一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法

1.本发明涉及施旺细胞的培养，具体说是一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法。


背景技术：

2.施旺细胞是周围神经系统特有的胶质细胞，其发育的终点是形成髓鞘细胞和非髓鞘细胞，分别包裹大直径和小直径轴突。施旺细胞在外周神经损伤后起重要作用，通过自身增殖、分泌神经营养因子或外泌体等方式促进受损的轴突再生修复。由于原代细胞能保留原有组织微环境的特征，因此对于海绵体神经损伤相关疾病研究而言，海绵体神经来源施旺细胞是此领域科学研究的最佳种子细胞。然而，现有技术中大鼠原代施旺细胞的提取主要来源于坐骨神经，并且现有提取方法存在着所得施旺细胞纯度偏低、成纤维细胞残留较多等问题。另一方面，坐骨神经与海绵体神经存在结构与组织微环境的差异，且海绵体神经十分纤细，较坐骨神经体积相差一个数量级左右，存在施旺细胞获取量低的问题，不利于原代施旺细胞的提纯培养及后续研究。同时，目前尚无相关文献报道大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法。


技术实现要素：

3.针对上述技术问题，本发明提供了一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，该方法具有操作易、周期短、成本低的特点，通过该方法可获得稳定传代的高纯度原代施旺细胞。
4.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，其包括以下步骤：（1）解剖提取大鼠的海绵体神经；（2）剥离上述海绵体神经上附着的血管与结缔组织；（3）将剥离干净的海绵体神经剪切成0.4～0.6mm的小段，然后用含i型胶原酶与胰蛋白酶的消化液进行组织消化，消化后轻柔吹打消化液至未见明显组织块，以制备成单细胞悬液；（4）将上述单细胞悬液过滤，滤液离心得到沉淀，然后用含fbs的dmem高糖培养基重悬沉淀；再取重悬液于经多聚赖氨酸氢溴酸溶液和层粘蛋白溶液处理过的35mm培养皿，置于37℃、5% co2的细胞培养箱培养；（5）采用步骤（4）培养24h后，去除旧培养基，更换含fbs和arac的dmem高糖培养基，置于37℃、5% co2的细胞培养箱继续培养48h，然后去除旧培养基，更换含fbs、青霉素/链霉素、forskolin和重组人heregulinβ-1的dmem高糖培养基，再置于37℃、5% co2的细胞培养箱进行扩增培养，得到施旺细胞。
5.作为优选，所述消化液为含0.1% i型胶原酶与0.25% 胰蛋白酶的l-15基础培养基。
6.作为优选，消化反应温度为36.5～37.5℃，消化时间为30～50 分钟，且每隔5～10分钟轻柔震荡一次。
7.作为优选，所述单细胞悬液采用40～70μm的细胞滤网进行过滤，滤液离心时的离心力为350～400 g，离心时间为5～8 分钟。
8.作为优选，所述含fbs的dmem高糖培养基中fbs浓度为9～11％w/v，葡萄糖浓度4.5g/l；所述多聚赖氨酸氢溴酸浓度为0.01% w/v，分子量为70000～150000；层粘蛋白浓度为1～2μg/ml。
9.作为优选，所述含fbs和arac的dmem高糖培养基中fbs浓度为9～11％w/v，arac浓度为9～11μm，葡萄糖浓度4.5g/l；所述含fbs、forskolin和重组人heregulinβ-1的dmem高糖培养基中fbs浓度为9～11％w/v，青霉素/链霉素浓度为0.9～1.0%， forskolin浓度为2～2.5μm，重组人heregulinβ-1浓度为9.5～10.5 ng/ml，葡萄糖浓度4.5g/l。
10.作为优选，取大鼠的海绵体神经时，先选取spf级sd大鼠10-12周龄，雄性，体重为300-350g；然后向大鼠腹腔注射麻醉剂，待大鼠麻醉稳定后，将大鼠仰卧位固定在手术台上，腹部除毛，碘伏消毒，铺巾，75%的酒精脱碘；接着用手术刀在大鼠下腹部正中线切开皮肤，然后用电刀逐层切开皮下脂肪、肌肉及腹膜进入腹腔，再用大鼠腹部撑开器撑开腹腔以暴露手术视野，找到大鼠前列腺，沿前列腺两侧找到大鼠盆腔神经节及海绵体神经，然后用显微器械游离并剪取海绵体神经。
11.作为优选，所述麻醉剂为3%w/v戊巴比妥钠生理盐水溶液，麻醉剂量为1.5～2ml/kg；游离海绵体神经的长度为10～15mm。
12.作为优选，在取大鼠的海绵体神经前须对手术过程中使用的器械进行灭菌消毒备用，灭菌消毒方法为121℃高压灭菌20～40min。
13.作为优选，在预冷的无菌hank’s平衡盐溶液中剥离海绵体神经上附着的血管与结缔组织，所述hank’s平衡盐溶液为1～4℃预冷的溶液。
14.从以上技术方案可知，本发明剪取成年sd大鼠的海绵体神经，并进行培养、纯化、扩增培养等方法，以获得施旺细胞；该方法通过成年sd大鼠海绵体神经提取原代施旺细胞进行原代培养，可获得稳定传代的高纯度原代施旺细胞，从而拓展了施旺细胞的来源，为海绵体神经相关疾病的科学研究提供了最佳的种子细胞。
附图说明
15.图1为光镜下观察海绵体神经来源原代施旺细胞。
16.图2为细胞免疫荧光鉴定原代施旺细胞。
具体实施方式
17.下面结合图1和图2详细介绍本发明，在此本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
18.本发明提供了一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，其采用以下步骤：取大鼠的海绵体神经，具体是选取spf级sd大鼠10-12周龄，雄性，体重为300-350g；术前对手术过程中使用的常规器械进行灭菌消毒备用；然后腹腔注射麻醉剂，待大鼠
100-03）3、实验准备：实验前一天：1）取500 μl多聚赖氨酸氢溴酸溶液包被35mm培养皿，室温孵育10分钟后吸尽液体，置于4℃冰箱过夜备用。2）所用手术器械在121℃高压下灭菌20～40min。
22.实验当天：1）向经多聚赖氨酸氢溴酸包被的35mm培养皿中加入500 μl层粘蛋白溶液，置于37℃细胞培养箱孵育25～35分钟，吸尽液体后无菌磷酸盐缓冲液冲洗3次。2）准备30 ml 无菌hank’s平衡盐溶液，置于冰上预冷。3）配置10ml 3%（w/v）戊巴比妥钠生理盐水溶液。
23.4、施旺细胞的提取纯化和培养：1）分离并剪取海绵体神经：根据大鼠体重腹腔注射相应剂量戊巴比妥钠生理盐水溶液，待大鼠麻醉稳定后，将大鼠仰卧位固定在手术台上，腹部除毛，碘伏消毒，铺巾，75%的酒精脱碘。用手术刀在大鼠下腹部正中线切开皮肤，手术切口大小约4cm，然后用逐层切开皮下脂肪、肌肉及腹膜进入腹腔。用大鼠腹部撑开器撑开腹腔以暴露手术视野，找到大鼠前列腺，沿前列腺两侧找到大鼠盆腔神经节（mpg）及海绵体神经(cn)，然后用显微器械游离并剪取海绵体神经。
24.2）海绵体神经消化方法：在预冷的无菌hank’s平衡盐溶液中仔细剥离海绵体神经上附着的血管与结缔组织；将剥离干净的海绵体神经剪切成长约5mm的小段，转移至5ml含0.1% i型胶原酶与0.25% 胰蛋白酶的l-15培养基消化液中进行组织消化；置于37℃细胞培养箱消化40分钟，且每隔10 分钟轻柔震荡一次；消化后轻柔吹打消化液至未见明显组织块，以制备单细胞悬液；3）初始原代施旺细胞的培养：用70μm的细胞滤网过滤单细胞悬液，滤液以400 g离心力离心5分钟得到沉淀，弃去上清液，用3ml含10% fbs的dmem高糖培养基重悬沉淀。取重悬液于经多聚赖氨酸氢溴酸溶液和层粘蛋白溶液处理过的35mm培养皿，置于37℃，5% co2的细胞培养箱培养。
25.4）施旺细胞的纯化：培养24h后，去除旧培养基，更换含10% fbs和11μm arac的dmem高糖培养基，置于37℃，5% co2的细胞培养箱培养；5）施旺细胞的扩大培养：继续培养48h后，去除旧培养基，更换含10% fbs、1%青霉素/链霉素、2μm forskolin和10.5 ng/ml重组人heregulinβ-1的dmem高糖培养基，置于37℃，5% co2的细胞培养箱进行扩增培养，即得大量高纯度施旺细胞。
26.5、细胞形态检测：如图1，光学显微镜下观察细胞形态，可见原代细胞呈单极/双极梭形型，形态均一，从细胞形态上证实本发明方法制得的细胞为施旺细胞。
27.6、细胞纯度检测：如图2，施旺细胞特异性标志物有s100和p75
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蛋白。通过免疫荧光染色鉴定施旺细胞纯度高达96％。
28.7、细胞数量检测：在培养第7天可以获得大量稳定传代的施旺细胞，细胞数量约2
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