一种制备人乳头瘤病毒捕获探针组的方法及其应用与流程

：
1.本发明属于基因检测及分子遗传学领域，具体涉及一种可用于15种高危型人乳头瘤病毒基因组捕获探针的制备方法及其应用。


背景技术：

2.宫颈癌是指发生于子宫颈阴道和宫颈部的恶性肿瘤，是最常见的妇科恶性肿瘤之一，仅次于乳腺癌。人乳头瘤病毒(human papillomavirus,hpv)是一种无被膜包被的环状双链小分子dna病毒，基因组长约8000碱基对(base pair,bp)。大量研究表明，高危型hpv(hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68)持续感染是导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要原因。尽管如此，不是每一个感染高危型hpv的患者均发生了宫颈癌。随着分子生物学和细胞遗传学的进展，科学研究发现hpv dna与宫颈上皮细胞基因组整合事件的发生才是宫颈癌发生过程中的重要环节。hpv dna一旦插入到宫颈上皮细胞基因组中，hpv dna序列将会随着人基因组的复制不断复制，引起癌蛋白的持续表达。同时，宫颈上皮细胞基因组结构及相关基因的表达水平会发生变化，增加上皮细胞基因组的不稳定性，导致宫颈上皮细胞功能异常、分裂失控，最终致癌。目前，hpv基因组整合事件是宫颈上皮内瘤变向宫颈癌恶性转化的一个重要标志已得到一致认可。在hpv导致的良性病变中，细胞内的病毒dna通常以游离形式位于宫颈上皮基因组外。在高级别病变和宫颈癌中，hpv dna通常以整合形式插入至上皮细胞基因组中，且整合率随着宫颈病变的严重程度而显著增加。因此，hpv与人基因组整合可作为宫颈高级别病变及宫颈癌的辅助诊断手段。高通量测序技术结合靶向捕获技术是目前检测hpv整合状态最为准确的方法。hpv靶向捕获的核心材料之一是hpv dna捕获探针，目前市场上主要dna捕获探针生产厂商有罗氏(roche)、idt(integrated dnatechnologies)、twist bioscience，目前三家公司都是采用直接合成oligo的方案。然而，直接合成探针方案的成本较高，引起dna探针市场价格居高不下，且合成周期长。


技术实现要素：
:
3.针对上述问题，本发明的目的是提供一种用于高危型人乳头瘤病毒基因组捕获探针组的制备方法及其应用。所述制备方法简单、产量大、成本低，可将制备周期缩短至1天。
4.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
5.一种制备用于高危型hpv基因组捕获测序的dna捕获探针的方法，依次包括如下步骤：
6.(1)合成15种高危型hpv:hpv16(seq id no.1)、18(seq id no.2)、31(seq id no.3)、33(seq id no.4)、35(seq id no.5)、39(seq id no.6)、45(seq id no.7)、51(seq id no.8)、52(seq id no.9)、53(seq id no.10)、56(seq id no.11)、58(seq id no.12)、59(seq id no.13)、66(seq id no.14)和68(seq id no.15)，并克隆至puc57载体；
7.(2)合成扩增引物，所述引物的核苷酸序列为:seq id no.16；
8.(3)使用修饰标记的dntp为原料、以步骤(1)所述的质粒分别为模板，用步骤(2)所述的引物进行滚环式扩增；
9.(4)获得的扩增产物定量，并混合；
10.(5)纯化步骤(4)获得的混合产物并用超声打断仪打断；
11.滚环扩增是一种扩增效率高于pcr的高效扩增体系，通常1ng的dna可以得到1-10μg的产物；并且扩增过程中很少引入突变；避免了目前探针合成面临的累计错误率的问题，因此得到的探针的均一性非常高。
12.另外，在合成dna探针的过程中，由于合成受技术的限制，很难合成长片段探针，目前合成的探针长度一般不超过150nt。除去用于扩增探针的两端引物序列，一般有效探针长度为120nt。本发明方法制备的hpv dna探针，长度可达数十kb，并且可以通过超声打断的方法打断至所需任意长度。
13.作为本发明的优选实施方式，步骤(3)所述dntp包括datp、dgtp、dctp、dttp和dutp，其中只有dutp带生物素标签(biotin-dutp)。
14.更优选地，所述dttp：biotin-dutp的摩尔数用量比为4:1；所述(biotin-dutp+dttp)：datp：dgtp：dctp的摩尔数用量比为1:1:1:1。
15.作为本发明的优选实施方式，制备hpv dna探针时，步骤(3)中所述滚环扩增使用的dna聚合酶为phi29 dna聚合酶。
16.作为本发明的优选实施方式，步骤(4)中所述超声为将扩增产物打断至200～400nt。
17.进一步地，所述超声的参数设置为：打断60个循环(超声20秒，停30s)。
18.本发明的第二目的在于，公开了所述方法制备的15种高危型hpv捕获探针。
19.本发明的第三目的在于，公开了所述探针在靶向捕获测序中的用途。
20.进一步地，本发明提供了利用上述方法制备的hpv探针的靶向hpv基因组测序的方法，方法如下：
21.(1)样本dna提取、片段化及构建dna文库
22.(2)文库目标区域靶向捕获及定量
23.(3)高通量测序
24.(4)基因序列的生物信息分析
25.本发明的优点是：
26.(1)本发明方法可用于生产hpv dna捕获探针，制备方法简单、产量大、成本低，可将制备周期缩短至1天。
27.(2)另外，本发明方法制备的探针长度不受限，可根据需要提供不同目标及不同长度的探针，以满足不同的探针需求。
附图说明
28.图1为本发明实施例1滚环扩增产物凝胶电泳结果。
具体实施方式
29.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对
本发明作进一步说明。
30.实施例1
31.本发明方法制备高危型hpv dna探针的一种实施例，制备方法如下：
32.1、构建含有15种高危型hpv dna序列的puc57质粒：
33.(1)高危型hpv序列(参考序列来自ncbi数据库)由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。
34.(2)分别将合成的hpv dna序列克隆至puc57载体，获得15种高危型hpv质粒。
35.2、滚环扩增与纯化
36.(1)配制反应体系：2ul phi29dna聚合酶缓冲液(浓度为10x，购自thermo fisher)，7.5ul扩增引物(浓度100μm)，3ul hpv质粒(浓度为10ng/ul)，补水至24.15ul。
37.(2)95℃孵育3分钟，冰上放置5分钟
38.(3)配置反应体系(相关试剂购自thermo fisher)：0.75ul datp(浓度为10mm)，0.75ul dgtp(浓度为10mm)，0.75ul dctp(浓度为10mm)，0.6ul dttp(浓度为10mm)，1.5ul biotin-dutp(浓度为1mm)和1.5ul phi29 dna聚合酶(10u/μl)。并转移至步在上述反应体系中，得到总体积为30μl的混合物。
39.(4)将混合好的上述反应液置于pcr仪，反应条件如下：30℃(孵育16小时)，65℃(灭活10分钟)，得到扩增产物。
40.(5)取部分产物进行凝胶电泳，结果如图1(滚环扩增产物凝胶电泳结果)。
41.(6)利用采购自诺维赞的纯化磁珠纯化上述扩增产物。
42.(7)利用qubittm dsdna assay kit(thermo fisher)试剂盒分别测定纯化后的15种高危型hpv扩增产物的浓度，并按测定的浓度用无酶水稀释至200ng/ul。
43.(8)将稀释好的15高危型hpv扩增产物等比例混合，得到初始全长探针。
44.3、探针超声打断
45.(1)利用biorupter超声打断仪进行探针打断，参数设置为：开启20s，停止30s，60个循环
46.(2)通过qubittm ssdna assay kit(thermo fisher，货号q10212)试剂检测探针浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测探针长度，打断后的探针主带为200-300nt。
47.实施例2本发明探针进行高危型hpv dna靶向捕获的方法
48.1.预文库构建
49.(1)dna酶切片段化、末端修复及加a处理
50.(a)于冰上在pcr管中配制以下反应体系：基因组dna 500ng，10ul酶混合液,补无酶水至60ul
51.(b)将pcr管置于pcr仪中，热盖105℃，运行如下程序：4℃(1分钟)，30℃(12分钟)，72℃(20分钟)，4℃(保持)。
52.(2)接头连接
53.(a)将接头连接缓冲液、接头连接酶及dna接头解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用；
54.(b)于冰上在pcr管中配制以下反应体系：60μl的上一步产物，5μl接头连接酶，30μl接头连接缓冲液和5μl dna接头。
55.(c)振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
56.(d)将pcr管置于pcr仪中(热盖关)，运行如下程序：4℃(1分钟)，20℃(15分钟)，4℃(保持)。
57.(3)接头连接产物纯化
58.(a)取60μl纯化磁珠至100μl接头连接产物中，混匀，室温孵育5分钟；
59.(b)将pcr管并置于磁力架中，待溶液澄清后(约5分钟)，小心移除上清；
60.(c)保持pcr管始终置于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，小心移除上清，重复该步骤1次；
61.(d)保持pcr管始终置于磁力架中，开盖干燥磁珠5～10分钟至无乙醇残留；
62.(e)将pcr管从磁力架中取出，加入23μl无酶水洗脱，使用移液器轻轻吹打充分混匀，于室温放置2分钟；
63.(f)将pcr管置于磁力架中静置，待溶液澄清后(约5分钟)，小心移取20μl上清至新pcr管中。
64.(4)文库扩增
65.(a)将pcr扩增引物1及pcr反应混合液解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用；
66.(b)于冰上在pcr管中配制以下反应体系(50μl)：纯化的接头连接产物(20μl)，pcr扩增引物1(5μl)，pcr反应混合液(25μl)；
67.(c)振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底；
68.(d)将pcr管置于pcr仪中，热盖105℃，进行下述反应(表1pcr反应条件)：
69.表1
[0070][0071]
(5)扩增产物纯化
[0072]
(a)取45μl纯化磁珠至50μl扩增产物中，振荡混匀，室温孵育5分钟；
[0073]
(b)将pcr管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，移除上清；
[0074]
(c)加入200μl的80％乙醇清洗磁珠，室温孵育30秒，移除上清，重复该步骤1次；
[0075]
(d)保持pcr管始终置于磁力架中，开盖干燥磁珠5～10分钟至无乙醇残留；
[0076]
(e)向步骤4干燥后的磁珠中加入45μl无酶水，涡旋振荡混匀，于室温放置2分钟，并置于磁力架中静置5分钟，小心移取43μl上清至新离心管中；
[0077]
(f)文库构建后测定文库的浓度和片段大小
[0078]
2、杂交捕获
[0079]
(1)杂交
[0080]
(a)配制混合液1︰750ng文库，5μl封闭序列1，2μl封闭序列2。
[0081]
(b)取出试剂盒中的封闭试剂和探针，静置解冻后振荡混匀，按照5μl封闭试剂与2μl探针配制混合液2(冰上操作)。
[0082]
(c)取出试剂盒中的杂交缓冲液置于室温化冻，化冻后取出20μl置于65℃恒温混匀仪孵育待用。
[0083]
(d)将13μl杂交缓冲液添加到混合液2中，混匀、短暂离心。
[0084]
(e)使用可控温真空干燥仪，设置干燥温度45-50℃，打开管盖，直至混合液1浓缩至体积小于10μl，用无酶水补齐至10μl，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用。浓缩时间不宜过长，防止蒸干。
[0085]
(f)将浓缩后的混合液2置于pcr仪中95℃孵育5分钟，65℃孵育2分钟(热盖温度为105℃)，孵育完成后不需要取出。
[0086]
(g)将添加了杂交缓冲液的混合液1置于pcr仪中65℃孵育2分钟(热盖温度为105℃)。(h)吸取20μl的混合液1添加到混合液2中，充分混匀，65℃杂交16～24h，保持杂交产物在pcr仪中，进入捕获步骤。
[0087]
(2)捕获
[0088]
(a)提前取出t1磁珠室温平衡30分钟，振荡混匀；
[0089]
(b)取50μl t1磁珠置于新的离心管中，离心管置于磁力架上静置1分钟至液体澄清，小心吸弃液体(注意不要吸到磁珠)；
[0090]
(c)从磁力架上取下离心管，添加200μl捕获缓冲液，吹打混匀后，将离心管置于磁力架上静置1分钟至液体澄清，小心吸弃液体(注意不要吸到磁珠)；
[0091]
(d)重复步骤(3)两次，总共三次；
[0092]
(e)磁珠中重新添加200μl捕获缓冲液重悬磁珠，重悬后加入到杂交产物中，并将pcr管置于旋转混旋仪上室温结合30分钟，转速不超过10转/分钟；
[0093]
(f)取出试剂盒中的清洗缓冲液1和清洗缓冲液2，清洗缓冲液1室温静置待用，清洗缓冲液2置65℃预热5分钟以上待用；
[0094]
(g)将捕获产物置于磁力架上静置1分钟至液体澄清，小心吸弃液体(注意不要吸到磁珠)；
[0095]
(h)从磁力架上取下离心管，加入200μl的清洗缓冲液1，吹打混匀后，混匀仪上旋转15分钟，转速不超过10转/分钟，放在磁力架上静置1分钟至液体澄清，小心吸弃液体(注意不要吸到磁珠)；
[0096]
(i)从磁力架上取下离心管，加入200μl 65℃预热的清洗缓冲液2，吹打混匀后，置于恒温震荡仪(65℃，800rpm)上10分钟，置于磁力架上静置1分钟至液体澄清，小心吸弃液体(注意不要吸到磁珠)；
[0097]
(j)重复步骤(4)两次，共三次；
[0098]
(k)保持离心管始终置于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇，静置30秒至液体澄清，小心吸弃液体(注意不要吸到磁珠)；
[0099]
(l)反应管留于磁力架室温晾干3～5分钟使残留乙醇挥发，以磁珠表面无光泽为准(过分晾干将导致dna得率下降)；
[0100]
(m)从磁力架上取下离心管，加入30μl无酶水，重悬磁珠待用。
[0101]
(3)捕获产物扩增(冰上操作)
[0102]
(a)按照下表反应体系在0.2ml pcr管中配制混合液3：pcr扩增缓冲液(18μl)，pcr扩增引物2(1μl)，pcr扩增酶(1μl)；
[0103]
(b)将20μl上述反应体系加入到上述产物中，冰上操作，充分混匀；
[0104]
(c)置于pcr仪中按下表反应程序进行pcr扩增，热盖105℃(表2pcr反应条件)；
[0105]
表2
[0106][0107]
(4)扩增后纯化
[0108]
(a)纯化磁珠使用前室温平衡30分钟，取75μl纯化磁珠至50μl扩增产物中，涡旋振荡混匀，室温孵育5分钟；
[0109]
(b)将pcr管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约5分钟)，小心移除上清；
[0110]
(c)保持pcr管始终置于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，小心移除上清，重复该步骤1次；
[0111]
(d)保持pcr管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5～10分钟至无乙醇残留；
[0112]
(e)向步骤4中加入25μl无酶水，涡旋振荡混匀，于室温放置2分钟，将pcr管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后(约5分钟)，小心移取23μl上清至新离心管中。
[0113]
(f)使用核酸定量试剂盒qubit dsdna hs assay kit及配套仪器进进行定量，记录文库浓度，文库浓度大于1ng/μl，使用qsep100进行片段长度测定，文库长度约在270bp-400bp间。
[0114]
(g)使用kapa library quantification kit试剂盒对待上机富集文库进行定量，以调整至合适上机浓度，使用illumina测序平台进行测序。
[0115]
3.生物信息分析
[0116]
(1)测序完成后，使用illumina公司的bcl2fastq v2.20.0.422软件将测序生成的bcl文件转化成样本对应的fastq文件；
[0117]
(2)根据fastq文件中碱基及质量，对原始数据进行质量控制(基于fastp v0.20.0软件)；
[0118]
(3)将fastq文件中的碱基序列比对至人类参考基因组hg38(grch38)和hpv基因组上生成bam文件，并对比对序列进行排序和去重；
[0119]
(4)统计样本中比对上各种hpv亚型的reads数和比例；
[0120]
(5)通过序列比对文件中hpv和人基因组的序列进行位点比较，分析样本中hpv整合位点，并对整合位点在基因组上的位置进行注释。
[0121]
实施例3:本发明方法制备高危型hpv捕获探针的使用效果验证
[0122]
下面通过具体实施方式对本发明做进一步的详细说明。
[0123]
1.根据实施例1的方法制备了针对高危型hpv dna的混合探针。
[0124]
2.根据实施例2的方法用样本1(样本1为参考品：15种高危型hpv质粒+人基因组
dna配制获得，每种质粒的浓度为10^6copies/ml)、样本2(已知有hpv16感染整合的siha细胞系dna)和样本3(已知有hpv18感染整合的hela细胞系dna)进行建库；并用本发明制备的高危型hpv dna探针组(自备)与从艾吉泰康购买的探针做液相杂交靶向捕获。进一步，做高通量测序及生物信息学分析。3例样本测序分析结果见表3不同探针测序结果比较。
[0125]
表3
[0126][0127]
由表3可知：本发明方法制备的探针及从艾吉泰康购买的商业化探针都能够准确检测出3例样本感染hpv的型别及整合状态(样本1为hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68感染阳性、整合阴性；样本2为hpv16感染及整合阳性；样本3为hpv18感染及整合阳性)，均满足捕获需求；同时，我们制备的探针捕获的hpv的平均测序深度、捕获效率及10x覆盖度相当。这表明，本发明制备的探针可对实际样本中感染的高危型hpv及整合状态进行准确快速的检测，有实际可使用价值。