一种基于金属有机框架仿生矿化提高病毒样颗粒热稳定性的方法

1.本发明涉及一种提高病毒样颗粒热稳定性的方法，尤其涉及一种基于金属有机框架仿生矿化提高病毒样颗粒热稳定性的方法。本发明属于医药技术领域。


背景技术：

2.近年来，病毒样颗粒(virus like particles,vlps)在疾病预防、控制、免疫治疗和纳米技术研究领域等方面发挥着至关重要的作用。vlps由病毒体的主要结构蛋白组成，不含病毒基因组具有较高的安全性，而且vlps具有天然病毒相似的结构，易被抗原呈递细胞(apcs)识别和摄取，进而诱发良好的免疫反应，表现出优异的免疫原性和反应原性。因此，vlps因其自身安全性、生产简便性以及免疫特性而成为现代疫苗研究的热点。
3.目前，关于vlps疫苗相关的报道已超过110种。其中，乙型肝炎病毒(hbv)和人乳头瘤病毒(hpv)vlps疫苗已获批并用于预防相关疾病。
4.口蹄疫(foot-and-mouth,fmd)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth virus,fmdv)引发的一种严重的、高度传染性疾病，主要感染偶蹄动物，每次暴发都造成巨大的经济损失，严重影响畜牧业的健康发展。现在很多国家都通过疫苗接种来控制fmd。
5.灭活疫苗在控制fmd方面做出重要贡献，但生产中存在动用活毒及散毒等风险。fmd vlps不仅具有良好的安全性与诱导较高的免疫反应，而且可以区分感染动物与免疫动物，进一步促进fmd的净化。
6.vlps与天然病毒一样，需要在低温下保存以保持其完整性和免疫效力。因此，几乎所有市售疫苗，包括基于vlps的疫苗，从生产到交付都需要持续冷藏以保证疫苗效力，冷藏运输与保存约占疫苗总成本的80％。为此，许多研究致力于提高疫苗的热稳定性，以延长储存期，减少对冷链的依赖。
7.仿生矿化已被开发为提高疫苗热稳定性的有效策略，例如，使用钙矿化、二氧化硅矿化来保护vlps,以提高其稳定性。金属有机骨架(metal organic frame,mof)具有在温和条件下易于合成、化学性质稳定、良好生物相容性和热稳定性等优点，有望成为稳定和提高蛋白质稳定性的另一种矿化方法。具体来说，以甲基咪唑作为连接体，锌离子等金属元素离子作为中心离子，通过配位作用形成mof。
8.mof被报道已作为纳米载体用于封装一些模型蛋白质与病毒，如牛血清白蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)、烟草花叶病毒(tmv)等，以提高其热稳定性。然而，使用mof作为矿化策略来提高vlps疫苗的热稳定性和免疫原性的报道较少。
9.本发明人课题组在口蹄疫病毒样颗粒疫苗方面已经研究了数十年，在矿化口蹄疫方面也具有深入的研究基础。本发明设计了一种基于沸石咪唑框架-8(zif-8)的仿生系统，该系统可为vlps提供框架保护。vlps-zif-8复合材料是通过简便的一种仿生方法制备的，具有出色的生物安全性和高温稳定性。vlps-zif-8的外壳也使vlps能够从溶酶体中逃逸并释放到细胞质中以触发良好的细胞免疫反应。体外和体内实验均表明，仿生vlps-zif-8具
有优异的热稳定性，并诱导强烈的体液和细胞免疫。
10.因此，本发明的提出为提高vlps同类疫苗产品稳定性提供了新的技术手段。


技术实现要素：

11.本发明的目的在于提供一种基于金属有机框架仿生矿化提高病毒样颗粒疫苗热稳定性的方法，用于解决现有vlps疫苗热稳定性差，需要冷藏运输的问题。并通过形成的mof进一步提高细胞摄取量及免疫应答水平。
12.为了达到上述目的，本发明提供了以下技术方案：
13.本发明的一种基于金属有机框架仿生矿化提高病毒样颗粒(virus like particles,vlps)热稳定性的方法，其包括如下步骤：
14.(1)向待包封的病毒样颗粒溶液中加入二甲基咪唑溶液，充分混匀；
15.(2)向步骤(1)的混合溶液中加入硝酸锌溶液，充分混匀进行反应；
16.(3)待步骤(2)反应完全后，再次加入二甲基咪唑溶液与硝酸锌溶液进行混合，反应20min；
17.(4)待步骤(3)反应完全，超声分散后加入高浓度的二甲基咪唑溶液与高浓度的硝酸锌溶液，混合均匀，反应1-3h，优选为1h；
18.(5)待步骤(4)完成，通过离心收集复合物，即得到具有热稳定性的金属有机框架包封的病毒样颗粒。
19.其中，优选的，所述的病毒样颗粒为o型口蹄疫病毒样颗粒、a型口蹄疫病毒样颗粒、猪细小病毒样颗粒、犬细胞病毒样颗粒、猪圆环病毒样颗粒、猪塞内卡病毒样颗粒、猪水泡病毒样颗粒、南非1型口蹄疫病毒样颗粒、南非2型口蹄疫病毒样颗粒、南非3型口蹄疫病毒样颗粒中的一种，更优选的，所述的病毒样颗粒为o型口蹄疫病毒样颗粒。
20.其中，优选的，步骤(1)、步骤(3)中，所述的二甲基咪唑溶液的浓度为80-120mm，所述的病毒样颗粒溶液与二甲基咪唑溶液的体积比为1:4.5；更优选的，所述的二甲基咪唑溶液的浓度为80mm。
21.其中，优选的，步骤(1)中所述的病毒样颗粒溶液中病毒样颗粒的含量为300-1000μg/ml，更优选的，病毒样颗粒的含量为400-600μg/ml。
22.其中，优选的，步骤(2)、步骤(3)中，所述的硝酸锌溶液的浓度为20-30mm，所述的病毒样颗粒溶液与硝酸锌溶液的体积比为1:0.5；优选的，所述的硝酸锌溶液的浓度为20mm。
23.其中，优选的，所述的反应的温度为0-10℃，更优选的，反应的温度为4℃。
24.其中，优选的，步骤(4)中，高浓度的2-甲基咪唑溶液的浓度为2m，高浓度的硝酸锌溶液的浓度为200mm，所述的病毒样颗粒溶液与高浓度的2-甲基咪唑溶液以及高浓度的硝酸锌溶液的体积比为1：0.1-0.2：0.05-0.1。
25.按照以上任一项所述的方法制备得到的病毒样颗粒也在本发明的保护范围之内，所述的病毒样颗粒为二甲基咪唑与硝酸锌配位形成的zif-8包封的病毒样颗粒。
26.进一步的，本发明还提出了一种病毒样颗粒热稳定性疫苗，所述的病毒样颗粒热稳定性疫苗中含有所述的病毒样颗粒。
27.其中，优选的，所述的病毒样颗粒为o型口蹄疫病毒样颗粒、a型口蹄疫病毒样颗
粒、猪细小病毒样颗粒、犬细小病毒样颗粒、猪圆环病毒样颗粒、猪塞内卡病毒样颗粒、猪水泡病毒样颗粒、南非1型口蹄疫病毒样颗粒、南非2型口蹄疫病毒样颗粒、南非3型口蹄疫病毒样颗粒中的一种，更优选的，所述的病毒样颗粒为o型口蹄疫病毒样颗粒。
28.相较于现有技术，本发明的有益效果是：
29.1、本发明选用较低浓度的二甲基咪唑与硝酸锌溶液，通过“三明治”形式形成三层金属有机框架，第一、二层不仅包封大量vlps，而且由于mof表面带有正电荷，表面吸附大量vlps，为下一层包封提供条件，这不仅提高了vlps的包封量，而且起到层层释放vlps抗原的效果。
30.2、本发明制备的zif-8金属有机框架成本低廉、方法简单、合成过程温和。
31.3、本发明矿化得到的vlps-zif-8纳米材料的沉降系数增强，起到了浓缩vlps的作用。
32.4、本发明金属有机框架zif-8在vlps表面形成一层仿生矿化层提高了vlps疫苗的耐热性，为解除冷链运输提供了可能。vlps-zif-8在较高浓度下对红细胞的裂解水平较低，显示出良好的生物安全性。zif-8提高了vlps的细胞摄取水平，这为提高vlps疫苗的免疫应答水平提供了条件。小鼠的免疫结果显示，mof矿化的vlps疫苗的细胞免疫应答水平明显提升，为提升vlps疫苗细胞免疫水平提供了新的技术手段。
附图说明
33.图1为fmdv-vlps-zif-8的形貌；
34.图2为fmdv-vlps-zif-8纳米材料矿化水平分析；
35.其中，图2a为傅红利叶红外光谱，图2b为sds-page结果与western blot结果，图2c为dot blotting结果；
36.图3为fmdv-vlps-zif-8耐热性结果；
37.图4为不同浓度的fmdv-vlps-zif-8悬液对红细胞裂解的拍摄结果；
38.图5为fmdv-vlps-zif-8细胞摄取水平；
39.其中，图5a为bhk-21细胞摄取激光共聚焦结果；图5b为bhk-21细胞摄取的western blot结果，图5c为raw264.7细胞摄取的western blot结果；
40.图6为热处理前后fmdv-vlps-zif-8引发的免疫应答水平；
41.其中，图6a是特异性抗体水平结果，图6b为淋巴细胞增殖结果，图6c为脾淋巴细胞中cd4
+
t淋巴细胞占比结果，图6d为脾淋巴中cd8
+
t淋巴细胞占比结果。
42.附图中，vlps-zif-8即为fmdv-vlps-zif-8，vlps即为fmdv-vlps，vlps-isa206即为fmdv-vlps-isa206。
具体实施方式
43.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
44.实施例1fmdv-vlps-zif-8的合成
45.(1)向1体积份的、病毒样颗粒的含量为400-600μg/ml待包封的口蹄疫病毒样颗粒
(fmdv-vlps)溶液(该病毒样颗粒按照申请号为201610929279.0，发明名称为“一种o型口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和用途”的专利申请所公开的方法制备)中加入4.5体积份的80mm的二甲基咪唑溶液，充分混匀；
46.(2)向步骤(1)的混合溶液中加入0.5体积份的20mm的硝酸锌溶液，充分混匀，反应10min；
47.(3)待步骤(2)反应完全后，再次加入4.5体积份的80mm的二甲基咪唑溶液与0.5体积份的20mm的硝酸锌溶液进行混合，反应20min；
48.(4)待步骤(3)反应完全，超声分散后加入0.1-0.2体积份的2m的二甲基咪唑溶液与0.05-0.1体积份的200mm的硝酸锌溶液，混合均匀，反应1h；
49.(5)待步骤(4)完成，通过离心(8000rpm，10min)收集复合物，即得到具有热稳定性的金属有机框架包封的口蹄疫病毒样颗粒，命名为fmdv-vlps-zif-8。
50.通过透射电镜进行观察。透射电镜结果如图1所示，结果显示纳米颗粒形貌均一，大小约为100nm。
51.同时按照上述方法制备了不含有fmdv-vlps的金属有机框架，命名为zif-8。
52.实施例2fmdv-vlps-zif-8复合物的鉴定
53.1、傅红利叶红外光谱鉴定复合物
54.将合成的zif-8，fmdv-vlps-zif-8以及蛋白冷冻干燥后加入适量充分干燥的，利用傅红利叶红外光谱仪测定吸收峰，通过吸收峰确定包封情况。结果如图2a所示，结果显示fmdv-vlps-zif-8复合物具有zif-8与蛋白的特异性吸收峰，显示成功包封了fmdv-vlps。
55.2、sds-page鉴定复合物
56.将包封前的fmdv-vlps与矿化包封fmdv-vlps-zif-8样品进行变性电泳，蛋白胶用考马斯亮蓝染液进行染色，脱色观察金属有机框架矿化对fmdv-vlps的包封情况。结果如图2b所示，结果显示fmdv-vlps-zif-8具有fmdv-vlps的特异性条带，进一步说明fmdv-vlps被成功包封。
57.3、western blot鉴定复合物
58.为了进一步对fmdv-vlps-zif-8进行鉴定，进行变性电泳后，通过湿转将fmdv-vlps-zif-8转到nc膜上，用5％的脱脂奶粉室温封闭1h。用1％脱脂奶粉溶液按照1:1000稀释的抗fmdv的猪血清在4℃过夜孵育nc膜，然后用tbst溶液洗5次(10min/次)，加入用1％脱脂奶粉溶液按照1:2000稀释带hrp标签的抗猪抗体，室温孵育1.5h，用tbst溶液洗5次(10min/次)。然后加入底物溶液进行曝光。结果如图2b所示，结果显示fmdv-vlps-zif-8复合物中具有口蹄疫特异性结构蛋白，进一步说明金属有机框架中包封了fmdv-vlps。
59.4、dot blotting鉴定复合物
60.在硝化纤维素(nc)膜上按照1
×
1cm画12个方块，将不同的样品(zif-8、fmdv-vlps-zif-8、fmdv-vlps-zif-8edta裂解物和fmdv-vlps)按照7μl/方格的剂量添加到nc膜上，自然干燥后，nc膜用5％脱脂奶粉在室温封闭1h，然后用1％脱脂奶粉按照1:1000比例稀释一抗，在室温孵育1h。用pbst溶液洗涤5次(10min/次)后，将nc膜用1％脱脂奶粉按照1:2000比例稀释hrp标记的抗猪抗体，在室温下孵育1h，然后用pbst溶液洗涤膜5次，加入发光液进行曝光，结果如图2c所示，结果显示包封效率约为68％。
61.实施例3 fmdv-vlps-zif-8耐热性分析
zif-8孵育不同时间(1h、2h、4h和6h)。用pbs溶液洗涤处理过的细胞并用loading收集细胞样品。然后通过sds-page分离样品并转移到nc膜上。用5％脱脂奶粉溶液封闭后，依次与猪抗fmdv的血清(1：1000)和hrp-标记的抗猪二抗(1:2000)孵育后，目标蛋白条带通过发光液可视化。western blot结果显示金属有机框架包封fmdv-vlps后进入细胞中的fmdv-vlps含量高于单独fmdv-vlps孵育组，进一步说明金属有机框架包封有助于细胞对vlps的摄取，结果如图5b以及5c所示。
73.实施例6免疫应答
74.1、小鼠免疫
75.所有动物操作均按照中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物护理和使用指南进行，并经中国农业科学院兰州兽医研究所动物伦理委员会批准(批准文号：lvriaec2018-008)。
76.将42只健康balb/c小鼠(6-7周龄)随机分为7组(n＝6)，以检测zif-8的佐剂作用和对fmdv-vlps热稳定性的作用。这些小鼠分别用无菌pbs(对照组)、fmdv-vlps(50μg,4℃)、fmdv-vlps(50μg)-zif-8(4℃)、fmdv-vlps(50μg)-isa206(4℃)、fmdv-vlps(50μg，37℃储存7天)，fmdv-vlps(50μg)-zif-8(37℃储存7天)，fmdv-vlps(50μg)-isa206(37℃储存7天)通过肌肉多点注射。收集免疫后28天的小鼠血液以测量抗体水平。
77.2、特异性抗体水平
78.采用液体阻断elisa检测免疫小鼠血清中的特异性抗体水平。简而言之，96孔板用兔抗fmdv抗体按照1:1000稀释后在4℃下包被过夜。小鼠血清经系列倍比稀释后与等体积的灭活fmdv病毒4℃孵育过夜。以阳性血清、阴性血清和病毒抗原作为对照。包被的96孔板用pbst溶液洗涤后，每孔加入上述抗原抗体复合物50μl，37℃孵育1h。pbst洗板4次，加入豚鼠抗fmdv抗体在37℃孵育1h。然后用pbst洗板4次继续加入hrp-抗豚鼠抗体并37℃孵育1h。用pbst溶液洗涤4次后加入底物溶液，然后在用终止缓冲液h2so4(2m，50μl/孔)终止反应后，用酶标仪在492nm处测量吸光度。
79.结果如图6a所示，该结果显示fmdv-vlps-zif-8免疫小鼠产生的特异性抗体水平高于fmdv-vlps组。值得注意的是，fmdv-vlps-zif-8组的特异性抗体滴度在热处理组和未处理组之间无显著差异。然而，fmdv-vlps和fmdv-vlps-isa206组在热处理前后显示出显著差异。
80.3、淋巴细胞增殖
81.在免疫后28天收集小鼠的脾脏。将脾脏磨碎并在红细胞裂解缓冲液中裂解红细胞。用无菌pbs溶液洗涤后，将细胞悬浮在含有10％fbs、1％双抗的rpmi1640培养基中，并用细胞计数板对分离的脾淋巴细胞进行计数，按照1
×
105/孔接种于96孔细胞培养板中。以培养基组做为空白组，未处理淋巴细胞组作为阴性对照组。加入fmdv-vlps(10μg/ml)刺激淋巴细胞作为fmdv-vlps刺激组。每个样品设置三个重复。孵育68h后，将mts试剂(10μl/孔)加入到96孔细胞培养板上。3-4h后通过酶标仪检测490nm处的吸光度。
82.结果如图6b所示，该结果显示fmdv-vlps-zif-8免疫小鼠的脾淋巴细胞比fmdv-vlps免疫组增殖水平更高。与未热处理的fmdv-vlps-zif-8组相比，热处理的fmdv-vlps-zif-8复合材料显示出可忽略不计的差异。然而，与未处理的相比，热处理的fmdv-vlps和fmdv-vlps-isa206的脾细胞增殖指数显示出显著降低。
83.增殖率(％)＝(-a(“vlp组”)
“‑”‑
a(“空白组”))/(-a(“阴性对照组”)
“‑”‑
a(“空白组”))
84.a-代表三个重复的平均吸光度值。
85.4、淋巴细胞分型
86.将收集的脾脏淋巴细胞用fmdv-vlps刺激24h，将细胞重悬于含有2％fbs和1％ps的pbs中，并与抗cd3e、抗cd4和抗cd8a的荧光抗体在4℃下孵育0.5-1h。用pbs洗涤两次后，将标记的细胞重新悬浮于含有2％fbs和1％双抗的pbs中，并通过流式细胞仪进行分析。
87.结果如图6c以及6d所示，结果显示与pbs和fmdv-vlps组相比，用fmdv-vlps-zif-8免疫的小鼠表现出更高百分比的cd4+ t细胞和cd8+ t细胞。用fmdv-vlps免疫的组显示出较低的t细胞反应。更有趣的是，fmdv-vlps-zif-8在热处理前后cd4
+
t与cd8
+
t百分比相差不显著，fmdv-vlps组或fmdv-vlps-isa206组在热处理后下降的更加明显。