一种应用气溶胶早期预警粮谷中真菌毒素污染的方法及应用与流程

1.本发明涉及一种食品检测方法，特别涉及一种应用气溶胶早期预警粮谷中真菌毒素污染的方法及应用。


背景技术：

2.粮食是安天下、稳民生的基础物质。目前，粮食安全已经纳入国家战略。在世界贸易摩擦不断加剧的新形势下，保障国家粮食安全是长期而艰巨的任务。
3.真菌毒素一直是世界粮食安全的重大突出问题。真菌毒素是由真菌次生代谢产生的有毒物质，其广泛存在并难以降解，人和动物一次性摄入含一定量的真菌毒素的食物会发生急性中毒，甚至发生突然死亡；真菌毒素被人或动物摄入后很难排出体外，容易在体内富集产生严重的致癌、致畸和致突变作用。目前，针对真菌毒素导致的食品安全问题监控主要依靠真菌毒素含量的检测，检测方法主要是理化方法，包括气相色谱、液相色谱等，但这些检测方法都存在检测设备昂贵、检测需要昂贵的标准品、检测成本高、操作复杂、检测周期长等问题；同时受毒素提取效率和检测灵敏度等的限制，这些检测方法仅在毒素积累到一定浓度的情况下才能够检出，其检测结果仅可作为事后处理提供技术支撑，无法实质性挽回经济损失、降低其健康危害。
4.粮谷中的真菌毒素主要是粮谷储存过程中温度和湿度等环境条件变化，加上粮谷本身的新陈代谢等原因，粮谷中有真菌生长，真菌生长繁殖到一定程度，开始产生真菌毒素，对人体产生更大的危害。粮谷表面均携带一定量的真菌，如果样品被产毒真菌污染，但由于温湿度等条件不适宜产毒真菌的生长，或不适合毒素合成，此时样品中无法检测到真菌毒素，一旦条件适宜，这类样品中的真菌大量快速繁殖并产生大量的真菌毒素。因此，针对于真菌毒素污染导致的食品安全问题，其关键在于开展真菌毒素产生的源头——产毒真菌的检测。目前针对粮谷中真菌污染检测方法较少，对于产毒真菌的检测仍主要依赖于形态学分析，参考标准只有《gb4789.16-2016食品安全国家标准食品微生物学检验常见产毒霉菌的形态学鉴定》和《sn/t 1035-2011进出口食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检测方法》，这些检测方法都需要进行真菌培养，检测过程需要10～20天，试验操作繁冗，耗时费力，而且极易因近缘种间的形态相似性而导致真菌鉴定结果的误判，需要检测人员具有丰富的鉴定经验，且方法仅限于对可能产毒的真菌进行分类鉴定至“种”，不能实质性探究其是否产毒，靶向性不强。最重要的是，这些检测方法均受采样量的限制，不能全面检测、评判储备粮仓各部位或吨位级进出口粮谷真实的污染情况。因此，对粮谷中真菌毒素的污染情况进行监控，研发早期风险预测技术，实现粮食安全风险爆发前早预测、扩散前早发现、危害前早处置对确保粮食质量安全具有重要意义。
5.空气中气溶胶(aerosol)是指一种固态或液态的各种微粒状化学物质及其悬浮在各种气体化学介质中所形成的分散体系。生物气溶胶主要包括细菌、霉菌孢子、寄生虫卵、各种原生菌类毒素和它们的细胞碎片以及它们的分泌物等。早在1833年，就有国外学者报道采集到了空气中的霉菌孢子；1908年science报道了第1篇空气中有关细菌的液体撞击采
集的新方法。在粮谷食品安全早期监测及预警领域，由于现有的产毒真菌及真菌毒素检测方法并不能满足粮食真菌毒素早期预警的需要，当检测出粮谷样品中有超过限量的真菌毒素时，真菌毒素已经污染了大部分粮食。但是如何应用气溶胶进行粮谷霉变及真菌毒素早期监测的相关研究却未有报道。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的不足之处，为了克服现有技术存在的检测周期长、检测成本高、需要昂贵的仪器和标准品、以及无法及时准确的进行粮谷霉变及真菌毒素早期监测等主要问题。本发明建立了一种应用气溶胶早期预警粮谷中真菌毒素污染的方法，采用在粮谷装卸、中转、加工场所中收集环境空气中气溶胶，应用实时荧光pcr技术快速检测粮谷霉变产生的气溶胶中是否有产毒素真菌，在真菌毒素未产生前及产生早期预测粮谷及其制品受产毒真菌污染并产生真菌毒素的风险。验证试验结果表明，本发明建立的应用气溶胶早期预警粮谷中真菌毒素污染的方法准确率高，灵敏稳定性好，明显优于传统的粮谷中真菌培养鉴定方法及粮谷中真菌毒素液相和气相等理化检测方法，实现粮谷中真菌毒素污染的早期监测。
7.为了实现粮谷中真菌毒素污染早期风险预警，将空气气溶胶中真菌采集与产毒真菌分子生物学快速检测技术相结合，利用液体撞击式空气微生物采样器采集粮谷在装卸、中转、加工等关键环节所产生的生物气溶胶，特异性检测气溶胶中的真菌毒素生物合成关键调控基因，利用实时荧光pcr技术快速检测气溶胶中是否存在产毒真菌，在真菌毒素合成早期甚至未合成前评判粮谷及制品受产毒真菌污染的风险，有效提高对真菌毒素危害的预测能力，预防毒素污染可能引发的经济损失及健康危害，最大程度减轻其可能造成的不良后果。
8.本发明建立了玉米霉变模型，收集了玉米霉变产生的微生物气溶胶，采用高通量测序技术分析并确定气溶胶中真菌种类与粮谷样品中真菌种类相一致；针对粮谷中主要产毒真菌，包括黄曲霉、寄生曲霉、黄色镰孢菌和串珠镰孢菌，建立产毒真菌污染粮谷样品模型，模拟粮谷装卸过程，收集微生物气溶胶，采用实时荧光pcr方法快速检测气溶胶中是否存在产毒真菌。
9.本发明为了验证所建立的气溶胶中产毒真菌检测方法可用于粮谷真菌毒素污染的早期预警，对受真菌污染但尚未检测到真菌毒素的样品进行验证试验。第一步，选取已受真菌污染的粮食(玉米、大米、花生)实际检测样品，利用液体撞击式空气微生物采样器收集微生物气溶胶，检测气溶胶中是否含有产毒真菌，对真菌毒素的产生进行早期预警；第二步，对于霉变样品进行霉变加速培养，采用高效液相色谱或高效液相色谱串联质谱法检测样品中是否存在真菌毒素，与第一步中气溶胶早期检测结果相比较，验证本发明所述粮谷中真菌毒素污染发生前的早期预警方法的可行性。
10.本发明的目的是提供一种粮食储存环境中应用气溶胶早期预警真菌毒素污染的方法。包括如下步骤：采集粮食储存环境中的生物气溶胶；分别取采样器中收集到的气溶胶采集液及同一环境下的已污染真菌毒素的样品，应用实时荧光pcr技术快速检测气溶胶中是否存在产毒真菌，比较气溶胶和已污染真菌毒素样品中的产毒真菌的一致性；根据气溶胶中产毒真菌的鉴定和实时荧光pcr技术检测结果判断粮谷及制品中产毒真菌的污染情
况。实现粮谷中真菌毒素污染早期预警的目的。本发明具有快速灵敏等优点，满足了粮谷中真菌毒素污染早期迅速准确预警的需求。
11.所述的采集粮食环境中的生物气溶胶是通过液体撞击式空气微生物采样器进行采集的；还可以辅以采用gb4789.16-2016和sn/t 1035-2011方法进行产毒真菌的鉴定。
12.进一步优选的，本发明采用真菌基因组高通量测序方法同时对气溶胶中收集到的真菌和已污染真菌毒素的粮食样品中的真菌进行基因组测序，比较气溶胶中真菌组分与已污染真菌毒素的粮食样品中的真菌组分是否相同，经验证二者相同，进而判断气溶胶中真菌检测是可以真实反映样品中真菌污染情况。基于上述原因，本发明创新性提出监测粮食环境中气溶胶中的产毒真菌，为粮谷中真菌毒素污染迅速准确预警提供依据。
13.进一步优选的，本发明建立了包括几种主要真菌的分子生物学快速检测方法，该方法所用到的真菌毒素生物合成关键调控基因及其核苷酸序列如下：产黄曲霉毒素真菌的aflr 基因(seq id no.25)、omt-1基因(seq id no.26)、ver-1基因(seq id no.27)；产伏马毒素真菌的fum1基因(seq id no.28)、fum5基因(seq id no.29)；产玉米赤霉烯酮毒素真菌的pks4基因(seq id no.30)、pks13基因(seq id no.31)；产赭曲霉毒素真菌的otanpspn基因(seq id no.32)。
14.进一步优选的，所述荧光pcr方法采用的引物和荧光探针如seq id no.1-24所述。
15.进一步优选的，本发明建立了粮食环境空气气溶胶中真菌采样和收集方法；并且优化了微生物气溶胶采集液，选定沙氏液体培养基作为真菌采集液，保证气溶胶中的真菌在采集过程中受到的损伤最小，真菌生长状态更好，更能反映样品中真菌的真实生长状态。
16.进一步优选的，本发明提供了一种粮食气溶胶中产毒真菌的实时荧光pcr快速检测方法，精准鉴定气溶胶中真菌种类，精准评判粮谷及制品中受真菌及其毒素污染的风险。精准鉴定粮谷中产毒真菌种类的快速检测方法，评判粮谷及制品中受产毒真菌污染的风险。
17.综上，本发明建立了应用于粮谷装卸、出仓、入仓、中转、加工场所，通过检测气溶胶中是否存在产毒真菌进行粮谷真菌毒素污染早期监测预警的新方法。利用液体撞击式空气微生物采样器采集微生物气溶胶，将气溶胶中的真菌收集到采集液中；采用高通量测序技术分析确定气溶胶中真菌种类与已污染真菌毒素的粮谷样品中真菌种类相一致；应用实时荧光pcr方法检测气溶胶样品中是否存在产毒真菌；气溶胶中可检测到粮谷表面的产黄曲霉毒素真菌、产玉米赤霉烯酮毒素真菌、产伏马毒素真菌、产赭曲霉毒素真菌等，对粮谷中真菌毒素污染进行精准预测，方法灵敏准确、可操作强，实现早期预警。
18.本发明的具体技术方案如下：
19.一种收集检测粮食储存场所的环境气溶胶中的真菌，进行粮食真菌毒素污染早期预警及监测的新方法。其包括如下步骤：采集粮食环境中的生物气溶胶：分别取采样器中收集到的气溶胶采集液及同一环境下的霉变样品，按照真菌计数标准进行真菌计数，利用实时荧光pcr技术检测气溶胶中是否存在真菌，并检测真菌种类；比较气溶胶和霉变样品中的真菌浓度的一致性；根据实时荧光pcr技术检测结果判断粮谷及制品中真菌污染情况。
20.进一步优选的，所述采集粮食环境中的生物气溶胶是通过生物气溶胶自动监测仪采集。且采用gb/t4789.15-2016和gb/t4789.16-2016方法进行真菌计数和种类鉴定。
21.进一步优选的，所述霉变样品同一环境中气溶胶中产毒素真菌主要包括黄曲霉、
烟曲霉、禾谷镰孢菌、轮枝镰孢菌、赭曲霉。
22.进一步优选的，所述利用实时荧光pcr技术检测气溶胶中真菌的方法还包括如下步骤：将收集到的气溶胶采集液置于29-32℃培养过夜，用0.45μm的无菌滤膜过滤，将微生物富集到无菌滤膜上；采用ctab法或真菌dna提取试剂盒提取滤膜上真菌总dna作为检测模板。
23.进一步优选的，所述荧光pcr方法采用的引物和荧光探针如seqidno.1-24所述。采用实时荧光pcr方法，对气溶胶中的真菌进行检测，精准鉴定真菌的种类，精准评判粮谷及制品中受真菌污染的风险；实现粮谷及制品中真菌毒素污染的早期预警，及时有效地预防控制粮谷及制品中真菌毒素的危害。
24.进一步优选的，所述实时荧光pcr反应体系，每25μl反应体系中包含：2
×
premixextaq
tm
12.5μl，10μmol/l正向引物0.5μl，10μmol/l的反向引物0.5μl，5μmol/l荧光探针1μl，roxpeferencedyeⅱ0.5μl，100μg/ml模板dna2μl，灭菌双蒸水8μl。
25.进一步优选的，所述实时荧光pcr反应条件：95℃预变性10s(1个循环)；95℃变性5s，60℃退火/延伸34s(40个循环)，荧光阈值为设备默认值。
26.本发明另一方面保护所述方法在检测粮谷及制品中真菌污染的应用。
27.进一步优选的，所述的应用，其包括对粮谷及制品中真菌污染的早期预警，预防控制粮谷及制品中真菌及其毒素的危害。
28.进一步优选的，所述的应用，其包括应用于粮食储存或者装卸、出仓、入仓、中转、加工等关键场所，进行粮食霉变早期监测预警，通过监测气溶胶中是否存在产毒真菌进行粮谷真菌毒素污染早期监测及预警的新思路和新方法。
29.有益效果
30.1.本发明所述的微生物气溶胶采集方法，采用高通量测序技术分析确定气溶胶中真菌种类与粮谷样品中真菌种类相一致。
31.2.本发明采用实时荧光pcr方法，进一步对气溶胶中产毒真菌进行检测，精准鉴定粮谷中产毒真菌的种类，评判粮谷及制品中受产毒真菌污染的风险。
32.3.本发明所述的粮谷气溶胶中产毒真菌的收集及检测技术，应用于粮谷装卸、中转、加工等关键环节，可在真菌毒素合成前或微量积累时，评判粮谷及制品受产毒真菌污染的风险，实现粮谷中真菌毒素污染发生前的早期预警，便于相关部门采取干预措施及时有效地防控真菌毒素危害的产生。
附图说明
33.图1是根据本发明的霉变玉米及气溶胶中真菌群落比例分布气泡图；
34.图2是根据本发明的模拟产黄曲霉毒素真菌污染样品气溶胶中产毒真菌实时荧光pcr检测结果；
35.图3是根据本发明的模拟产玉米赤霉烯酮毒素真菌污染样品气溶胶中产毒真菌实时荧光pcr检测结果；
36.图4模拟产伏马毒素真菌污染样品气溶胶中产毒真菌实时荧光pcr检测结果；
37.图5模拟产赭曲霉毒素真菌污染样品气溶胶中产毒真菌实时荧光pcr检测结果；
38.图6污染赭曲霉毒素样品hplc谱图；
39.图7污染黄曲霉毒素b1样品hplc谱图；
40.图8污染伏马毒素伏马毒素样品hplc-ms/ms谱图；
41.图9污染玉米赤霉烯酮毒素样品hplc谱图。
具体实施方式
42.下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
43.本发明中，除非另有其他明确说明，否则百分比、百分含量均以质量计。如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。
44.真菌毒素生物合成关键调控基因序列如下：产黄曲霉毒素真菌的aflr基因(seq idno.25)、omt-1基因(seq id no.26)、ver-1基因(seq id no.27)；产伏马毒素真菌的fum1 基因(seq id no.28)、fum5基因(seq id no.29)；产玉米赤霉烯酮毒素真菌的pks4 基因(seq id no.30)、pks13基因(seq id no.31)；产赭曲霉毒素真菌的otanpspn基因 (seq id no.32)。
45.实施例中实时荧光pcr方法具体为：
46.引物及荧光探针如表1：
47.表1.引物及荧光探针
48.[0049][0050]
所述实时荧光pcr反应体系：
[0051]
每25μl反应体系中包含：2
×
premixextaq
tm 12.5μl，10μmol/l正向引物0.5μl， 10μmol/l的反向引物0.5μl，5μmol/l荧光探针1μl，rox reference dyeⅱ0.5μl，100μg/ml 模板dna 2μl，灭菌双蒸水8μl。
[0052]
实时荧光pcr反应条件：95℃预变性10s，1个循环；95℃变性5s，60℃退火/延伸34s； 40个循环，荧光阈值为设备默认值。
[0053]
实施例1霉变玉米与气溶胶中真菌群落结构分析比较
[0054]
模拟霉变玉米的装卸过程，用液体撞击式空气微生物采样器采集空气中的气溶
胶，将气溶胶中的微生物收集到采集液中，分别以沙氏液体培养基(maize_am)和无菌水 (maize_aw)为采集液。利用高通量测序技术对霉变玉米样品表面真菌群落结构和气溶胶中真菌群落结构进行分析、比较。从霉变玉米及气溶胶中真菌群落比例分布气泡图可见(图 1)，以沙氏液体培养基(maize_am)为采集液收集到的真菌种类与霉变玉米样品表面真菌种类一致，而以无菌水(maize_aw)为采集液收集到的真菌，未检测到diaporthe属和 kabatiella属的真菌，结果显示，最佳收集液为沙氏液体培养基(maize_am)。图1霉变玉米及气溶胶中真菌群落比例分布气泡图。
[0055]
实施例2模拟产黄曲霉毒素真菌污染样品与气溶胶中产毒真菌检测分析
[0056]
用产生黄曲霉毒素的标准菌株黄曲霉cgmcc3.4408和寄生霉菌cgmcc3.6155菌体混悬液喷洒玉米粒，将适量产黄曲霉毒素真菌污染玉米粒与未经真菌污染的玉米粒混合均匀，经高效液相色谱法未检测到黄曲霉毒素，表明模拟样品中黄曲霉毒素含量较低。
[0057]
模拟装卸过程，采用液体撞击式空气微生物采样器收集微生物气溶胶，采集液过夜培养、过滤后提取真菌总dna，实时荧光pcr方法检测气溶胶样品中是否存在产黄曲霉毒素真菌。验证结果表明，气溶胶样品中调控产生黄曲霉毒素的aflr、omt-1、ver-1基因检测结果阳性，显示气溶胶中可检测到粮谷表面的产黄曲霉毒素真菌。如图2模拟产黄曲霉毒素真菌污染样品气溶胶中产毒真菌实时荧光pcr检测结果。
[0058]
实施例3模拟产玉米赤霉烯酮毒素真菌污染样品与气溶胶中产毒真菌检测分析
[0059]
用产玉米赤霉烯酮毒素的标准菌株黄色镰孢菌(atcc 204257)菌悬液喷洒玉米粒，建立产玉米赤霉烯酮毒素真菌污染的玉米模型，将污染的玉米粒埋藏于模拟仓中，模拟仓中的原有的玉米未被真菌污染。随机抽取玉米样品经高效液相色谱法未检测到玉米赤霉烯酮毒素，表明未抽取到真菌污染玉米样品。
[0060]
模拟装卸过程，收集微生物气溶胶，采集液过夜培养、过滤后提取真菌总dna，采用实时荧光pcr方法检测气溶胶样品中是否存在产玉米赤霉烯真菌酮毒素的真菌。验证结果表明，气溶胶样品中调控产生玉米赤霉烯真菌酮毒素的pks4基因和pks13基因检测结果阳性，显示气溶胶中可检测到粮谷表面的产玉米赤霉烯酮毒素真菌。
[0061]
如图3模拟产玉米赤霉烯酮毒素真菌污染样品气溶胶中产毒真菌实时荧光pcr检测结果。
[0062]
实施例4模拟产伏马毒素真菌污染样品与气溶胶中产毒真菌检测分析
[0063]
用低浓度的产伏马毒素的标准菌株串珠镰孢菌(atcc 204499)菌体混悬液喷洒大米，建立产伏马毒素真菌污染大米模型，经高效液相色谱法未检测到伏马毒素b1和伏马毒素 b2，表明模拟样品中伏马毒素含量较低。模拟装卸过程，收集微生物气溶胶，采集液过夜培养、过滤后提取真菌总dna，采用实时荧光pcr方法检测气溶胶样品中是否存在产伏马毒素的真菌。验证结果表明，气溶胶样品中调控产生伏马毒素的fum1基因和fum5基因和检测结果阳性，显示气溶胶中可检测到粮谷表面的产伏马毒素真菌。如图4模拟产伏马毒素真菌污染样品气溶胶中产毒真菌实时荧光pcr检测结果。
[0064]
实施例5产赭曲霉毒素污染样品与气溶胶中产毒真菌检测分析
[0065]
将适量赭曲霉毒素污染玉米粒与未经真菌污染的玉米粒混合均匀，建立赭曲霉毒素污染玉米模型，经高效液相色谱法未检测到赭曲霉毒素，表明样品中赭曲霉毒素含量较低未达到仪器检出限。模拟装卸过程，收集微生物气溶胶，采集液过夜培养、过滤后提取真
菌总dna，采用实时荧光pcr方法检测气溶胶样品中是否存在产赭曲霉毒素的真菌。验证结果表明，气溶胶样品中调控产生赭曲霉毒素的otanpspn基因检测结果阳性，显示气溶胶中可检测到粮谷表面的产赭曲霉毒素真菌。如图5模拟产赭曲霉毒素真菌污染样品气溶胶中产毒真菌实时荧光pcr检测结果。
[0066]
实施例6真菌毒素污染早期预警技术可行性验证
[0067]
粮谷表面均携带一定量的真菌，如果样品被产毒真菌污染，但由于温湿度等条件不适宜产毒真菌的生长，或不适合毒素合成，此时样品中无法检测到真菌毒素，一旦条件适宜，这类样品将面临很大的真菌毒素污染的风险。
[0068]
为了实现真菌毒素污染的早期预警，选取受霉菌污染的玉米、大米、花生实际检测样品，经高效液相色谱法未检测到真菌毒素，模拟装卸过程，利用液体撞击式空气微生物采样器收集微生物气溶胶，检测实际样品中是否含有产毒真菌；同时将霉菌污染样品进行微生物代谢加速培养实验(即将样品置于霉菌培养基上，放入适宜温湿度培养箱中培养3～10 天)，采用高效液相色谱法检测样品中的真菌毒素，与气溶胶检测结果相比较，验证本发明所述粮谷中真菌毒素污染发生前的早期预警方法的可行性。
[0069]
图6是污染赭曲霉毒素样品hplc谱图；图7是污染黄曲霉毒素b1样品hplc谱图；图8是污染伏马毒素伏马毒素样品hplc-ms/ms谱图；图9是污染玉米赤霉烯酮毒素样品hplc谱图。
[0070]
表2真菌毒素污染早期预警检测结果
[0071][0072]
综上，本发明建立了应用于粮谷装卸、中转、加工场所，通过检测气溶胶中是否存在产毒真菌进行粮谷真菌毒素污染早期监测预警的新方法。具体的，利用液体撞击式空气微生物采样器采集微生物气溶胶，将气溶胶中的真菌收集到采集液中；采用高通量测序技术分析确定气溶胶中真菌种类与粮谷样品中真菌种类相一致；应用实时荧光pcr方法检测气溶胶样品中是否存在产毒真菌；气溶胶中可检测到粮谷表面的产黄曲霉毒素真菌、产玉米赤霉烯酮毒素真菌、产伏马毒素真菌、产赭曲霉毒素真菌等，对粮谷中真菌毒素污染进行精准预测，方法灵敏准确、可操作强，实现粮谷储藏和生产加工过程中真菌毒素污染的早期预警。
[0073]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本
发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。