内铷磁铁。
具体实施方式
20.下面对本发明的具体内容进行详细的说明：本发明能够回收发酵液中乳酸菌的发酵柱，结构如图1所示，包括发酵柱1、半透膜3和封闭塞5。
21.发酵柱1如图1所示，为空心的筒状结构，顶部为开口，底部为封闭端，筒状结构的表面布满通气孔2；半透膜3内部包裹菌种发酵液4，半透膜3的孔径限制乳酸菌的自由进出，半透膜3包裹菌种发酵液4后放置到发酵柱1的空心结构中，开口朝上；封闭塞5将发酵柱1的顶部开口堵塞，封闭塞5的中部设有通气通道6，通气通道6设有单向密封结构，通气通道6联通半透膜3包裹内结构与外部自然空气。
22.半透膜3为袋状，是一种透析膜材料制作，顶部开口一种向外套在发酵柱1的开口边缘上，封闭塞5塞入半透膜3的顶部开口中。半透膜可以将石榴汁发酵过程中的乳酸菌与发酵液隔离，发酵结束后可以回收乳酸菌种，本发明封闭塞5为具有弹性的食品级硅胶材质，通气通道6连接有单向密封结构，单向密封结构为u形管7，u形管7一端连接通气通道6的出气口，另一端设有空气滤口12，u形管7内灌有封闭液8，发酵气体从袋状的半透膜3中扩散到外部自然空气中，反之密封。
23.塑料活塞为具备一定弹性，可牢牢固定透析袋，在塑料活塞的中心部位通气通道6为不锈钢材质的直径2 mm的细管道，透析袋中的发酵气体可以通过细管道快速的排出，使得发酵柱内外气压平衡，避免透析袋内气体产量过多而导致透析袋胀气。
24.发酵柱1为食品级不锈钢材质制作，柱体上设有固定件，固定用于柱体与放置该发酵柱的发酵设备之间的固定。
25.本发明发酵柱的发酵罐9，结构如图2所示，该发酵罐9为食品级不锈钢材质制作的
罐体，顶部开口放置该发酵柱，发酵柱与罐体内设有固定结构，固定结构将发酵柱固定在罐体内不移动，罐体内为石榴汁。
26.固定结构为铷磁铁10，发酵柱1的内部底端和发酵罐9内的底部分别设有一组铷磁铁10，发酵柱1放入发酵罐9中后两组铷磁铁10吸引固定，将发酵柱1固定在发酵罐9中，发酵柱顶部的封闭塞5上方设有密封盖11，密封盖11将发酵罐9的顶部开口完全密封，密封盖11的顶部开口连接所述的u形管7。u形管装置可保证气体单向流动，同时防止倒吸，空气滤口可保证外部微生物不会进入u形管装置，从而保证整个发酵装置的安全性。
27.发酵柱与发酵罐之间通过铷磁铁相连接，当发酵罐内的石榴汁发酵完毕时，可将发酵柱拆卸至另一个石榴汁发酵罐内继续发酵。铷磁铁外侧由一层食品级不锈钢材质包裹，可最大限度的避免污染发酵液环境。
28.使用上述的发酵主体和发酵罐进行石榴汁发酵的方法，三个具体操作实施例，实施例1生产材料：新鲜成熟甜石榴、纱布、植物乳杆菌菌种（lactobacillus plantarum）（大连亚芯生物科技有限公司）、md77透析袋（mw:8000-14000）、mrs肉汤培养基与mrs琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司）、无菌蒸馏水、食用酒精、食品级na2co3。
29.生产装置：如图1的发酵柱和如图2的发酵罐。
30.生产方案：（1）培育植物乳酸菌菌种在无菌台上，用接种环挑取植物乳杆菌，并在mrs琼脂培养基平板上划线。使用parafilm封口膜封板，放入细菌培养箱倒置培养，培养条件为37℃、48 h、静置厌氧培养。
31.在无菌台上，挑取生长饱满的单菌落至无菌的mrs肉汤培养基中培养，培养条件为37℃、48 h、静置厌氧培养。培养完毕，在无菌台上弃去培养液的上层澄清液体，并离心富集培养液下部菌体沉淀，使用无菌水重悬洗涤菌体并离心收集，离心条件为室温、3000 rpm
.
min-1
、5 min。重复洗涤菌体三次，尽量去除培养基成分，最终对弃去上清液的植物乳杆菌菌体进行称重，最终获得大量植物乳杆菌种。
32.（2）发酵罐杀菌将发酵罐内部组件清洗干净并组装（此时半透膜不可以固定在发酵罐内），向发酵罐内倒入食用酒精（酒精浓度为75%），酒精液面要完全没过罐口，同时密封罐口。室温下静置72 h，完成发酵罐杀菌过程。将发酵罐内酒精抽出，倒入无菌水进行冲洗数次，直至罐内没有酒精味道，取出发酵柱结构并放置在无菌环境下以备用，至此发酵罐内杀菌清洗过程结束。
33.（3）石榴汁装罐将新鲜的石榴籽粒剥出，使用干净的纱布榨取石榴籽粒中的石榴汁，同时确保石榴种子不能破损，否则种子内容物流出会让石榴汁发酵过程产生异味。使用食品级na2co3调整石榴汁ph至7.5~8.0范围，随后加热石榴汁至微微沸腾，撇去浮沫，趁热装入发酵罐内，发酵罐内要置留出十分之一的空间，随后适当密封发酵罐，待石榴汁降温至37℃时方可进行下一步操作。
34.（5）启动发酵向发酵罐石榴汁中直接投入发酵液质量1
‰
的植物乳杆菌菌体并搅拌均匀，随即组装发酵罐进行发酵（发酵柱装置不参与组装过程），该发酵方式为直投式乳酸菌发酵。
35.裁剪底部封口的md77透析袋，裁剪长度长度与发酵柱高度相一致，放入蒸馏水中煮沸1 h充分杀菌。在无菌条件下取出，加入离心过的植物乳杆菌菌体，菌体添加量以发酵液重量的1
‰
为准。随后加入透析袋三分之一体积的无菌水，并将透析袋固定在发酵柱内部。最终将发酵柱缓慢的放入发酵罐中，此时透析袋中多余的气体会通过发酵柱通气管道缓慢排出，发酵罐液面不可没过发酵柱通气管道下部。最后组装发酵罐的其余零部件，包括密封盖、u形管（管内需添加适量体积的惰性液体）、空气滤孔。至此石榴汁植物乳杆菌发酵正式启动。
36.在发酵过程中，发酵温度控制在18-20℃，避光，厌氧发酵，罐中发酵时间为20天。发酵结束检测不同发酵罐发酵液的ph值、甜度、乳酸菌数量、色泽以及感官测评，并与直投式乳酸菌发酵液的相关指标数据进行比较分析。
37.（5）产品灌装与贮藏发酵结束后，将产品转入无菌容器，并于4℃条件下避光密封保存，进行无菌灌装即可出品。
38.当发酵罐内的石榴汁发酵完毕时，可将发酵柱拆卸至另一个石榴汁发酵罐内继续发酵。
39.实施例2生产材料：新鲜甜石榴与酸石榴、纱布、植物乳杆菌菌种（lactobacillus plantarum）（大连亚芯生物科技有限公司）、md77透析袋（mw:8000-14000）、mrs肉汤培养基与mrs琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司）、无菌蒸馏水、食用酒精、食品级na2co3。
40.生产装置：如图1的发酵柱和如图2的发酵罐。
41.生产方案：（1）培育植物乳杆菌菌种在无菌台上，用接种环挑取植物乳酸菌菌体，并在mrs琼脂培养基平板上划线。使用parafilm封口膜封板，放入细菌培养箱倒置培养，培养条件为37℃、48 h、静置厌氧培养。
42.在无菌台上，挑取生长饱满的单菌落至无菌的mrs肉汤培养基中培养，培养条件为37℃、48 h、静置厌氧培养。培养完毕，在无菌台上弃去培养液的上层澄清液体，并离心富集培养液下部菌体沉淀，使用无菌水重悬洗涤菌体并离心收集，离心条件为室温、3000 rpm
.
min-1
、5 min。重复洗涤菌体三次，尽量去除培养基成分，最终对弃去上清液的植物乳杆菌菌体进行称重，最终获得大量植物乳杆菌种。
43.（2）发酵罐杀菌将发酵罐内部组件清洗干净并组装（此时半透膜不可以固定在发酵罐内），向发酵罐内倒入食用酒精（酒精浓度为75%），酒精液面要完全没过罐口，同时密封罐口。室温下静置72 h，完成发酵罐杀菌过程。将发酵罐内酒精抽出，倒入无菌水进行冲洗数次，直至罐内没有酒精味道，取出发酵柱结构并放置在无菌环境下以备用，至此发酵罐内杀菌清洗过程
结束。
44.（3）石榴汁装罐将新鲜的大红袍甜石榴与酸石榴石榴籽粒分别剥出，使用干净的纱布分别榨取石榴籽粒中的石榴汁，同时确保石榴种子不能破损，否则种子内容物流出会让石榴汁发酵过程产生异味。使用食品级na2co3调整石榴汁ph至7.5~8.0范围，随后加热石榴汁至微微沸腾，并撇去浮沫，趁热将甜石榴汁与酸石榴汁分别装入发酵罐内，发酵罐内要置留出十分之一的空间，随后适当密封发酵罐，待石榴汁冷量至37℃时方可进行下一步操作。
45.（4）启动发酵裁剪底部封口的md77透析袋，裁剪长度长度与发酵柱高度相一致，放入蒸馏水中煮沸1 h充分杀菌。在无菌条件下取出，加入离心过的植物乳杆菌菌体，菌体添加量以发酵液质量的1
‰
。随后加入透析袋三分之一体积的无菌水，并将透析袋固定在发酵柱内部。最终将发酵柱缓慢的放入发酵罐中，此时透析袋中多余的气体会通过发酵柱通气管道缓慢排出，发酵罐液面不可没过发酵柱通气管道下部。最后组装发酵罐的其余零部件，包括密封盖、u形管（管内需添加适量体积的惰性液体）、空气滤孔。至此石榴汁植物乳杆菌发酵正式启动。在发酵过程中，发酵温度控制在18-20℃，避光，厌氧发酵，罐中发酵时间为20天。发酵结束，分别检测甜石榴汁与酸石榴汁发酵液ph、甜度、乳酸菌数量，同时进行相应的感官测评。以期获得最适宜植物乳杆菌发酵的石榴汁种类。
46.（5）产品灌装与贮藏发酵结束后，将产品转入无菌容器，并于4℃条件下避光密封保存，进行无菌灌装即可出品。
47.当发酵罐内的石榴汁发酵完毕时，可将发酵柱拆卸至另一个石榴汁发酵罐内继续发酵。
48.实施例3生产材料：新鲜甜石榴（选用大红袍石榴品种）、纱布、植物乳杆菌菌种（lactobacillus plantarum）（大连亚芯生物科技有限公司）、md77透析袋（mw:8000-14000）、mrs肉汤培养基与mrs琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司）、无菌蒸馏水、食用酒精、食品级na2co3。
49.生产装置：如图1的发酵柱和如图2的发酵罐。
50.生产方案：（1）培育植物乳杆菌菌种在无菌台上，用接种环挑取植物乳杆菌菌体，并在mrs琼脂培养基平板上划线。使用parafilm封口膜封板，放入细菌培养箱倒置培养，培养条件为37℃、48 h、静置厌氧培养。在无菌台上，挑取生长饱满的单菌落至无菌的mrs肉汤培养基中培养，培养条件为37℃、48 h、静置厌氧培养。培养完毕，在无菌台上弃去培养液的上层澄清液体，并离心富集培养液下部菌体沉淀，使用无菌水重悬洗涤菌体并离心收集，离心条件为室温、3000 rpm
.
min-1
、5 min。重复洗涤菌体三次，尽量去除培养基成分，最终对弃去上清液的植物乳杆菌菌体进行称重，最终获得大量植物乳杆菌种。
51.（2）发酵罐杀菌将发酵罐内部组件清洗干净并组装（此时半透膜不可以固定在发酵罐内），向发酵
罐内倒入食用酒精（酒精浓度为75%），酒精液面要完全没过罐口，同时密封罐口。室温下静置72 h，完成发酵罐杀菌过程。将发酵罐内酒精抽出，倒入无菌水进行冲洗数次，直至罐内没有酒精味道，取出发酵柱结构并放置在无菌环境下以备用，至此发酵罐内杀菌清洗过程结束。
52.（3）石榴汁装罐将新鲜的石榴籽粒剥出，使用干净的纱布榨取石榴籽粒中的石榴汁，同时确保石榴种子不能破损，否则种子内容物流出会让石榴汁发酵过程产生异味。使用食品级na2co3调整石榴汁ph至7.5~8.0范围，随后加热石榴汁至微微沸腾，并撇去浮沫，趁热装入发酵罐内，一共灌装三个发酵罐，发酵罐内要置留出十分之一的空间，随后适当密封发酵罐，待石榴汁冷量至37℃时方可进行下一步操作。
53.（4）启动发酵裁剪底部封口的md77透析袋，裁剪长度长度与发酵柱高度相一致，放入蒸馏水中煮沸1 h充分杀菌。在无菌条件下取出，加入离心过的植物乳杆菌菌体，菌体添加量分别以发酵液质量的2
‰
。随后加入透析袋三分之一体积的无菌水，并将透析袋固定在发酵柱内部。最终将发酵柱缓慢的放入发酵罐中，此时透析袋中多余的气体会通过发酵柱通气管道缓慢排出，发酵罐液面不可没过发酵柱通气管道下部。最后组装发酵罐的其余零部件，包括密封盖、u形管（管内需添加适量体积的惰性液体）、空气滤孔。至此石榴汁植物乳杆菌发酵正式启动。在发酵过程中，发酵温度控制在18-20℃，避光，厌氧发酵，罐中发酵时间为20天。发酵结束分别检测不同植物乳杆菌接种量发酵液的ph值、甜度、乳酸菌数量，同时进行相应的感官测评。以期获得最佳的植物乳杆菌接种量。
54.（5）产品灌装与贮藏发酵结束后，将产品转入无菌容器，并于4℃条件下避光密封保存，进行无菌灌装即可出品。
55.当发酵罐内的石榴汁发酵完毕时，可将发酵柱拆卸至另一个石榴汁发酵罐内继续发酵。
56.本发明可回收乳酸菌种的石榴汁乳酸菌的发酵柱和发酵罐，将乳酸菌种加入到一端封口的透析袋中，并将部分透析袋没入石榴汁中，通过一定的方式对透析袋进行固定，使其在石榴汁中悬空。随着发酵进行，石榴汁缓慢渗透入透析袋中，随后乳酸菌对透析袋内石榴汁中有效成分进行厌氧发酵，发酵产物通过自由扩散方式透过透析袋进入外侧发酵液，而乳酸菌却不能自由进出透析袋。该方法把乳酸菌种限制在透析袋内。发酵结束时，可以将发酵罐中的透析袋转入新的发酵罐，从而实现乳酸菌重复利用，降低生产成本。