一种靶向抗原同时外泌CD47抗体的免疫细胞及其应用的制作方法

一种靶向抗原同时外泌cd47抗体的免疫细胞及其应用
技术领域
1.本发明属于肿瘤免疫细胞治疗领域，具体涉及一种靶向抗原同时外泌cd47抗体的免疫细胞及其应用。


背景技术：

2.作为一种新型靶向免疫疗法，嵌合抗原受体修饰的t细胞(car-t)已在血液系统恶性肿瘤疾病中展现出了卓越疗效。嵌合抗原受体(cars)是将t细胞重新定位于肿瘤表面抗原的合成受体，主要由胞外抗原结合域、跨膜结构域和胞内结构域组成。胞外抗原结合域可特异性识别肿瘤抗原，并通过跨膜结构域连接胞内结构域，从而传递活化信号，促进t细胞的增殖与功能。经car修饰后的t细胞无须mhc分子的处理和递呈便可识别肿瘤细胞的肿瘤抗原，特异性杀伤肿瘤细胞，在临床上具有广阔的应用前景。第一代cars通常将抗体衍生的肿瘤结合元件连接到cd3ζ或fc受体信号结构域以触发t细胞活化，可在一定程度上杀伤肿瘤细胞，但效果并不十分理想，cart细胞存活时间较短。第二代和第三代治疗则增加了cd28、4-1bb等共刺激分子，在很大程度上延长了t细胞存活时间并增强其效应子功能。
3.在用化疗、放化疗联合以及造血干细胞移植等传统方式治疗难治复发白血病效果欠佳的情况下，car-t细胞治疗是理想选择。目前以cd19为靶点的car-t细胞在治疗难治复发白血病和淋巴瘤患者中的应用最为广泛，但病人在获得高缓解率的同时伴随着高复发率的风险。例如，cd19-car-t治疗难治复发非霍奇金淋巴瘤已取得显著疗效，约50％的患者可获得完全缓解，但其中约有55％在一年内复发；另外，由于免疫抑制性肿瘤微环境与抗原丢失等限制，与cd19-car-t在急性白血病中所取得的疗效相比，其在实体肿瘤中的疗效不佳。导致cd19-car-t治疗复发的主要机制包括抗原反复刺激导致的免疫抑制性肿瘤微环境和肿瘤选择性剪接导致的抗原逃逸。因此，为减少免疫抑制性tme对car-t细胞的抑制作用，减少治疗复发，需要进一步改善现有cd19-car-t细胞的结构与功能以及治疗策略，以期获得更好的疗效。
4.cd47是一种广泛分布于正常细胞表面的蛋白质，其主要配体sirpα在巨噬细胞、粒细胞、单核细胞等髓样细胞的膜上高度表达。正常细胞表达cd47而标上自我标记，通过cd47/sirpα轴释放“don’t eat me”信号，抑制巨噬细胞介导的吞噬作用，保护正常细胞免遭破坏。研究表明，cd47在多种肿瘤如白血病、淋巴瘤中均有高表达。通过高表达cd47，癌细胞可伪装成自身细胞释放抗吞噬信号，抑制巨噬细胞介导的吞噬作用，发生免疫逃逸，从而促进肿瘤的进展扩散，与肿瘤患者的预后不良相关。此外，cd47的表达与pd-1、treg标记foxp3、mdsc标记cd11b和cd33的表达正相关。抗cd47处理可促使肿瘤小鼠模型体内的巨噬细胞向m1亚型极化，并降低肿瘤小鼠模型的效应t细胞中pd-1的表达并增加ifn-γ的分泌，减少免疫抑制性细胞tregs和mdscs的数量，以此改善肿瘤微环境，延缓肿瘤的生长。但是抗cd47单链抗体的自身特性导致其应用具有一定局限性，且存在靶向正常细胞的风险，造成细胞毒性反应。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种靶向抗原同时外泌cd47抗体的免疫细胞及其应用。
6.本发明第一方面提供一种嵌合抗原受体，由第一信号肽、抗原结合片段、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域、胞内域、自剪切序列、第二信号肽和抗cd47单链抗体依次串联而成。
7.进一步地，所述抗原结合片段识别和结合的抗原为肿瘤相关抗原；
8.优选地，所述抗原结合片段为单链抗体；
9.优选地，所述肿瘤相关抗原选自cd19、cd20、cd22、cd30、cd123、bcma或her2等；
10.优选地，所述肿瘤相关抗原为cd19。
11.进一步地，所述第一信号肽和第二信号肽选自cd8α信号肽、il-2信号肽或gm-csf信号肽；
12.优选地，所述第一信号肽选自cd8α信号肽；
13.优选地，所述第二信号肽选自gm-csf信号肽；
14.所述铰链区选自cd8α铰链区或fcriiiα受体；
15.所述跨膜区选自t细胞受体亚基、cd8α亚基、cd8β亚基、cd8δ亚基、cd4跨膜结构域或cd28跨膜结构域；
16.所述胞内共刺激信号域选自4-1bb、cd27、cd28、icos、ox40、nkg2d或b7-h3胞内共刺激信号域中的一种；胞内共刺激信号域用于传导胞外对抗原结合片段特异的抗原结合域与目标抗原结合后产生的刺激信号，引起免疫细胞活化和免疫应答；
17.优选地，所述胞内共刺激信号域选自4-1bb；
18.所述胞内域选自cd3ζ；
19.所述自剪切序列选自t2a或p2a。
20.本发明第二方面提供所述嵌合抗原受体的编码基因。
21.本发明第三方面提供所述嵌合抗原受体的编码基因的表达载体。
22.进一步地，所述表达载体选自慢病毒表达载体、逆转病毒表达载体或腺病毒表达载体。
23.本发明第四方面提供包含所述表达载体的病毒。
24.本发明第五方面提供一种靶向抗原同时外泌cd47抗体的免疫细胞，包含所述嵌合抗原受体的编码基因或所述嵌合抗原受体的编码基因的表达载体；
25.优选地，所述免疫细胞选自t细胞、nk细胞或nkt细胞；
26.优选地，所述免疫细胞选自t细胞。
27.本发明第六方面提供一种靶向抗原同时外泌cd47抗体的免疫细胞在制备治疗淋巴瘤或白血病药物中的应用。
28.本发明第七方面提供一种药物组合物，包括所述嵌合抗原受体的编码基因的表达载体或所述的靶向抗原同时外泌cd47抗体的免疫细胞。
29.本发明的有益效果为：
30.1、本发明将编码抗原结合片段(如cd19单链抗体)的第一核酸和编码抗cd47单链抗体的第二核酸构建在同一个载体上，通过靶向抗原并外泌cd47抗体，本发明嵌合抗原受
体修饰的免疫细胞可实现抗cd47抗体的局部递送，减轻对正常细胞的影响，高效、特异性地靶向表达相应抗原的肿瘤细胞，并有效拮抗肿瘤免疫微环境中的免疫抑制因素，阻断肿瘤细胞的抗吞噬作用，在保留嵌合抗原受体修饰的免疫细胞抗肿瘤活性的同时，减少肿瘤免疫逃逸，提高免疫细胞的持久性与抗肿瘤活性。
31.2、靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞(car-t)治疗难治复发肿瘤存在复发率高的风险，本发明新型car-t可增强cd19-car-t的抗肿瘤功效，促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，并调节肿瘤微环境中其他免疫抑制性细胞的比例，在保留cd19-cart抗肿瘤活性的同时，减少肿瘤免疫逃逸，提高cart细胞的持久性与抗肿瘤活性，从而减少难治复发肿瘤对car-t细胞疗法的免疫逃逸。
32.抗cd47单链抗体的自身特性导致其应用具有一定局限性，且存在靶向正常细胞的风险，造成细胞毒性反应，本发明新型car-t可作为媒介实现抗cd47单链抗体的局部递送，减少抗cd47单链抗体靶向正常细胞的风险和规避其应用局限性。
附图说明
33.图1显示了嵌合抗原受体的结构示意图。
34.图2显示了嵌合抗原受体cd19-s47-car和cd19-car的载体设计方案。
35.图3显示了通过rt-pcr检测的由cd19-car和cd19-s47-car病毒转染的293t细胞稳定表达抗cd19,抗cd47片段的统计图。
36.图4显示了通过流式细胞术检测的经cd19-car和cd19-s47-car病毒转染(moi＝10)的t细胞的转染效率与cd4,cd8细胞所占的比例。
37.图5显示了通过流式细胞术检测的本发明中使用的肿瘤细胞系raji、romas、daudi稳定高表达cd47。
38.图6显示了通过流式细胞术检测的本发明中使用的肿瘤细胞系raji、romas、daudi可与外泌蛋白s47稳定结合。
39.图7显示了通过蛋白免疫印迹检测由cd19-s47-car转染的t细胞稳定表达外泌蛋白s47。
40.图8显示了通过流式细胞术检测的将由载体19-car和cd19-s47-car转染的人外周血淋巴细胞与肿瘤细胞系共培养24小时之后，t细胞分化分型情况。
41.图9通过细胞毒性实验显示了由载体19-car和cd19-s47-car转染的人外周血淋巴细胞对肿瘤细胞系raji、romas、daudi的裂解作用。
42.图10显示了通过流式细胞术检测的将载体19-car和cd19-s47-car转染的人外周血淋巴细胞与肿瘤细胞系raji共培养5h后il-2和tnf-α的表达情况。
43.图11显示了外泌蛋白s47对巨噬细胞吞噬能力的促进作用。
44.图12显示了cd19-s47-car阻断肿瘤细胞抗吞噬作用的原理。
具体实施方式
45.为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的
条件。
46.实施例1
47.本实施例提供一种嵌合抗原受体，由信号肽、抗原结合片段、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域、胞内域、自剪切序列、信号肽和抗cd47单链抗体依次串联而成。
48.在具体的实施方案中，所述抗原结合片段识别和结合的抗原为肿瘤相关抗原；所述肿瘤相关抗原可以选自cd19、cd20、cd22、cd30、cd123、bcma或her2；在一个优选的方案中，所述肿瘤相关抗原为cd19，所述抗原结合片段为抗cd19单链抗体(scfv)。
49.在具体的实施方案中，所述信号肽选自cd8α信号肽、il-2信号肽或gm-csf信号肽；在一个优选的方案中，第一信号肽选自cd8α信号肽，第二信号肽选自gm-csf信号肽。
50.在具体的实施方案中，所述铰链区选自cd8α铰链区或fcriiiα受体；在一个优选的方案中，所述铰链区选自cd8α铰链区。
51.在具体的实施方案中，所述跨膜区选自t细胞受体亚基、cd8α亚基、cd8β亚基、cd8δ亚基、cd4跨膜结构域或cd28跨膜结构域；在一个优选的方案中，所述跨膜区选自cd8α亚基。
52.在具体的实施方案中，所述胞内共刺激信号域选自4-1bb、cd27、cd28、icos、ox40、nkg2d或b7-h3胞内共刺激信号域中的一种；在一个优选的方案中，所述胞内共刺激信号域选自4-1bb。
53.在具体的实施方案中，所述胞内域选自cd3ζ。
54.在具体的实施方案中，所述自剪切序列选自t2a或p2a；在一个优选的方案中，所述自剪切序列选自t2a。
55.图1为其中一个优选方案的嵌合抗原受体的结构示意图。
56.实施例2
57.本实施例提供嵌合抗原受体t细胞的制备，嵌合抗原受体的载体采用其中一个优选方案，为了便于检测，在cd47单链抗体的末尾连接ha标签，该嵌合抗原受体记为cd19-s47-car，也可选用6
×
his、fc、myc、gst或flag等其他标签。同时，设置不包括自剪切序列、信号肽和抗cd47单链抗体的嵌合抗原受体作为对照，该嵌合抗原受体记为cd19-car。嵌合抗原受体cd19-s47-car和cd19-car载体设计方案如图2所示。其中所述采用的序列如下：
58.cd8αsp(核苷酸序列)：
59.atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggccc(seq id no.1)；
60.cd8αsp(氨基酸序列)：
61.malpvtalllplalllhaarp(seq id no.2)；
62.cd19 scfv(核苷酸序列)：
63.gacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatgggg
tagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctca(seq id no.3)；
64.cd19 scfv(氨基酸序列)：
65.diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvss(seq id no.4)；
66.cd8 hinge(核苷酸序列)：
67.accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaagcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat(seq id no.5)；
68.cd8 hinge(氨基酸序列)：
69.tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd(seq id no.6)；
70.cd8 tm(核苷酸序列)：
71.atctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgt(seq id no.7)；
72.cd8 tm(氨基酸序列)：
73.iyiwaplagtcgvlllslvitlyc(seq id no.8)；
74.4-1bb(核苷酸序列)：
75.aagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactg(seq id no.9)
76.4-1bb(氨基酸序列)：
77.krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seq id no.10)
78.cd3ζ(核苷酸序列)：
79.cgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctaccagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcgg(seq id no.11)
80.cd3ζ(氨基酸序列)：
81.rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq id no.12)
82.t2a(核苷酸序列)：
83.gagggcaggggaagtcttctaacatgcggggacgtggaggaaaatcccggcccc(seq id no.13)
84.t2a(氨基酸序列)：
85.egrgslltcgdveenpgp(seq id no.14)
86.gm-csf sp(核苷酸序列)：
87.atgtggctgcagagcctgctgctcttgggcactgtggcctgcagcatctct(seq id no.15)
88.gm-csf sp(氨基酸序列)
89.mwlqsllllgtvacsis(seq id no.16)
90.cd47 scfv(核苷酸序列)：
91.gacgtggtcatgacacagagccctctgagcctgcctgtgacacctggcgaacctgccagcatcagctgtagaagcagccagagcatcgtgtacagcaacggcaacacctacctcggctggtatctgcagaagcccggccagtctcctaagctgctgatctacaaggtgtccaaccggttcagcggcgtgcccgatagattttctggcagcggctctggcaccgacttcaccctgaagatctccagagtggaagccgaggacgtgggcgtgtaccactgttttcagggcagccacgtgccatacacctttggcggcggaacaaaggtggaaatcaagggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggttcagctggttcagtctggcgccgaagtgaagaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctacacctttaccaactacaacatgcactgggtccgacaggcccctggacaaggactggaatggatcggcacaatctaccccggcaacgacgacaccagctacaaccagaagttcaaggacaaggccacactgaccgccgacaagagcacaagcaccgcctacatggaactgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactattgtgccagaggcggctacagagccatggactattggggccagggcaccctggttaccgttagctct(seq id no.17)
92.cd47 scfv(氨基酸序列)：
93.dvvmtqsplslpvtpgepasiscrssqsivysngntylgwylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyhcfqgshvpytfgggtkveikggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftnynmhwvrqapgqglewigtiypgnddtsynqkfkdkatltadkststaymelsslrsedtavyycarggyramdywgqgtlvtvss(seq id no.18)
94.ha(核苷酸序列)：
95.tacccatacgacgtaccagattacgct(seq id no.19)
96.ha(氨基酸序列)
97.ypydvpdya(seq id no.20)
98.靶向抗原同时外泌cd47抗体的免疫细胞的制备方法，具体如下：
99.1.慢病毒载体的构建
100.全基因合成所述嵌合抗原受体核苷酸序列后，经pcr扩增该序列，经axygen凝胶回收试剂盒回收扩增片段，与经过限制性内切酶bstbi和xbai酶切的载体pcdh-ef1-mcs表达载体进行同源重组连接，合成了cd19-car单靶点和cd19-s47-car双靶点表达载体。将5ul连接产物加入到50ul感受态细胞dh5α中，冰上静置30min，42℃水浴锅热激90s后置于冰上冷却2min，加入500ul新鲜无抗lb液体培养基，37℃摇床以150rpm/min震荡45min，涂布于含有氨苄青霉素的lb固体平板上，在37℃培养箱中过夜培养。待单克隆菌落长出后，挑取6个单克隆菌落，加入500ul含氨苄青霉素的lb液体培养基，在37℃摇床中震荡培养4h后取部分送往公司测序，并根据测序结果挑选出序列比对无误的样品，获得cd19-car单靶点和cd19-s47-car双靶点重组表达载体，并在lb液体培养基中大量培养，随后进行无内毒素质粒抽提。
101.2.慢病毒载体病毒液的制备
102.使用lipofectamine 3000将步骤1中所得重组质粒与包装质粒pmd2.g,pspax2按照4:3:1的比例混合后转染293t细胞，转染6h后更换新鲜培养基，分别收集培养24h和52h的细胞上清液，与病毒浓缩液按1:4混合于4℃孵育过夜后高速离心浓缩病毒液，弃去上清，使用pbs溶液重悬病毒沉淀，获得cd19-car和cd19-s47-car病毒液。
103.3.嵌合抗原受体t细胞的制备
104.取健康供者的新鲜外周血，通过密度梯度离心法分离新鲜的外周血单个核细胞，并使用cd3阳性分选磁珠(购自stem cell)分离t细胞，用x-vivo无血清培养基(购自lonza)重悬t细胞并加入cd3/cd28刺激抗体(购自stem cell)、il-2、il-7和il-15，在37℃、5％co2培养箱中培养24h后加入步骤2中所得的病毒液以moi＝10进行转染，分别获得cd19-cart和cd19-s47-cart细胞，转染3天后检测car-t细胞转染率。t细胞始终以1
×
10^6/ml的密度进行培养。同时以moi＝1的病毒液转染293t细胞，在37℃、5％co2培养箱中培养，5天后收集细胞，通过rt-pcr检测病毒转染的293t内car片段的表达情况，结果如图3所示，cd19-293t细胞稳定表达cd19-car片段，而cd19-s47-293t细胞稳定表达抗cd19-car和抗cd47-car片段。
105.实验例
106.1.利用流式细胞术检测car蛋白的表达
107.取适量实施例2中所得的cd19-cart，cd19-s47-cart细胞和对照t细胞，用pbs清洗2次后分别用50ul pbs溶液重悬细胞，并加入0.5ul car-green(购自上海雅科生物公司)，4℃避光孵育30min后清洗细胞2次，加入200ul pbs重悬细胞，使用bd cytoflex上机检测，检测结果如图4所示。对照t细胞几乎检测不到car分子的表达，cd19-cart和cd19-s47-cart细胞的抗cd19 scfv表达率分别为50.4％和60.4％。
108.2.外泌蛋白s47与靶细胞的结合检测
109.取实施例2中所得的cd19-cart，cd19-s47-cart细胞和对照t细胞，感染5天后分别收取cd19-cart，cd19-s47-cart细胞和对照t细胞的细胞上清液备用，将高表达cd47的淋巴瘤细胞株raji、daudi和romas(图5)用pbs清洗2次后分别与上清液与37℃共同孵育30min，离心弃去上清，用pbs洗2次后分别用50ul pbs重悬，并加入0.5ul的抗ha-apc流式抗体(购自biolegend)，室温避光孵育25min后清洗细胞2次，加入200ul pbs重悬细胞，使用bd cytoflex上机检测，检测结果如图6所示。三个淋巴瘤细胞株raji、daudi和romas与外泌蛋白s47的结合率均接近100％。
110.3.蛋白免疫印迹实验检测外泌蛋白s47的表达量
111.取实施例2中所得的cd19-cart，cd19-s47-cart细胞和对照t细胞，感染5天后分别收取cd19-cart，cd19-s47-cart细胞和对照t细胞的细胞上清液备用，使用高效蛋白沉淀试剂盒(购自invent)沉淀上清液中的蛋白，通过bca定量测得蛋白浓度，按比例加入5xloadingbuffer，100℃加热10min后取30ug的蛋白上样到sds page孔中，80v电泳30min后120v电泳60min分离蛋白样品，接着切胶转膜，衡流250ma，2h，将胶上的蛋白转移到pvdf膜上。转膜后在5％脱脂奶粉中室温封闭2h，后置于鼠源抗ha单克隆抗体(1:1000,购自bioworld)和鼠源抗α-turbulin单克隆抗体(1:10000,购自proteintech)中于4℃孵育过夜，pbst洗涤三次后，用hrp-羊抗鼠fc(1:10000)室温孵育1h。pbst洗涤三次后使用fdbio-dura ecl发光液进行显色，使用biorad imaging syatem拍照，结果如图7所示。
112.4.嵌合抗原受体t细胞的分化功能检测
113.取实施例2中所得的cd19-cart，cd19-s47-cart细胞和对照t细胞，感染5天后进行t细胞分化功能检测。cd19-cart，cd19-s47-cart细胞和对照t细胞与靶细胞raji按照1:1的效靶比铺于96孔板，在37℃、5％co2培养箱中培养24h后，收集细胞，用pbs洗2次后分别用50ul pbs重悬，并加入0.5ul的car-green、抗cd8-percp.cy5.5、抗cd45ro-apc和抗ccr7-pe
流式抗体(购自biolegend)，室温避光孵育25min后清洗细胞2次，加入200ul pbs重悬细胞，使用bd cytoflex上机检测，检测结果如图8所示，cd19-s47-cart细胞均较cd19-cart具有较高比例的中央记忆t细胞(tcms)，较低比例的效应记忆t细胞(tems)。
114.5.嵌合抗原受体t细胞的细胞毒性杀伤实验
115.取实施例2中所得的cd19-cart，cd19-s47-cart细胞和对照t细胞，感染5天后取细胞进行靶细胞杀伤实验，同时取淋巴瘤细胞株raji、daudi和romas，调整靶细胞密度为1.6
×
10^5/ml，50ul每孔接种于圆底96孔板，并分别按照20:1,10:1,5:1,2.5:1的效靶比接种t细胞，使用非放射性细胞毒性检测试剂盒(购自promega)进行细胞杀伤效果检测，具体操作参考试剂盒说明书，实验结果如图9所示。对于靶细胞raji,romas,daudi,cd19-s47-cart细胞均较cd19-cart具有更强的肿瘤杀伤功能。
116.6.嵌合抗原受体t细胞的细胞因子分泌情况检测
117.取实施例2所得的cd19-cart，cd19-s47-cart细胞和对照t细胞，感染5天后将t细胞与靶细胞按照效靶比1:1进行铺板，同时加入brefeldin a，于37℃、5％co2培养箱中培养5h后收集细胞进行抗cd8-percp.cy5.5流式抗体染色，用pbs清洗2次后进行固定破膜，以及抗il-2-apc和抗tnf-apc流式抗体染色，室温避光孵育25min后清洗细胞2次，加入200ul pbs重悬细胞，使用bd cytoflex上机检测，检测结果如图10所示。cd19-s47-cart细胞均较cd19-cart具有更强的il-2和tnf-α分泌能力。
118.7.流式细胞术检测外泌蛋白s47对巨噬细胞吞噬能力的影响
119.取健康供者的新鲜外周血，通过密度梯度离心法分离新鲜的外周血单个核细胞，并使用cd14阳性分选磁珠(购自stem cell)分离单核细胞，在含10％胎牛血清的1640培养基中补充m-csf(终浓度为25ng/ml)，在37℃、5％co2培养箱中诱导培养5天后可获得成熟的巨噬细胞。将靶细胞raji进行cfse染色后计数，同时取实施例2中所得的cd19-cart，cd19-s47-cart细胞和对照t细胞，感染5天后将巨噬细胞，t细胞和raji按照1:2:2的比例进行铺板，培养24h后收集细胞，用pbs清洗2次后进行流式抗体抗cd14-percp cy5.5染色，室温避光孵育25min后清洗细胞2次，加入200ul pbs重悬细胞，使用bd cytoflex上机检测，检测结果如图11所示。可外泌cd47单链抗体的cd19-s47-cart细胞可以明显提高巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力。
120.图12显示了cd19-s47-car阻断肿瘤细胞抗吞噬作用的原理。cd19-s47-cart到达肿瘤组织时，可与肿瘤细胞上的cd19结合并释放穿孔素，同时外泌抗cd47单链抗体与肿瘤细胞上的cd47结合，从而阻断肿瘤细胞的cd47与巨噬细胞的sirpα结合，也就是阻断肿瘤细胞的抗吞噬途径，并且影响巨噬细胞的极化方向。同时，还可能对调节性t细胞(tregs)、骨髓来源抑制细胞(mdscs)等的数量和功能产生影响。
121.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。