一种地钱联苄和二氢查尔酮糖基转移酶编码基因及其应用

1.本发明属于糖基转移酶技术领域，具体涉及一种来源于地钱的糖基转移酶mpugt737b1及所述糖基转移酶mpugt737b1在糖苷类化合物合成中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.联苄类化合物是自然界中一类重要的次级代谢产物，目前在苔类植物及极少数高等植物中发现，并主要以糖苷的形式存在。在植物中催化糖基化的酶是糖基转移酶(gt)，它将活化的糖分子转移到广泛的内源性和外源性底物上。
4.联苄糖苷具有重要的药理活性。例如，二氢白藜芦醇-4-o-葡萄糖苷具有抑制b16f0黑色素瘤细胞的活性。这些化合物目前获取方法主要是植物提取和化学合成。然而，传统的联苄糖苷获取方法存在提取效率低、提取过程毒性大等缺点。因此，鉴定高催化活性的特异性的联苄糖基转移酶，并将其用于联苄糖苷的生物合成具有重要意义。
5.已研究的糖基转移酶主要存在于被子植物和裸子植物中。苔藓植物作为从水生到陆生过渡的重要植物类群，体内富含结构多样的次级代谢产物(包括联苄、萜类、黄酮类、苯丙素类等)，而目前苔藓植物中的糖基转移酶只有少数被鉴定。地钱(marchantia polymorpha l.)是苔类植物的模式植物，其中催化联苄和黄酮糖苷生成的糖基转移酶(gts)的研究尚未报道。


技术实现要素：

6.本发明提供一种地钱联苄糖基转移酶及其编码基因与应用。经研究发现，本发明得到的来自于苔类植物地钱的糖基转移酶能够高效催化联苄(二氢白藜芦醇和半月苔素)、二氢查尔酮(根皮素)和苯丙素类化合物的糖基化，可用于生物合成联苄4-o-葡萄糖苷、根皮素-4-o-葡萄糖苷以及苯丙素类糖苷等一些具有生物活性的化合物，因此具有较高的经济价值。
7.基于上述研究成果，本发明提供以下技术方案：
8.本发明第一方面，提供seq id no.1所示序列编码的蛋白作为糖基转移酶的应用。
9.上述第一方面中，所述糖基转移酶来源于地钱，由480个氨基酸残基组成，命名为mpugt737b1。上述糖基转移酶mpugt737b1的获取方式包括提取分离方式、基因工程表达或化学合成方式。
10.优选的，所述蛋白作为糖基转移酶的应用，主要用于4-o-糖苷类化合物的合成，具体包括以下任意一个方面：
11.(1)催化联苄类、二氢查尔酮类、苯丙素类化合物糖苷化；
12.(2)制备联苄糖苷类、二氢查尔酮糖苷类和苯丙素糖苷类化合物。
13.上述应用更为优选的方案中，所述糖基转移酶mpugt737b1应用于联苄类、二氢查尔酮类及苯丙素类化合物的催化，针对上述底物的催化效率更高。
14.进一步的，所述联苄类化合物为二氢白藜芦醇或半月苔素；
15.进一步的，所述二氢查尔酮类化合物为根皮素；
16.进一步的，所述苯丙素类化合物为咖啡醛、松柏醇、松柏醛、5-oh松柏醛、芥子醛。
17.上述(2)方面的应用中，所述糖苷类化合物的催化反应方式如下：将糖基转移酶与底物加入缓冲液中反应，加入乙酸乙酯终止反应。进一步的，所述催化反应温度为25～35℃；所述反应时间为酶加入后8～12min。
18.本发明验证的一种实施方式中，还提供了一种在表达糖基转移酶mpugt737b1的微生物体内饲喂底物进行合成的方法，步骤如下：
19.向表达糖基转移酶mpugt737b1的菌株中加入浓度为80～120μm的底物，并放在15～20℃培养16～20h后加入乙酸乙酯终止反应。
20.本发明第二方面，提供编码糖基转移酶mpugt737b1的基因，所述基因的核苷酸序列如下：
21.(1)所述核苷酸序列具有seq id no.2所示序列；
22.(2)由于密码子简并性能够翻译得到seq id no.1所示氨基酸序列的核酸序列；
23.(3)seq id no.2所示序列的互补序列。
24.上述seq id no.2所示序列的核苷酸链由1443个核苷酸组成，包括第1-1440位核苷酸编码的序列，以及第1441-1443位核苷酸转录为终止肽链合成的终止密码子。
25.本发明第三方面，提供包含第二方面所述基因的开放阅读框、重组载体、重组细胞、转化体或工程菌。
26.所述重组载体为包含编码期望蛋白质的核苷酸序列的dna构建体，其可操作地连接至适当的表达调控序列以在适合的宿主细胞中表达期望的蛋白质。该调控序列包括可以引发转录的启动子、调控转录的任选的操纵基因(operator)序列、编码适当的mrna核糖体结合位点的序列、和调控转录和翻译终止的序列。在载体被转化入适当的宿主细胞之后，其可以独立于宿主基因组复制或起作用，并且可以将载体整合入基因组本身。
27.在本发明中使用的载体不具体地限制，只要它能够在宿主细胞中复制，并且可以使用本领域中任何已知的载体。常规载体的实例可包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。
28.所述重组细胞的一个实例为包含所述重组载体的细胞，所述细胞为原核细胞，优选为细菌，如大肠杆菌、芽孢杆菌等。
29.以上一个或多个技术方案的有益效果是：
30.本发明提供的mpugt737b1基因是在地钱中首次发现的能够催化联苄类、二氢查尔酮类以及苯丙素类化合物糖基化的一个糖基转移酶，本发明利用pcr技术从cdna获得了基因的全长序列。通过构建pet32a蛋白表达载体转化大肠杆菌bl21(de3)得到目的蛋白。体外酶活功能鉴定证明mpugt737b1能够催化联苄类、二氢查尔酮类、苯丙素类、黄酮类、二氢黄酮类化合物糖苷化。其对联苄(二氢白藜芦醇，半月苔素)、二氢查尔酮(根皮素)、苯丙素类(松柏醇、松柏醛、5-oh松柏醛)等化合物的催化效率较高，可用于生物合成这些化合物的糖基化产物，因此具有较高的经济价值和广阔的应用前景。
附图说明
31.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
32.图1为目的基因mpugt737b1的orf扩增产物的电泳图。
33.图2为mpugt737b1蛋白sds-page电泳图；
34.其中：m:蛋白分子质量标准；泳道1：mpugt737b1的上清液；泳道2：mpugt737b1的纯化蛋白。
35.图3为mpugt737b1的主要酶活催化反应的hplc图谱、产物的lc-ms分析及反应式；
36.(a)以udp-葡萄糖为糖供体，糖受体为根皮素；
37.(b)以udp-葡萄糖为糖供体，糖受体为二氢白藜芦醇；
38.(c)以udp-葡萄糖为糖供体，糖受体为半月苔素；
39.每个酶活催化反应都以空载体的催化反应作为对照。
40.图4为mpugt737b1催化苯丙素类化合物的产物hplc图谱；
41.其中，(a)底物为松柏醇；
42.(b)底物为5-oh松柏醛；
43.(c)底物为咖啡醛；
44.(d)底物为松柏醛；
45.(e)底物为芥子醛。
46.图5为反应参数对mpugt737b1催化活性的影响；
47.其中，(a)不同反应温度下的催化活性；
48.(b)不同反应ph的催化活性；
49.(c)不同金属离子的催化活性。
50.图6为mpugt737b1催化根皮素的反应产物鉴定光谱图；
51.(a)为根皮素-4-o-葡萄糖苷的1h nmr图；
52.(b)为根皮素-4-o-葡萄糖苷的hsqc图；
53.(c)为根皮素-4-o-葡萄糖苷的1h-1
h cosy图。
54.图7为表达mpugt737b1的大肠杆菌饲喂底物的hplc图谱；
55.(a)为二氢白藜芦醇作为底物；
56.(b)为根皮素作为底物。
57.图8为表达mpugt737b1的大肠杆菌进行饲喂分析时培养基与底物终浓度对产物产量的影响；
58.(a)分别用lb、m9、tb培养基进行表达mpugt737b1的大肠杆菌的体内饲喂；
59.(b)底物浓度梯度设定为75μm、100μm、125μm、150μm、200μm、300μm来进行大肠杆菌的体内饲喂。
60.图9为mpugt737b1基因在紫外胁迫后的表达模式分析。
61.图10为mpugt737b1的亚细胞定位图；
62.其中：(a)激发光下绿色荧光信号；
63.(b)激发光下叶绿体的荧光信号；
64.(c)自然光下烟草表皮细胞；
65.(d)a、b、c图的叠加。
具体实施方式
66.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
67.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
68.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
69.实施例1
70.1.表达基因mpugt737b1的克隆
71.1.1 ctab-pvp法提取地钱总rna
72.(1)取新鲜的地钱植物材料，清洗干净后用滤纸吸干水分，置于预冷的研钵中加液氮研磨至材料成粉末状。
73.(2)取适量粉末至提前预冷的2ml进口离心管中，加600-800μl 65℃预热的ctab-pvp提取液，上下颠倒混匀。
74.上述ctab-pvp提取缓冲液配制方法如下：
75.100mm tris
·
hcl(ph 8.0)，2％ctab(w/v)，2％pvp(w/v)，25mm edta，2m nacl，高压蒸汽灭菌之后巯基乙醇加至0.2％；溶液配置用depc处理过的ddh2o，高压灭菌后备用。
76.(3)65℃水浴30min，每隔10min颠倒混匀一次。
77.(4)冷却至室温后加入600-800μl氯仿，颠倒混匀后在4℃13,000rpm离心10min。
78.(5)取上清转至新的进口2ml的离心管，加入600-800μl氯仿，振荡混合均匀后4℃13,000rpm离心10min。
79.(6)重复上步(即用氯仿抽提三次)。
80.(7)小心吸取上清转至新的进口1.5ml离心管中，加入1/3体积的8m licl，-20℃静置3h以上。
81.(8)4℃13,000rpm离心10min，弃上清。
82.(9)加入700μl 75％乙醇(depc水配制)洗涤沉淀2-3次。离心弃上清后挥干剩余乙醇。
83.(10)加入30μl proteinase k处理后的灭菌水溶解rna，制得总rna。使用biophotometer plus核酸蛋白测定仪测定提取的rna浓度及质量。
84.1.2 mpugt737b1基因全长扩增
85.1.2.1引物设计
86.在mpugt737b1 orf两侧的非编码区设计全长引物mpugt737b1-f/r，对基因进行扩增。
87.1.2.2 cdna合成
88.以提取的地钱的总rna为模板，以primerscript rt master mix逆转录体系通过pcr技术获得cdna模板链。
89.逆转录体系及逆转录程序如下：
90.(1)除基因组dna
[0091][0092]
将上述各组分加入进口pcr管中，轻轻混匀后于42℃水浴5min。
[0093]
(2)逆转录pcr
[0094][0095]
在pcr仪中的逆转录程序为：37℃,15min；85℃变性15s，4℃保温。
[0096]
逆转录产物保存于-20℃，使用前稀释10倍。
[0097]
1.2.3目的基因扩增
[0098]
以稀释的逆转录的地钱cdna为模板，以mpugt737b1-f/r为引物进行扩增。
[0099]
扩增体系及扩增程序如下：
[0100][0101]
将以上组分加入200μl的pcr管中混合均匀，低速离心后放入pcr仪中按以下程序进行扩增：94℃预变性3min；94℃变性10s，52℃退火15s，72℃延伸45s，33个循环；72℃延伸10min。
[0102]
将pcr反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将目的大小条带切胶回收，方法如下。
[0103]
将上述pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳(1.4％，w/v，g/100ml)，并用tiangen胶回收试剂盒回收。步骤如下：
[0104]
(1)将上述pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳后，经溴化乙锭(ethidium bromide,eb)染色5min，于紫外灯下快速切下含有目的大小条带的胶块，放入1.5ml离心管中。
[0105]
(2)加入200μl溶液pc，于55℃水浴5-6min溶解胶块。期间每隔2min颠倒震荡离心管使之充分溶解。
[0106]
(3)将吸附柱cb2置于2ml的收集管中，将上述溶胶液转移至吸附柱cb2，12,000rpm离心1min，弃掉收集管中的滤液。
[0107]
(4)向吸附柱cb2中加入600μl漂洗液pw。12,000rpm离心1min，弃掉滤液。
[0108]
(5)重复操作步骤(4)。
[0109]
(6)弃掉滤液，将吸附柱cb2室温12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。
[0110]
(7)将吸附柱cb2置于新的1.5ml离心管中，开盖放置至乙醇挥干。在柱子膜中央加入30μl ddh2o，室温静置2min，12,000rpm离心2min，收集dna溶液立即使用或-20℃保存。
[0111]
1.3目的片段平端载体连接
[0112]
将上述胶回收产物片段按照以下反应体系连接到平端载体ptopo：
[0113][0114]
将上述反应体系混匀放于pcr仪中25℃反应5分钟后，将最终产物进行大肠杆菌dh5α转化。
[0115]
1.4转化
[0116]-80℃保存的大肠杆菌dh5α感受态细胞(50μl)取出后置于冰上解冻，加入5μl连接产物，轻轻吹打混匀，于冰上放置30min；42℃水浴中热击45s后迅速置于冰上2min，加入500μl无抗lb培养基后于37℃培养箱振荡培养1h，取200μl转化液涂布于lb固体培养基(含100μg/ml氨苄抗性)上，37℃静置培养12h-16h。
[0117]
lb培养基组分(1l)：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、nacl 10g，加水溶解后定容至1l。固体培养基加入琼脂(12g/l)后，高压蒸汽灭菌。
[0118]
1.5重组子阳性克隆鉴定
[0119]
随机挑选5个单克隆接种于200μl lb培养基中，37℃振荡培养4h。以菌液为模板进行菌落pcr。体系如下：
[0120][0121]
扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃延伸10min；
[0122]
菌落pcr后进行琼脂糖凝胶电泳，能扩增出明亮且单一的目的大小条带的为阳性单克隆，将条带大小合适的阳性克隆送测序。测序成功的阳性克隆存菌：930μl菌液加70μl dmso，混合均匀后于-80℃冻存。
[0123]
2.基因蛋白表达及酶活功能分析
[0124]
2.1提取mpugt737b1-ptopo质粒
[0125]
用质粒小量提取试剂盒(tiangen)提取质粒：
[0126]
(1)将所存菌株mpugt737b1-ptopo-dh5α划lb板(含100μg/ml amp)，37℃，12h后长
出单克隆，挑取单克隆于4ml含amp抗性的培养基中，37℃，110rpm培养10h。
[0127]
(2)取菌液室温12,000rpm离心1min，弃上清，收集菌体，尽可能倒掉上清。
[0128]
(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入150μl溶液p1，涡旋振荡至菌体完全悬浮。
[0129]
(4)向离心管中加入150μl溶液p2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
[0130]
(5)向离心管中加入350μl溶液p5，立即快速的上下颠倒混匀，此时将出现絮状沉淀。静置2min后，12,000rpm离心5min。
[0131]
(6)将上一步收集的上清液转移到吸附柱cp3(吸附柱放入收集管中)。12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
[0132]
(7)向吸附柱cp3中加入300μl漂洗液pwt，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
[0133]
(8)将吸附柱cp3放入收集管中，12,000rpm离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。
[0134]
(9)将吸附柱cp3置于一个干净的离心管中，挥干乙醇后，向吸附膜的中间部分悬空滴加30-50μl蒸馏水，12,000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。
[0135]
2.2扩增mpugt737b1 orf
[0136]
以构建的阳性单克隆质粒为模板，用带限制性内切酶酶切位点的引物对mpugt737b1-pet32a-f/r和primerstar max dna聚合酶扩增目的基因mpugt737b1的orf。
[0137]
mpugt737b1-pet32a-f:cgggatcccatggagttgacgaacgggac(seq id no.3)
[0138]
mpugt737b1-pet32a-r:ataagaatgcggccgcttacaccatcacgaggtctt(seq id no.4)
[0139]
以mpugt737b1-ptopo质粒为模板，用上述引物扩增其orf，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，52℃退火15s，72℃延伸45s，33个循环；72℃延伸10min。pcr产物经凝胶电泳分离后，按胶回收试剂盒说明书对片段进行胶回收。(结果见图1)
[0140]
2.3酶切
[0141]
载体pet32a及胶回收片段分别用bamh i与not i进行酶切，酶切体系如下：
[0142][0143]
酶切在37℃水浴反应3h。酶切产物加10
×
loading buffer终止反应后进行琼脂糖凝胶电泳并选择合适的条带进行胶回收，胶回收方法同上。
[0144]
2.4连接、转化及阳性验证
[0145]
酶切后的目的片段与酶切后的载体pet32a(购自novagen公司)用t4 dna ligase(购自takara公司)连接，体系如下：
[0146][0147]
将上述组分充分混匀后，16℃过夜连接。将连接产物转入大肠杆菌dh5α。转化方法同上。挑取单克隆验证阳性并送测序，取测序正确的单克隆存菌并提取mpugt737b1-pet32a质粒。将构建好的原核表达载体质粒热击法转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，转化、筛选与鉴定方法同上。
[0148]
2.5 mpugt737b1重组蛋白原核表达
[0149]
2.5.1重组蛋白诱导纯化
[0150]
(1)挑取菌株mpugt737b1-pet32a-bl21阳性克隆接种于4ml含amp抗性的lb培养基中，在37℃，110rpm摇床震荡培养过夜。
[0151]
(2)将培养好的菌液按1:100的比例接于200ml含amp抗性的培养基中，相同条件下培养至od600≈0.5。在菌液中加入0.5mm iptg，于16℃，110rpm摇床里培养16-18h诱导目的蛋白表达。
[0152]
(3)收菌：将菌液离心5000rpm,5min后弃上清。
[0153]
(4)洗涤：按照菌量向离心管中加入适量的binding buffer洗涤液，使菌体重悬，5,000rpm，离心5min，收集菌体，洗涤两次后加15～20ml binding buffer重悬菌体。
[0154]
(5)裂解：将菌液置于冰水混合物中，超声裂解菌体，4℃12,000rpm，离心20min后收集上清进行过柱纯化，留部分上清液准备sds-page，以观察蛋白表达情况。
[0155]
(6)分离：将收集的上清加入平衡过的ni-nta柱子中，待上清流完，加入一柱体积的洗脱液(含有20mm咪唑)洗掉杂蛋白，然后用5ml elution buffer(含咪唑浓度为250mm)收集目的重组蛋白。
[0156]
(7)超滤：将洗脱下的蛋白液置于蛋白分子为30,000da规格的超滤管中，4,000rcf离心10min，并加入binding buffer换液2-3次，然后浓缩目的蛋白。
[0157]
(8)将浓缩液吸取至2ml收集管中，测定蛋白浓度，并留样。
[0158]
(9)蛋白加10％甘油后，用液氮速冻并保存至-80℃冰箱备用。
[0159]
binding buffer：分别称取2.42g tris-hcl、29.22g nacl，加水溶解，调ph8.0，定容至1000ml，灭菌后加入70μlβ-巯基乙醇，4℃保存。
[0160]
elution buffer：分别称取2.42g tris-hcl、29.22g nacl、34g imidazole，加水溶解，调ph8.0，定容至1000ml，灭菌后加入70μlβ-巯基乙醇，4℃保存。
[0161]
2.5.2蛋白的浓度测定
[0162]
采用bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。
[0163]
(1)完全溶解蛋白标准品bsa，取10μl用0.9％nacl稀释至100μl，使其终浓度为0.5mg/ml作为标准品。
[0164]
(2)将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板中，加0.9％nacl补足到20μl。各做三个平行。
[0165]
(3)用0.9％nacl适当稀释留取的蛋白样品，同样加20μl。各做3个平行。
[0166]
(4)各孔加入200μl g250染色液，室温放置3-5min。
[0167]
(5)用酶标仪测定595nm处的吸光值(a595)，根据标准品蛋白浓度和对应的吸光度绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。
[0168]
2.5.3蛋白sds-page电泳
[0169]
目的蛋白的表达及分离纯化情况用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,sds-page)进行检测。
[0170]
(1)采用垂直板式电泳，将玻璃板固定于胶架上。
[0171]
(2)配制12％分离胶，加入到电泳仪中，加水液封，静置直至分离胶凝固。
[0172]
(3)配制5％浓缩胶，倒掉上层水。将配制好的5％的浓缩胶混匀后立即倒入，将孔梳插入到玻璃板间(避免气泡的产生)，待胶凝固后拔出孔梳。
[0173]
(4)在蛋白上清液和纯化的蛋白中分别加入2
×
loading buffer，100℃金属浴5min，使蛋白与loading buffer结合。13,000rpm离心5min，取上清10μl点样，同时吸取蛋白marker3μl点样。
[0174]
(5)向电泳槽中加适量电泳缓冲液，先90v恒压进行电泳，待样品电泳到分离胶时改为120v恒压电泳，直至溴酚蓝至胶的下沿，停止电泳。
[0175]
(6)取下蛋白胶，放入考马斯亮蓝r-250染色液中浸泡染色，室温下轻摇染色4h。
[0176]
(7)用蒸馏水冲洗掉蛋白胶表面的染色液，冲洗2～3次后置于脱色液中脱色2h，脱色过程中更换脱色液数次。
[0177]
(8)观察结果，蛋白电泳结果如图2。
[0178]
sds-page分离胶和浓缩胶的配制溶液及比例如下：
[0179][0180]
2.6蛋白体外酶活功能鉴定
[0181]
2.6.1体外酶活分析
[0182]
mpugt737b1进行体外酶活功能鉴定，以加入pet32a蛋白的反应体系为对照组。底物有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢查尔酮、联苄和苯丙素类化合物。酶活反应体系如下：
[0183][0184]
混匀上述组分，置于30℃反应30min后加等体积乙酸乙酯终止反应，等体积乙酸乙
酯萃取两次后，合并有机相，挥干溶剂。用100μl的甲醇重溶，采用hplc进行酶活反应分析。
[0185]
2.6.2酶活产物分析
[0186]
为了验证mpugt737b1的体外酶活功能，hplc被用于检测上述酶活反应的产物(图3、图4)。分析采用zorbax sb-c18，5μm，4.6
×
150mm(agilent)色谱柱，检测波长254nm,280nm,320nm和346nm，流速1.0ml/min，进样量为20μl。液相分析条件如下：
[0187]
hplc分析条件为：
[0188][0189]
lc-ms用于酶活产物鉴定。分析采用hypersil gold,1.9μm，100
×
2.1mm色谱柱，检测波长254nm,280nm和350nm，流速0.3ml/min，进样量为2μl。分析条件为：
[0190][0191][0192]
酶活反应分析结果如表1。
[0193]
表1 mpugt737b1对部分底物的催化效率
[0194][0195]a酶活反应糖基供体为udp-glucose；
[0196]b检测出微量产物；
[0197]c未能检测出产物；
[0198]d催化活性表示为nmol
·
(mg
·
min)-1
±
stdev。
[0199]
2.6.3酶学性质分析
[0200]
为了确定mpugt737b1催化反应的最佳ph，分别配置不同ph的tris-hcl缓冲液，ph选择5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9和9.5，在30℃下测定mpugt737b1活性；同时也对最适温度进行优化，在最适ph的条件下配置反应混合物，在不同温度下进行反应(20、25、30、35、40、45、50和55℃)，产物经hplc分析，并计算反应速率，结果如图5所示。
[0201]
2.6.4酶学动力学参数测定
[0202]
tris-hcl(ph 7.5)缓冲液中，30℃条件下，进行mpugt737b1的酶学动力学分析，将底物浓度分别设为10、20、40、50、80、100、200、400μm。反应在酶加入时开始计时，反应10min，加等体积乙酸乙酯终止反应，平行实验3次。实验结果见表2。
[0203]
表2
[0204][0205]
3.mpugt737b1的酶活产物制备与鉴定
[0206]
3.1制备mpugt737b1催化根皮素的酶活产物
[0207]
将2.6.1中的100μl酶活反应体系扩大150倍，15ml的反应体系在30℃下反应6h，后用等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，用旋蒸旋干，2ml色谱甲醇重溶残留样品，样品进制备液相色谱进行分离。
[0208]
制备液相色谱分离条件：57％甲醇，43％的0.1％甲酸水，进行等度洗脱。
[0209]
将制备出纯的样品溶液用旋蒸蒸干，样品称重有5.7mg。
[0210]
3.2制备产物打谱鉴定
[0211]
产物用氘代甲醇溶解，打了400mhz的1h nmr谱和hsqc谱以及1h-1
h cosy谱(如图6)，谱图与已报道的标准品谱图对照，确定mpugt737b1催化根皮素生成的主要产物是根皮素-4-o-葡萄糖苷。
[0212]
4.表达mpugt737b1的大肠杆菌体内饲喂分析
[0213]
在体外酶活功能鉴定实验中，mpugt737b1重组蛋白对根皮素和联苄的催化活性较高，可以生成较高产量的4-o-葡萄糖苷，尝试在表达mpugt737b1的大肠杆菌体内进行饲喂来生物合成相应产物。
[0214]
4.1利用大肠杆菌mpugt737b1-pet32a-bl21生产化合物
[0215]
具体实验操作如下：
[0216]
(1)冻存的菌株划板后在37℃恒温培养箱中活化，挑取单克隆接种至4ml lb液体培养基中(含amp 100μg/ml)中，37℃培养箱继续培养7h；
[0217]
(2)按照1:100的比例将目的菌株和对照菌株接种到50ml的抗性lb培养基中，37℃，110rpm摇床中培养至od
600
≈0.5，加iptg使其终浓度为0.5mm，16℃恒温培养5-7h；
[0218]
(3)向菌液中加入终浓度为100μm的底物(根皮素、二氢白藜芦醇)，放入16℃继续培养一段时间；
[0219]
(4)每隔12h取出500μl菌液，加入等体积的乙酸乙酯萃取2-3次，合并有机相，吹干样品，加入150μl甲醇重溶，用hplc分析产物，结果如图7所示。
[0220]
结果表明，随着饲喂后时间的增加，二氢白藜芦醇-4-o-葡萄糖苷的产量也在逐渐增加，直至催化完全。而根皮素-4-o-葡萄糖苷在饲喂底物后18h产量达到最高，随后逐渐下降，我们以饲喂根皮素后18h的产物量作为参照对饲喂的最适培养基和最适底物浓度进行研究。
[0221]
4.2 mpugt737b1基因的体内饲喂最适条件分析
[0222]
4.2.1 mpugt737b1基因饲喂的最适培养基
[0223]
本实施例分别以lb、m9、tb为培养基按上述操作方法对菌株mpugt737b1进行饲喂根皮素的实验，并于18h取样进行hplc分析，按照产物峰面积进行产物产量计算(μmol/l)，实验结果如图8，在m9培养基中，产物产量最高。
[0224]
4.2.2 mpugt737b1基因饲喂的最适底物浓度
[0225]
为了研究底物浓度对糖苷产量的影响，以根皮素为底物在m9培养基对大肠杆菌mpugt737b1-pet32a-bl21进行饲喂实验，具体操作参考4.1，加入的底物终浓度分别为75μm、100μm、125μm、150μm、200μm、300μm。并于18h取样进行hplc分析，按照产物峰面积进行产物产量计算(μmol/l)，实验结果如图8。
[0226]
结果表明，从经济角度考虑，能够达到最大转化率糖苷产物的最佳底物浓度是150μm。
[0227]
5.mpugt737b1对紫外胁迫的响应
[0228]
对mpugt737b1在紫外胁迫后的表达模式进行分析，具体实验操作如下：
[0229]
(1)选取植物培养温室中长势较好的地钱，在进行紫外胁迫前取样未经处理的植物叶状体于2ml ep管中，液氮速冻后存于-80℃冰箱待用；
[0230]
(2)将选取的地钱置于紫外灯下20cm处，保证各个部分都被均匀照射，照射10min后，将其置于植物培养温室中正常培养；
[0231]
(3)分别在紫外照射后6h、12h、24h、36h、48h和60h时取样冻存于冰箱；
[0232]
(4)取完样后，按照1.1节的方法提取各个处理阶段的植物总rna，然后检测uv处理后各时间点的基因表达水平。
[0233]
结果如图9所示，mpugt737b1基因经紫外胁迫后表达水平显著上调，因此推测mpugt737b1基因参与了地钱植物的抗逆，在植物应对紫外胁迫时起到关键作用。
[0234]
6.基因亚细胞定位
[0235]
6.1目的基因gfp定位载体的构建
[0236]
根据目的基因mpugt737b1设计gateway引物：
[0237]
attb1-mpugt737b1-f:
[0238]
ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaccatggagttgacgaacgggac；(seq id no.5)
[0239]
attb1-mpugt737b1-r:
[0240]
ggggaccactttgtacaagaaagctgggtccaccatcacgaggtcttgga；(seq id no.6)
[0241]
以mpugt737b1-pet32a质粒为模板进行扩增，扩增的体系和条件同上，扩增后纯化的产物进行gateway反应：
[0242]
(1)bp反应体系如下：
[0243][0244]
(a)取出bp clonase
tm mix试剂放置冰上2min，按照如上反应体系依次将各组分加入ep管中，用枪尖吹打混匀。
[0245]
(b)将混合物置于25℃，孵育4-6h。
[0246]
(c)反应结束后，加入0.5μl proteinase k solution轻轻混匀，置于37℃水浴10min终止反应。
[0247]
(d)将最终反应产物转化大肠杆菌dh5α，涂于含有gent抗性的lb平板，37℃培养。连接转化及阳性单克隆的鉴定方法同上。
[0248]
(2)将测序成功的质粒(mpugt737b1-pdonr207)按以下操作体系进行lr反应：
[0249][0250]
(a)将上述混合液放置于25℃，反应6h左右，之后加入0.5μl proteinase k solution，轻轻混匀，37℃反应10min终止反应；
[0251]
(b)反应结束后，将最终反应产物转化大肠杆菌dh5α，涂于含有kan抗性的lb平板，37℃培养。连接转化及阳性单克隆的鉴定方法同上。测序成功得到最终阳性质粒mpugt737b1-pgwb5。
[0252]
6.2冻融法转化农杆菌
[0253]
(1)于-80℃取出农杆菌感受态细胞gv3101，冰上融化，取1μg的mpugt737b1-pgwb5质粒和pgwb5空载体质粒分别加入到gv3101感受态细胞中，用移液枪轻轻吹打混匀，冰水浴5min；
[0254]
(2)液氮速冻5min后，置于37℃水浴5min，然后再冰置5min；
[0255]
(3)加入400μl无抗性yep液体培养基，30℃振荡培养2-3h；
[0256]
(4)取200μl菌液涂于yep固体培养基(含50μg/ml kan，100μg/ml rif)上。30℃静置培养2-3d；
[0257]
(5)挑取单克隆进行接种于培养基中，振荡培养，菌落pcr鉴定其阳性，取阳性克隆存菌，备用。
[0258]
yep培养基组分(1l)：酵母提取物10g、胰蛋白胨10g、nacl 5g，加水溶解并定容。固体培养基加入琼脂(12g/l)后，高压蒸汽灭菌。
[0259]
6.3农杆菌瞬时转化法转化烟草表皮细胞
[0260]
(1)将mpugt737b1-pgwb5-gv3101、pgwb5-gv3101和抑制蛋白沉默的p19划板，30℃培养36h后挑单克隆接种至3ml yep液体培养液中(含kan 50μg/ml，gent 50μg/ml，rif 100μg/ml)小摇，30℃，200rpm振荡培养36h左右。
[0261]
(2)将菌液按1：50接种于5ml yep液体培养液(含kan 50μg/ml，gent 50μg/ml，rif 100μg/ml)中震荡培养10h左右。
[0262]
(3)将菌液再次活化，按1：50接种于20ml yep液体培养液(含kan 50μg/ml，gent50μg/ml，rif 100μg/ml)中大摇至od600在0.4-0.6。
[0263]
(4)收菌，4000rpm，离心20min，弃上清；烟草转化液洗涤1次，离心，弃上清。
[0264]
(5)菌体用少量转化液重悬，调od600≈1.0。
[0265]
(6)将mpugt737b1-pgwb5-gv3101、pgwb5-gv3101分别和p19按1:1混合后置于暗处静置3-5h。
[0266]
(6)用1ml的注射器将农杆菌渗透到烟草叶片的下表皮细胞中。
[0267]
(7)36h后，取经农杆菌渗透的叶片在激光共聚焦显微镜上检测下表皮细胞的荧光信号(设置488nm的氩激发光，gfp信号的发射光波长495-570nm，叶绿体发出的信号波长650-760nm)，结果见图10。
[0268]
烟草转化液：mes-koh(ph 5.6)、na3po4 2mm、葡萄糖0.5％(v/v)、乙酰丁香酮100μl。
[0269]
7.mpugt737b1的结构模拟与分子对接
[0270]
7.1确定蛋白模板
[0271]
对已鉴定过晶体结构的ugt进行序列分析，寻找与mpugt737b1亲缘关系较近的序列，将其蛋白结构作为模板进行结构模拟。最终选取了美洲商路中鉴定的pagt1(ab368371)，在rcsb pdb网站下载其结构pdb文件(代码6jem)为模拟模板。
[0272]
7.2蛋白的结构模拟与底物分子对接
[0273]
(1)在swiss-modle在线网站上传mpugt737b1序列及蛋白结构模板进行结构模拟；
[0274]
(2)在pubchem在线网站下载要对接的根皮素、半月苔素以及udp-葡萄糖的结构；
[0275]
(3)模拟的mpugt737b1结构文件用maestro软件计算合适的活性空腔位置并进行分子对接操作；
[0276]
(4)根据对接结果查看底物分子的位置与活性空腔的大小。
[0277]
根据蛋白结构模拟结果显示，底物结合位置较保守，且根皮素的4-oh更加靠近糖供体，因此蛋白优先催化4-oh位置；半月苔素的4-oh也是靠近糖供体的一端，是蛋白的催化位点。并且底物分子在空腔中都以柔性状态存在，这也说明了mpugt737b1对具有柔性结构的单键的分子选择性高，与酶活结果相一致，进一步证明了mpugt737b1的催化特征。
[0278]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。