一种人精子膜蛋白SPACA1特异性抗原偶联蛋白与抗体的制备方法与流程

一种人精子膜蛋白spaca1特异性抗原偶联蛋白与抗体的制备方法
技术领域
1.本发明涉及一种多肽及其抗体制备方法，该抗体是用于人精子膜蛋白spaca1蛋白的基础研究的重要工具，还可在靶向示踪、生物制药和精准治疗等领域具有很好的应用前景。


背景技术：

2.精子获能是两性生殖过程的重要步骤，获能过程中精子细胞膜从非生育状态转化到生育状态。当精子获能后，精子膜蛋白、糖蛋白、脂质成分和精子质膜通道发生多种分子结构的变化，一方面出现精子头部质膜成分损失，尾部细胞膜改变，发生精子超活化；另一方面精子对卵细胞及其相关结构(颗粒细胞，卵透明带)提供的信号进行反馈并发生顶体反应(ar)。出现顶体受体的激活、顶体膜与精细胞质膜融合、顶体中水解酶的释放、卵细胞外被(透明带)的水解等过程，最终促进精子-卵母细胞融合。精子顶体区上的这些受体、糖或蛋白质分子可以作为抗原直接产生抗精子抗体(asab)，从而妨碍精卵融合，引发男性不育。由于缺乏精子顶体膜蛋白特异性抗原位点和抗体的研究，asab引起男性免疫不育症的作用机制尚未明确，因此借助分子生物学、生物信息学和高通量测序等技术的跨学科应用，进一步揭示精子顶体区、颈部和尾部精子表面膜蛋白的特异性抗原位点在两性生殖过程中的作用机制，构建特异性免疫不孕不育靶向治疗方法等一系列的科学问题，是促进健康生育、构筑人口安全的重大需求。
3.(1)spaca1的功能：人精子顶体膜相关蛋白1(sperm acrosome membrane-associated protein 1，spaca1)基因位于6q15dna正义链，长度为19,798bp，有8个外显子，具有一个保守结构域，该基因的mrna有两种亚型：xm_011536160.2和xm_017011335.1。spaca1蛋白质产物294个氨基酸，分子量32,143da，是单次跨膜ⅰ型膜蛋白，主要位于细胞膜。在精子发生过程中，在精子细胞发育的所有阶段的顶体中都能检测到spaca1，但在顶体形成之前未发现。该蛋白定位于精子细胞和成熟精子的整个顶体的内膜和外膜。有研究显示spaca1主要在顶体形态发生和精卵结合及融合中起作用。
4.(2)spaca1抗体产品的信息：经检索,市场上有spaca1蛋白的多克隆抗体,但是这些抗体的抗原表位不同且只能进行体外检测。
5.(3)spaca1抗体的功能：spaca1抗体与特发性不孕不育病例具有相关性，该基因表达的蛋白最早通过不育男性的抗精子抗体识别。体外实验显示spaca1在精子与卵膜结合与融合中发挥生理作用，spaca1重组蛋白产生的抗体可以抑制人类精子与去透明带仓鼠卵的结合从而阻断体外受精。重组spaca1抗原与抗精子抗体阳性的不育男性血清有强烈的免疫结合反应，提示spaca1可能是引起免疫不育的抗原。动物实验显示，spaca1蛋白在精子头部的形成中起着重要作用，spaca1基因敲除小鼠的成熟精子是缺乏顶体的圆头精子能够引起不育。


技术实现要素：

6.本发明目的针对可用于免疫不育机制研究的asab制备方法和研究工具的不足，提供一种人精子膜蛋白spaca1特异性多肽、抗原偶联蛋白与抗体的制备方法，不同于体外实验检测抗体，用此多肽制备的抗spaca1抗体一方面可以通过免疫荧光和酶联免疫吸附实验特异识别组织或细胞中的天然人spaca1蛋白，另一方面可以借助spaca1的特异性表面抗原位点进行抗精子抗体介导的免疫不育作用机制的研究，还可以开展靶向示踪、生物制药和精准治疗等方面的研究。
7.本发明的技术方案
8.一种n端人精子膜蛋白spaca1特异性多肽，其抗原结合位点位于人精子顶体区外膜，多肽序列为人精子膜蛋白spaca1氨基酸序列中第61位到第74位氨基酸的肽段，并在c端加上半胱氨酸(c)，多肽的氨基酸序列为：nyappetedvsnrnc。
9.一种人精子膜蛋白spaca1特异性抗原偶联蛋白，为合成抗原多肽nyappetedvsnrnc通过交联剂将多肽氨基酸疏基与匙孔血蓝蛋白(klh)氨基共价交联的混合物。
10.本发明同时提供了一种抗人精子膜蛋白spaca1的抗体的制备方法，包括：
11.第1步、人精子膜蛋白spaca1特异性抗原表位的分析与设计；
12.利用生物信息软件对蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估跨膜片段、多肽活性、亲水性、抗原性等指数。
13.第1.1步、使用tmhmm在线预测膜蛋白的跨膜区域；
14.登录tmhmm主页面，在“选择文件”弹出框提交fasta格式spaca1蛋白序列或将序列粘贴在“or by pasting sequence(s)in fasta format:”下方的文本框；out format有三个选项，分别是图形输出(extensive,with gaphics)；文字输出(extensive，no graphics)；蛋白逐行显示(one line protein)，默认选项图形化显示；调整完毕后按“submit”键提交并查看预测分析结果。
15.第1.2步、使用signalp 4.1 server对膜蛋白进行信号肽的预测分析；
16.登录signalp 4.1 server主页面，在“选择文件”弹出框提交fasta格式蛋白序列或将序列粘贴在下方的文本框；参数设置organism group：选择eukaryotes；d-cutoff values：选择default(optimized for correlation)；graphics output：选择png(inline)；output format：standard；method选择input sequences may include tm regions。参数设置完毕后按“submit”键提交并查看预测分析结果。
17.第1.3步、使用expasy-protscale对膜蛋白进行疏水性的预测分析；
18.登录expasy-protscale主界面，在“enter a uniprotkb/swiss-prot or uniprotkb/trembl accession number(ac)”文本框内输入蛋白序列id number；或将fasta格式蛋白序列粘贴在“or you can paste your own sequence in the box below:”的文本框；参数设置选择默认设置，设置完毕后按“submit”提交并查看预测分析结果。
19.第2步、人精子膜蛋白spaca1特异性抗原偶联蛋白的制备和纯化；
20.第2.1步、人工多肽的合成；
21.采用多肽自动合成仪合成纯化，并采用质谱分析和高效液相色谱分析法进行纯度鉴定，纯度大于为95％。
22.第2.2步、利用edc偶联合成特异性抗原偶联蛋白；
23.将匙孔血蓝蛋白klh、合成多肽和edc分别配置成溶液，将多肽溶液按1：1-2的质量比滴加入载体匙孔血蓝蛋白klh溶液中，立即按与合成多肽质量比为1：4-5的比例加入edc溶液到mcklh肽溶液，在室温下反应2小时后除去edc的残留物。
24.第2.3步、纯化特异性抗原偶联蛋白复合物；
25.在purification buffer salts瓶中添加经超声波震荡除气的超纯水60ml以溶解内容物，每0.5ml样品使用一个脱盐柱过滤，将0.5ml的合成多肽-klh复合物轻轻滴加入25ml的purification buffer salts洗脱柱子中，静置2分钟，取5ml纯化缓冲液对柱子进行洗脱，收集洗脱液利用紫外可见吸收光谱测定280nm处检测吸光度，根据吸收峰计算多肽-klh复合物的含量。如果免疫原需要储存较长时间，可使用0.22um过滤器过滤免疫原，-20℃保存。
26.第3步、制备人工免疫原免疫动物；
27.第3.1步、购入2.0kg重的spf级的新西兰大白兔分为实验组和对照组，正常血清在免疫实验前从动物耳缘静脉抽血0.5ml制备。
28.第3.2步、利用佐剂包裹抗原：在每次免疫之前，将特异性抗原偶联蛋白复合物400-600ug吸入一支2.5ml无菌注射器中，以另一只2.5ml注射器吸入等量的完全弗氏佐剂或弗式不完全佐剂，两支注射器以无菌塑料软管连接并反复对抽，直到完全乳化后(滴一滴到冷水中不再扩散，即为达到油包水的完全乳化程度)，即可用于免疫。
29.第3.3步、动物致敏：400mg特异性抗原偶联蛋白复合物与完全弗氏佐剂按体积比1：1混合行第2步操作，充分混匀后进行动物致敏，为了增加致敏效果在动物躯干部、颈部和背部采用多点法(每点约200ul)注射于皮下。
30.第3.4步以相同抗原剂量并以弗氏非完全佐剂和弗氏完全佐剂交叉乳化抗原每周加强免疫一次，乳化方法同前。分别在兔子的背部皮下、腹部皮下、腹股沟、腘沟、脚掌等部位注射。注射时，用兔盒固定兔子，先用左手提起皮肤，右手持注射器，将针头和皮肤之间角度调整为15度左右，将针头注入皮肤1-2cm后向上挑起以防刺入肌肉，每点注射200ul左右。
31.第3.5步、具体免疫方案如下所示，共免疫10周。每只兔子均在第7周和第9周由耳缘静脉加强免疫两次。分别在第4、8、9和10周进行elsia实验检测抗体效价和特异性。
32.第4步、收集抗体血清；
33.第4.1步、将兔子仰卧位用绳子固定四肢，其中双上肢交叉置于头部后面固定，用细绳拴住兔上颌门牙后向后拉，顺势将兔头固定于双上肢上。
34.第4.2步、暴露颈部，消毒后将颈部毛发剪去，沿颈部正中自胸骨上窝至下颌剪开颈部皮肤约15cm，找到气管后沿气管仔细分离皮下组织，远心端至喉部，近心端至胸锁乳突肌。
35.第4.3步、在气管下方即可见搏动的劲动脉，仔细分离两侧颈动脉，并充分游离。
36.第4.4步、将两根黑丝线套入一侧动脉并分开(一根在远心端，一根在近心端)，用丝线将动脉远心端结扎，然后将动脉近心端用动脉夹夹住，用眼科剪在丝线与动脉夹中间的动脉壁上剪开一个小口，迅速插入预先制作好的细塑料软管，并迅速用近心端丝线固定软管与动脉，以防软管脱出和漏血。
37.第4.5步、轻轻松开动脉夹，用50ml离心管倾斜放置接住从放血管里射出来的动脉
血，直至无血液滴出，可同法处理另一侧颈动脉增加放血量，并可于放血流量缓慢时挤压心脏以增加血液排出量。
38.第4.6步、兔抗血清的分离和保存将兔血清于4℃冰箱放置过夜。第一次吸取血清后，4摄氏度下12000转/分钟，离心15min，第二次吸取血清。最终得到spaca1抗体血清约50ml，用15ml离心管分装后分别加入0.01％体积的nan3，置入-20℃冰箱内保存。
39.第5步、饱和硫酸铵法分离纯化抗人精子膜蛋白spaca1igg抗体；
40.第5.1步、取兔抗血清3ml移入15ml离心管中，4℃下逐渐加入3ml的0.01m ph7.4pbs，缓慢震荡下逐滴加入6ml的ph7.0的饱和硫酸铵溶液。
41.第5.2步、硫酸铵溶液达到50％饱和度时，将上述溶液置于4℃下过夜。
42.第5.3步、将上述溶液置于4℃下经10000转/分钟离心20min，弃去上清液，得到球蛋白沉淀。
43.第5.4步、4℃下，用3ml的0.01m ph7.4 pbs溶解沉淀后，逐滴加入1.5ml的饱和硫酸铵溶液(使硫酸铵溶液达到33％饱和度)，沉淀30min。重复两次。
44.第5.5步、4℃下，10000转/分钟离心10min，弃去上清液，得到抗体igg沉淀。
45.第5.6步、弃去上清液，加入3ml的0.01m ph7.4 pbs溶解抗体igg沉淀，并装入透析袋中。
46.第5.7步、4℃下，将透析袋放入0.01m ph7.4 pbs溶液中进行透析。期间换液若干次，至透析外液无黄色变化为止。8)取透析袋内样品真空干燥，取少许做适当倍数稀释后，测定蛋白含量。
47.第6步、酶联免疫吸附实验鉴定血清抗体与天然人spaca1蛋白结合效价；
48.第6.1步、人源精子膜蛋白可溶性抗原的制备。
49.第6.1.1步、健康男性禁欲3-5d后，手淫方法取精。精子37℃水浴液化后，行精液常规分析，收集精子成活率》60％，精子活力a级》25％，或a+b级》50％的精液待用；取15ml离心管依次加入90％和45％percoll液各5ml，形成二层percoll密度梯度分离柱；取4ml待用精液小心加入至离心管中，可见清晰的分界面。3000转/分钟，离心15分钟，小心吸出精子层，加入至2mlpbs液，4℃下3000/分钟离心10分钟，得到精子细胞沉淀，用4℃无菌pbs充分混匀后按上述条件离心，重复三次。得到清洁的精子细胞沉淀，用约3-5mlpbs充分混匀后移入15ml无菌离心管中得到精子细胞悬液。
50.第6.1.2步、利用超声波细胞破碎仪打碎精子细胞膜,膜蛋白充分暴露抗原位点。方法：将3-5ml含精子细胞的15ml离心管置入碎冰中，顶帽打开，将超声波细胞破碎仪探头放入溶液中，强度调整为70％，破碎时间6min(破碎5s，暂停5s以防温度过抗原变性以及产生泡沫)。
51.第6.1.3步、将上述溶液离心(4℃，12000转/分)，弃去沉淀，取上清液(精子可溶性膜蛋白抗原)，4℃下保存。反复上述步骤，将分次取得的可溶性抗原收集并-80度冰箱保存。
52.第6.2步、包被:将人源精子膜蛋白抗原稀释为50ug/ml滴加到96孔板的若干小孔中，100μl/孔,于4℃过夜。
53.第6.3步、封闭：弃去孔中的可溶性抗原,加入5％脱脂奶粉(封闭液)150μl/孔,37℃下孵育40min。
54.第6.4步、洗涤:加洗涤液(pbst)200ul/孔，洗涤三次,每次放置3min。
55.第6.5步、加入一抗:充分甩弃孔中洗液,并依次加入不同稀释度的待测血清抗体100μl/孔，37℃下，放置40min。
56.第6.6步、洗涤:小孔中加入pbst，200ul/孔，静置3min,弃去孔中洗涤液，重复三次，最后充分甩弃孔中洗涤液。
57.第6.7步、加入酶标抗体(二抗):将hrp标羊抗兔二抗1:10000稀释，加入100μl/孔，并于37℃下放置40min。
58.第6.8步、洗涤:用pbst洗涤三次,每次3min。
59.第6.9步、显色:加入tmb显色液100μl/孔，常温下避光放置15min。
60.第6.10步、终止液:加1m的h2so4，50μl/孔。
61.第6.11步、测量:利用酶标仪测定od 490nm值。
62.第7步、细胞免疫荧光染色定位精子表面spaca1蛋白分布；
63.第7.1步、人源精子和中性粒细胞收集：手淫法收集健康人精液37℃完全液化，2000转/min,离心10min收集精子细胞，用0.01mph7.4 pbs洗涤离心3次；利用梯度离心收集人中性粒细胞用同体积0.01mph7.4 pbs稀释溶解。并用血球计数板计数，将精子和中性粒细胞浓度均调整为2
×
106个/ml；
64.第7.2步、精子涂片：将0.5ml含5
×
106个精子的pbs溶液，均匀滴加于多聚赖氨酸包被的玻片上，室温自然风干，形成精子涂片；
65.第7.3步、0.01mph7.4 pbs洗涤3次，每次5分钟；
66.第7.4步、室温覆盖以4％的多聚甲醛固定15分钟，避光；
67.第7.5步、0.01mph7.4 pb pbs缓冲液洗洗涤3次，每次5分钟；
68.第7.6步、0.25％triton x-100(通透液)覆盖细胞5-7分钟，(注：不加通透液可省略此步骤)；
69.第7.7步、0.01mph7.4pbs洗涤三遍，每次5分钟；
70.第7.8步、山羊封闭血清室温封闭40分钟；
71.第7.9步、配制一抗，spaca1稀释为150ug/ml加入，湿盒内4℃避光过夜；
72.第7.10步、pbs洗涤三次，每次5分钟；
73.第7.11步、配制荧光标记二抗(ab150079)goat anti-rabbit igg(h&l)，用pbs按1:100稀释，避光保存；
74.第7.12步、加入二抗，室温孵育1小时(避光)；
75.第7.13步、4℃pbs洗涤三次，每次15分钟(避光)；
76.第7.14步、dapi染核，完全覆盖住细胞即可(避光)；
77.第7.15步、使用共聚焦显微镜观察染色结果，出现高强度红色荧光(发射光波长为647nm)的细胞作为观察视野，进行观察拍照。
78.第8步、人源正常成熟精子与spaca1抗体共孵育实验；
79.第8.1步、人源正常成熟精子和中性粒细胞的收集：手淫法收集健康人精液37℃完全液化，2000转/min，离心10min收集精子细胞，用0.01mph7.4 pbs洗涤离心3次；利用梯度离心收集人中性粒细胞用同体积0.01mph7.4 pbs稀释溶解。并用血球计数板计数，将精子和中性粒细胞浓度均调整为2
×
106个/ml；
80.第8.2步、抗体和精子共孵育：将0.5ml精子溶液或中性粒细胞溶液分别与2mg/ml
的spaca1抗体0.5ml溶液均匀混合，37℃共孵育30分钟，用0.01mph7.4 pbs洗涤离心3次，定容10ml；随后操作步骤同上第7.2步-第7.15步。
81.本发明的优点和有益效果：
82.本发明制备的抗spaca1抗体不仅可以与固定变性的spaca1蛋白抗原位点有稳定的特异性结合能力，还可以与生理状态下保持细胞完整性的精子顶体膜spaca1蛋白抗原位点特异性结合，获得特异性的抗体定向效果。该抗体可根据具体应用情况，通过fc端链接复杂的多组分、多功能的生物集团构建复合靶向系统来满足不同的需求。由于spaca1蛋白在精子顶体区外膜上有非常广泛的分布，本发明制备的抗体在精子的靶向示踪、生物制药和精准治疗等领域具有很好的应用前景。
附图说明
83.图1人源spaca1氨基酸序列和特异性spaca1抗原表位的氨基酸序列。
84.图2tmhmm2.0预测spaca1蛋白跨膜区域在217-239位，1-216位氨基酸在细胞膜外侧。
85.图3signalp 4.1预测spaca1为分泌蛋白，序列剪切位点在30位，smax＝0.967，ymax＝0.840。
86.图4expasy-protscale预测spaca1蛋白序列有6个正向波峰，第238位的氨基酸(ile，异亮氨酸)具有最高分值，表明该位点的氨基酸疏水性最强；5个明显的负向波峰，第53位的氨基酸(glu，谷氨酸)具有最低分值，表明该位点的氨基酸亲水性最强。
87.图5elsia测定spaca1抗体的效价，(a)第四周抗体效价为1:1600；(b)第八周抗体效价为1：1600；(c)第九周抗体效价为1：3200；(d)第十周的效价别为1:3200，第十周抗体od值最高。
88.图6作为阴性对照，抗人igg抗体在人源精子未见着色。
89.图7spaca1蛋白主要集中分布在精子头部的顶体区域，在中性粒细胞未见着色。
90.图8抗人精子膜spaca1蛋白抗体与精子共孵育的免疫荧光结果显示spaca1蛋白在精子活体状态下，抗原决定簇位于精子顶体腔内，不能与精子细胞膜外的抗体直接结合。
具体实施方式
91.实施例1：
92.一种人精子膜蛋白spaca1特异性抗原偶联蛋白与抗体的制备方法，具体包括如下步骤：
93.第1步、人精子膜蛋白spaca1特异性抗原表位的分析与设计；
94.利用生物信息软件对spaca1蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估跨膜片段、多肽活性、亲水性、抗原性等指数，再结合过去制备抗体的实际经验,最终确定spaca1蛋白61-74位15个氨基酸，在多肽c端修饰一个半胱氨酸，合成多肽氨基酸序列为nyappetedvsnrnc(图1)。
95.第1.1步、使用tmhmm在线预测人源精子膜蛋白spaca1的跨膜区域；
96.登录tmhmm主页面，在“选择文件”弹出框提交fasta格式spaca1蛋白序列或将序列粘贴在“or by pasting sequence(s)in fasta format:”下方的文本框；out format有三
个选项，分别是图形输出(extensive,with gaphics)；文字输出(extensive，no graphics)；蛋白逐行显示(one line protein)，默认选项图形化显示；调整完毕后按“submit”键提交并查看预测分析结果，spaca1蛋白序列的跨膜区域在217-239位，1-216位在顶体区内膜；(图2)。
97.第1.2步、使用signalp 4.1 server对人源精子膜蛋白spaca1进行信号肽的预测分析；
98.登录signalp 4.1 server主页面，在“选择文件”弹出框提交fasta格式蛋白序列或将序列粘贴在下方的文本框；参数设置organism group：选择eukaryotes；d-cutoff values：选择default(optimized for correlation)；graphics output：选择png(inline)；output format：standard；method选择input sequences may include tm regions。参数设置完毕后按“submit”键提交并查看预测分析结果，spaca1蛋白序列剪切位点在30位，smax＝0.967，ymax＝0.840；(图3)。
99.第1.3步、使用expasy-protscale对人源精子膜蛋白spaca1进行疏水性的预测分析；
100.登录expasy-protscale主界面，在“enter a uniprotkb/swiss-prot or uniprotkb/trembl accession number(ac)”文本框内输入蛋白序列id number；或将fasta格式蛋白序列粘贴在“or you can paste your own sequence in the box below:”的文本框；参数设置选择默认设置，设置完毕后按“submit”提交并查看预测分析结果，spaca1蛋白序列有6个正向波峰，第238位的氨基酸(ile，异亮氨酸)具有最高分值，表明该位点的氨基酸疏水性最强。5个明显的负向波峰，第53位的氨基酸(glu，谷氨酸)具有最低分值，表明该位点的氨基酸亲水性最强(图4)。
101.第2步、人精子膜蛋白spaca1特异性抗原偶联蛋白的制备和纯化；
102.第2.1步、spaca1人工多肽的合成；
103.上海华大基因公司采用多肽自动合成仪合成纯化spaca1(16肽)10mg，并采用质谱分析和高效液相色谱分析法进行纯度鉴定，纯度大于为95％。
104.第2.2步、利用edc偶联合成人精子膜蛋白spaca1特异性抗原偶联蛋白；
105.取klh配制成10mg/ml的溶液1.25ml，将spaca1(16肽)合成多肽溶解在2.5ml的imject@edc conjugation bufjfer中，浓度为0.4mg/ml，将多肽溶液滴加入载体蛋白溶液中，用超纯水配制10mg/ml的edc溶液，立即加250ul此溶液到mcklh肽溶液，在室温下反应2小时后除去edc的残留物。
106.第2.3步、纯化人精子膜蛋白spaca1特异性抗原偶联蛋白复合物；
107.在purification buffer salts瓶中添加经超声波震荡除气的超纯水60ml以溶解内容物，每0.5ml样品使用一个脱盐柱过滤，将0.5ml的人精子膜蛋白spaca1特异性抗原偶联蛋白复合物轻轻滴加入25ml的purification buffer salts洗脱柱子中，静置2分钟，取5ml纯化缓冲液对柱子进行洗脱，收集洗脱液利用紫外可见吸收光谱测定280nm处检测吸光度，根据吸收峰计算多肽-klh复合物的含量。如果免疫原需要储存较长时间，可使用0.22um过滤器过滤免疫原，-20℃保存。
108.第3步、制备人工免疫原免疫动物；
109.第3.1步、购入2.0kg重的spf级的新西兰大白兔4只。分为spaca1组和对照组，正常
血清在免疫实验前从动物耳缘静脉抽血0.5ml制备。
110.第3.2步、利用佐剂包裹抗原：在每次免疫之前，将人精子膜蛋白spaca1特异性抗原偶联蛋白复合物400-600ug吸入一支2.5ml无菌注射器中，以另一只2.5ml注射器吸入等量的完全弗氏佐剂或弗式不完全佐剂，两支注射器以无菌塑料软管连接并反复对抽，直到完全乳化后(滴一滴到冷水中不再扩散，即为达到油包水的完全乳化程度)，即可用于免疫。
111.第3.3步、动物致敏：400mg人精子膜蛋白spaca1特异性抗原偶联蛋白复合物与完全弗氏佐剂按体积比1：1混合行第2步操作，充分混匀后进行动物致敏，为了增加致敏效果在动物躯干部、颈部和背部采用多点法(每点约200ul)注射于皮下。
112.第3.4步以相同抗原剂量并以弗氏非完全佐剂和弗氏完全佐剂交叉乳化抗原每周加强免疫一次，乳化方法同前。分别在兔子的背部皮下、腹部皮下、腹股沟、腘沟、脚掌等部位注射。注射时，用兔盒固定兔子，先用左手提起皮肤，右手持注射器，将针头和皮肤之间角度调整为15度左右，将针头注入皮肤1-2cm后向上挑起以防刺入肌肉，每点注射200ul左右。每次免疫后从兔耳缘静脉取血5-10ml作为免疫血清收集。
113.第3.5步、具体免疫方案如下所示，共免疫10周。每只兔子均在第7周和第9周由耳缘静脉加强免疫两次。分别在第4、8、9和10周进行elsia实验检测抗体效价和特异性。
114.第4步、抗体血清的制备；
115.第4.1步、将兔子仰卧位用绳子固定四肢，其中双上肢交叉置于头部后面固定，用细绳拴住兔上颌门牙后向后拉，顺势将兔头固定于双上肢上。
116.第4.2步、暴露颈部，消毒后将颈部毛发剪去，沿颈部正中自胸骨上窝至下颌剪开颈部皮肤约15cm，找到气管后沿气管仔细分离皮下组织，远心端至喉部，近心端至胸锁乳突肌。
117.第4.3步、在气管下方即可见搏动的劲动脉，仔细分离两侧颈动脉，并充分游离。
118.第4.4步、将两根黑丝线套入一侧动脉并分开(一根在远心端，一根在近心端)，用丝线将动脉远心端结扎，然后将动脉近心端用动脉夹夹住，用眼科剪在丝线与动脉夹中间的动脉壁上剪开一个小口，迅速插入预先制作好的细塑料软管，并迅速用近心端丝线固定软管与动脉，以防软管脱出和漏血。
119.第4.5步、轻轻松开动脉夹，用50ml离心管倾斜放置接住从放血管里射出来的动脉血，直至无血液滴出，可同法处理另一侧颈动脉增加放血量，并可于放血流量缓慢时挤压心脏以增加血液排出量。用此方法得到spaca1兔血70ml。
120.第4.6步、兔抗血清的分离和保存将兔血清于4℃冰箱放置过夜。第一次吸取血清后，4摄氏度下12000转/分钟，离心15min，第二次吸取血清。最终得到spaca1抗体血清约50ml，用15ml离心管分装后分别加入0.01％体积的nan3，置入-20℃冰箱内保存。
121.第5步、饱和硫酸铵法纯化抗体；
122.第5.1步、取兔抗血清3ml移入15ml离心管中，4℃下逐渐加入3ml的0.01m ph7.4pbs，缓慢震荡下逐滴加入6ml的ph7.0的饱和硫酸铵溶液。
123.第5.2步、硫酸铵溶液达到50％饱和度时，将上述溶液置于4℃下过夜。
124.第5.3步、将上述溶液置于4℃下经10000转/分钟离心20min，弃去上清液，得到球蛋白沉淀。
125.第5.4步、4℃下，用3ml的0.01m ph7.4 pbs溶解沉淀后，逐滴加入1.5ml的饱和硫
酸铵溶液(使硫酸铵溶液达到33％饱和度)，沉淀30min。重复两次。
126.第5.5步、4℃下，10000转/分钟离心10min，弃去上清液，得到抗体igg沉淀。
127.第5.6步、弃去上清液，加入3ml的0.01m ph7.4 pbs溶解抗体igg沉淀，并装入透析袋中。
128.第5.7步、4℃下，将透析袋放入0.01m ph7.4 pbs溶液中进行透析。期间换液若干次，至透析外液无黄色变化为止。8)取透析袋内样品真空干燥，取少许做适当倍数稀释后，测定蛋白含量。
129.第6步、酶联免疫吸附实验鉴定血清spaca1抗体与非变性人spaca1蛋白结合效价；
130.第6.1步、人源精子膜蛋白可溶性抗原的制备；
131.第6.1.1步、健康男性禁欲3-5d后，手淫方法取精。精子37℃水浴液化后，行精液常规分析，收集精子成活率》60％，精子活力a级》25％，或a+b级》50％的精液待用；取15ml离心管依次加入90％和45％percoll液各5ml，形成二层percoll密度梯度分离柱；取4ml待用精液小心加入至离心管中，可见清晰的分界面。3000转/分钟，离心15分钟，小心吸出精子层，加入至2mlpbs液，4℃下3000/分钟离心10分钟，得到精子细胞沉淀，用4℃无菌pbs充分混匀后按上述条件离心，重复三次。得到清洁的精子细胞沉淀，用约3-5mlpbs充分混匀后移入15ml无菌离心管中得到精子细胞悬液。
132.第6.1.2步、利用超声波细胞破碎仪打碎精子细胞膜,膜蛋白充分暴露抗原位点。方法：将3-5ml含精子细胞的15ml离心管置入碎冰中，顶帽打开，将超声波细胞破碎仪探头放入溶液中，强度调整为70％，破碎时间6min(破碎5s，暂停5s以防温度过抗原变性以及产生泡沫)。
133.第6.1.3步、将上述溶液离心(4℃，12000转/分)，弃去沉淀，取上清液(精子可溶性膜蛋白抗原)，4℃下保存。反复上述步骤，将分次取得的可溶性抗原收集并-80度冰箱保存。
134.第6.2步、包被:将人源精子膜蛋白抗原稀释为50ug/ml滴加到96孔板的若干小孔中，100μl/孔,于4℃过夜。
135.第6.3步、封闭：弃去孔中的可溶性抗原,加入5％脱脂奶粉(封闭液)150μl/孔,37℃下孵育40min。
136.第6.4步、洗涤:加洗涤液(pbst)200ul/孔，洗涤三次,每次放置3min。
137.第6.5步、加入一抗:充分甩弃孔中洗液,并依次加入不同稀释度的待测血清抗体100μl/孔，37℃下，放置40min。
138.第6.6步、洗涤:小孔中加入pbst，200ul/孔，静置3min,弃去孔中洗涤液，重复三次，最后充分甩弃孔中洗涤液。
139.第6.7步、加入酶标抗体(二抗):将hrp标羊抗兔二抗1:10000稀释，加入100μl/孔，并于37℃下放置40min。
140.第6.8步、洗涤:用pbst洗涤三次,每次3min。
141.第6.9步、显色:加入tmb显色液100μl/孔，常温下避光放置15min。
142.第6.10步、终止液:加1m的h2so4，50μl/孔。
143.第6.11步、测量：利用酶标仪测定od 490nm值。本次实验经过十次免疫，最终spaca1抗体第四周、第八周、第九周和第十周的效价分别为1:1600、1:1600、1:3200和1:3200，十周抗体od值最高(图5)。
144.第7步、细胞免疫荧光染色定位精子表面spaca1蛋白分布；
145.第7.1步、人源精子和中性粒细胞收集：手淫法收集健康人精液37℃完全液化，2000转/min，离心10min收集精子细胞，用0.01mph7.4 pbs洗涤离心3次；利用梯度离心收集人中性粒细胞用同体积0.01mph7.4 pbs稀释溶解。并用血球计数板计数，将精子和中性粒细胞浓度均调整为2
×
106个/ml；
146.第7.2步、精子涂片：将0.5ml含5
×
106个精子的pbs溶液，均匀滴加于多聚赖氨酸包被的玻片上，室温自然风干，形成精子涂片；
147.第7.3步、0.01mph7.4 pbs洗涤3次，每次5分钟；
148.第7.4步、室温覆盖以4％的多聚甲醛固定15分钟，避光；
149.第7.5步、0.01mph7.4 pb pbs缓冲液洗洗涤3次，每次5分钟；
150.第7.6步、0.25％triton x-100(通透液)覆盖细胞5-7分钟，(注：不加通透液可省略此步骤)；
151.第7.7步、0.01mph7.4pbs洗涤三遍，每次5分钟；
152.第7.8步、山羊封闭血清室温封闭40分钟；
153.第7.9步、配制一抗，spaca1稀释为150ug/ml加入，湿盒内4℃避光过夜；
154.第7.10步、pbs洗涤三次，每次5分钟；
155.第7.11步、配制荧光标记二抗(ab150079)goat anti-rabbit igg(h&l)，用pbs按1:100稀释，避光保存；。
156.第7.12步、加入二抗，室温孵育1小时(避光)；
157.第7.13步、4℃pbs洗涤三次，每次15分钟(避光)；
158.第7.14步、dapi染核，完全覆盖住细胞即可(避光)；
159.第7.15步、使用共聚焦显微镜观察染色结果，出现高强度红色荧光(发射光波长为647nm)的细胞作为观察视野，进行观察拍照。人源精子和中性粒细胞涂片的免疫荧光染色显示，igg抗体在人源精子未见着色(图6)；spaca1蛋白主要集中分布在精子头部的顶体区域，在中性粒细胞未见着色(图7)。
160.第8步、人源正常成熟精子与spaca1抗体共孵育实验；
161.第8.1步、人源正常成熟精子和中性粒细胞的收集：手淫法收集健康人精液37℃完全液化，2000转/min,离心10min收集精子细胞，用0.01mph7.4 pbs洗涤离心3次；利用梯度离心收集人中性粒细胞用同体积0.01mph7.4 pbs稀释溶解。并用血球计数板计数，将精子和中性粒细胞浓度均调整为2
×
106个/ml；
162.第8.2步、抗体和精子共孵育：将0.5ml精子溶液或中性粒细胞溶液分别与2mg/ml的spaca1抗体0.5ml溶液均匀混合，37℃共孵育30分钟，用0.01mph7.4 pbs洗涤离心3次，定容10ml；随后操作步骤同上第7.2步-第7.15步；spaca1抗体与精子共孵育实验可观察抗体结合运动精子spaca1蛋白的表达情况，本次共孵育实验显示，spaca1蛋白在精子活体状态下，抗原决定簇位于精子顶体腔内，不能与精子细胞膜外的抗体直接结合。(图8)。