检测肺炎链球菌的RPA方法、其专用引物和探针及用途与流程

检测肺炎链球菌的rpa方法、其专用引物和探针及用途
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及肺炎链球菌的分子生物学，涉及一种检测肺炎链球菌的方法及其用途，特别涉及一种利用重组酶聚合酶恒温扩增技术(rpa技术)快速检测肺炎链球菌的方法、其专用引物和探针及其用途。


背景技术：

2.苛养菌是社区感染最常见的病原菌，可引发菌血症、脑膜炎、肺炎等严重侵袭性疾病，在儿童等免疫力低下的人群中尤为严重。感染初期及早合理的使用抗菌药物对其治疗和预后都非常重要。然而，由于苛养菌的分离鉴定耗时长，对培养环境要求严苛且极易受到实验室、人员及技术差异限制，因而严重影响了苛养菌感染者的诊断，延迟了临床患者的治疗时机。而肺炎链球菌是其中占比最大的一类。本专利提出了一种基于rpa技术的肺炎链球菌检验方法，对肺炎链球菌进行快速、高效且准确的检出；有助于对肺炎链球菌感染病情的判断，抗菌药物用药指导；并能有效缩短诊断及检出时间，节约检出成本，具有重大的临床意义和社会经济价值。
3.苛养菌是对营养要求严苛，在普通培养基中难以生长或不生长，在体外培养过程中需加入特殊因子或其他营养成分方可缓慢生长的一类细菌，主要包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、脑膜炎奈瑟菌、军团菌及鲍特菌等。临床常见的苛养菌多数是人类呼吸道的正常菌群或寄居菌，在人体免疫力正常时不致病，但在机体免疫力不足的情况下，如儿童患者或免疫抑制时，苛养菌可能导致严重的呼吸系统炎症，或进入循环系统引起其他部位的感染。研究显示，在儿童的感染性疾病中，苛养菌是一类重要的致病菌，它不仅能引起呼吸道的感染，还可引起中耳炎、败血症、脑膜炎等。在儿童患者中，苛养菌检出率及耐药率均显著高于成年人。且在苛养菌检出阳性标本中，呼吸道感染标本占90％。因此，在对患者的临床检验中，更应注重儿童患者呼吸道苛养菌的检出情况。
4.呼吸道感染主要可分为上呼吸道感染和下呼吸道感染两种类型，病毒与细菌为上呼吸道感染主要病原体，而真菌、支原体、病毒及细菌为导致下呼吸道感染主要因素。针对该类病症诊治，首要条件即为临床检验中对病原菌的精确判定，提高用药合理性并对耐药发展产生一定延缓作用。在当前的临床检验中，呼吸道病原菌的分离与鉴定仍是感染患者诊断的金标准。然而，苛养菌在培养中对营养和环境等因素要求极高，且由于各实验室在环境、人员配置及技术上存在差异，采用常规细菌培养方法时很容易漏诊，导致苛养菌整体检出率仅有20％-60％。在临床上，由苛养菌引起的感染很难精确的诊断和治疗，造成了抗菌药物不合理使用，并贻误了患者最佳治疗时机。如以重度肺部感染为例，先明确病原菌方可选取适宜抗菌药品，将耐药产生风险降低。在现阶段临床中，针对病原学诊断的重要价值并未予以足够重视，多以经验性诊治为主，病因模糊诊断如不明原因肺炎及慢性肺炎等较为常见，微生物检测能力与临床需求脱节现象较为普遍。以肺炎链球菌为例，典型形态为隆起，湿润，脐窝状，草绿色溶血，与链球菌属其它细菌难以区分；流感嗜血杆菌形态为露滴状小菌落，不溶血且无色透明，与奈瑟菌相近。然而据报道，在苛养菌的分离鉴定中使用来源
不同的琼脂平皿，因其所含营养成分存在细微差异，可能导致细菌形态呈现不同，增加鉴定难度。此外，相关学者指出，伴随着送样时间的延长，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌检出率显著降低，且苛养菌送检样品同样不适用于冷藏，因冷藏样品容易导致苛养菌死亡，故而样品送检的时效性要求极高。因而，临床上如何快速、有效且准确地检出苛养菌感染，是当下检验科面临的重大挑战。
5.近几年来，恒温核酸扩增技术得到了快速发展，其中英国twistdx inc公司开发的重组酶聚合酶恒温扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)被誉为是可替代pcr的核酸检测技术，其是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内dna复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合(重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶)对dna模板进行扩增，可在25-43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析检测试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全等领域。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提出一种检测肺炎链球菌的rpa方法、其专用引物和探针及用途，利用重组酶聚合酶恒温扩增技术(rpa技术)能快速、简便、特异的检测肺炎链球菌。
7.所采用的技术方案为：
8.本发明的一种基于rpa检测肺炎链球菌的非诊断方法，包括如下步骤：
9.s1.以待测样品基因组dna为模板，在引物组和探针的标记下进行rpa反应；所述引物组和探针均是根据肺炎链球菌特异性保守序列设计的，所述肺炎链球菌特异性保守序列具有seq id no.1所示的核苷酸序列，所述引物组中的正向引物具有seq id no.2所示的寡核苷酸序列，反向引物具有seq id no.3所示的寡核苷酸序列，且5’端标记生物素；所述探针具有seq id no.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素，3’端添加延伸阻断基团，在第34-35位碱基之间增加一个四氢呋喃；
10.s2.用上述侧向层析核酸检测试纸条对回收后的rpa产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。
11.进一步地，所述的荧光素为羧基荧光素fam或fitc荧光素，所述的延伸阻断基团为磷酸基团。
12.进一步地，所述的探针长度为49bp，其中5’端34bp，3’端15bp。
13.进一步地，s1中，将引物组和探针用于50μl的rpa反应体系进行rpa反应，所述的正向引物的浓度为10μmol/l，反向引物的浓度为5μmol/l，所述的探针的浓度为10μmol/l、镁离子浓度280μmol/l，模板加样量为1μl；将2.1μl正向引物、2.1μl反向引物、0.6μl探针、1μl样品、12.2μl无dnase和rnase水和29.5μl缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的twistamp nfo反应管中，然后将2.5μl的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上；将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增20min，在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增；s2中，检测时加样量为5μl，试纸条显色时间控制在3-5min。
14.本发明的一种用于检测检测肺炎链球菌的试剂盒，包括引物组和探针；所述引物
组和探针均是根据肺炎链球菌特异性保守序列设计的，所述肺炎链球菌特异性保守序列具有seq id no.1所示的核苷酸序列，所述引物组中的正向引物具有seq id no.2所示的寡核苷酸序列，反向引物具有seq id no.3所示的寡核苷酸序列，且5’端标记生物素；所述探针具有seq id no.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素，3’端添加延伸阻断基团，在第34-35位碱基之间增加一个四氢呋喃。
15.本发明的一种用于检测肺炎链球菌的rpa专用引物，其是根据肺炎链球菌特异性保守序列设计的，所述肺炎链球菌特异性保守序列具有seq id no.1所示的核苷酸序列；所述引物中的正向引物具有seq id no.2所示的寡核苷酸序列，反向引物具有seq id no.3所示的寡核苷酸序列，且5’端标记生物素。
16.本发明的一种用于检测肺炎链球菌的rpa探针，其是根据肺炎链球菌特异性保守序列设计的，所述肺炎链球菌特异性保守序列具有seq id no.1所示的核苷酸序列；该探针具有seq id no.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素，3’端添加延伸阻断基团，在第34-35位碱基之间增加一个四氢呋喃。
17.本发明的上述的试剂盒用于检测肺炎链球菌的非诊断用途。
18.本发明的上述的rpa专用引物用于检测肺炎链球菌的非诊断用途。
19.本发明的上述的rpa探针用于检测肺炎链球菌的非诊断用途。
20.上述中，本发明的第一个目的是提供用于检测肺炎链球菌的引物，包括正向引物和反向引物，共两条。所述引物是根据肺炎链球菌的保守基因设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了肺炎链球菌基因的保守区，此区域含有190个碱基的核苷酸片段，具有seq id no.1所示的核苷酸序列。从seq id no.1序列内筛选设计特异性引物。筛选的特异性引物包括正向引物prf1和反向引物prr2，共两条，具有如seq id no.2和seq id no.3所示的寡核苷酸序列，引物的长度为30bp以上，其中反向引物5’端标记生物素(biotin)。正向引物和反向引物扩增完成后获得的双链dna将标记有生物素。
21.本发明的第二个目的是提供用于检测肺炎链球菌的探针。所述探针是根据肺炎链球菌的特异性保守序列设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了儿童呼吸道苛养菌基因的保守区，此区域含有190个碱基的核苷酸片段，具有seq id no.1所示的核苷酸序列。从seq id no.1序列内筛选设计特异性探针，设计探针具有seq id no.4所示的寡核苷酸序列，该序列5’端标记荧光素fam，3’端添加延伸阻断基团(如磷酸基团)，在第34-35位碱基之间插入一个四氢呋喃(thf)。
22.所述探针的长度为49bp，其中5’端34bp，3’端15bp。
23.所述探针由荧光素(羧基荧光素fam)、5’端序列、四氢呋喃(thf)、3’端序列及3’端延伸阻断基团(磷酸基团)几部分组成。
24.所述探针与扩增后的标记有生物素的dna退火，rpa系统中的nfo酶将在thf部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3’端继续延伸，最终获得fam和biotin双标记的扩增产物。
25.本发明的第三个目的是提供了用于肺炎链球菌快速检测的rpa检测方法，所述方法采用上述的rpa引物和探针进行扩增，并结合侧向层析核酸检测试纸条(hybridetect 2t，milenia biotec gmbh,germany)进行可视化判断。
26.本发明一种检测肺炎链球菌的rpa方法，包括以下步骤：
27.(1)以待测样品基因组dna为模板，在所述引物组和探针的标记下进行rpa反应；
28.(2)结果判断：用上述侧向层析核酸检测试纸条对回收后的rpa产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。
29.优选地，该检测肺炎链球菌的rpa方法，具体步骤如下：
30.(1)扩增试剂准备和加样：将10μmol/l正向引物2.1μl、5μmol/l反向引物2.1μl、10μmol/l探针0.6μl、1μl样品、12.2μl无dnase和rnase水和29.5μl缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的twistampnfo反应管中。然后将2.5μl的280mm醋酸镁溶液加到反应管的盖子上。
31.(2)扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增20min，在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。
32.(3)结果判断：取5μl的rpa扩增产物用pbst稀释至100μl，用上述胶体金横向流动试纸条对回收后的rpa产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。
33.综上，本发明的有益效果在于：
34.第一方面，本发明提供的一种检测肺炎链球菌的rpa方法，检测原理是采用rpa技术，对肺炎链球菌的特异性保守靶序列，即肺炎链球菌的保守序列进行检测，该序列可作为肺炎链球菌的标志基因之一。
35.第二方面，本发明提供的一种检测肺炎链球菌的rpa方法，节约了肺炎链球菌的检测时间，检测可在37℃下20min内完成扩增，整个检测过程可在1小时内完成，与常规pcr和实时荧光定量pcr需要数小时相比极大地缩短了检测时间。
36.第三方面，本发明提供的一种检测肺炎链球菌的rpa方法，降低了反应温度，rpa只需要恒温37℃即可完成实验，该温度远远低于荧光定量pcr的60-95℃以及lamp的63℃。
37.第四方面，本发明提供的一种检测肺炎链球菌的rpa方法，更加简单、便于携带：扩增所需的酶和一些其他必要的东西可冻干保存，能够在常温下长时间放置，扩增时只需要加入水解缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁离子起始反应即可，且样品不需要进行复杂反应。
38.第六方面，本发明提供的一种检测肺炎链球菌的rpa方法，明灵敏性高，特异性强。可用于现场或床旁检测，具有广阔的应用前景。
39.综上，本发明首次将新型恒温扩增技术rpa应用于肺炎链球菌的检测中，该方法模拟体内dna复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合，包括重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶，对dna模板进行扩增，可在37℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，扩增产物可通过侧向层析核酸试检测纸条实现可视化判别。本发明建立的检测方法灵敏度可达10拷贝数/μl，特异性高，对硬件设备的要求很低，且可在30min内完成检测，无需对样品进行复杂处理、适合现场检测，适于推广应用。
附图说明
40.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例涉及的附图作简
单地介绍。
41.图1为确定检测肺炎链球菌rpa检测方法的引物探针组合，e所示为确定的引物，试验结果如图1所示。
42.图2为检测肺炎链球菌rpa检测方法的特异性，使用了不同的基因组dna模板进行试验，a为化脓链球菌，b为肺炎链球菌，c为无乳链球菌，试验结果如图2所示。
具体实施方式
43.下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。
44.实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
45.所用rpa引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成，qpcr引物和探针上海生工生物技术有限公司合成，所有序列测定工作均由上海生工生物技术有限公司完成。
46.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
47.实施例1、肺炎链球菌引物和探针的设计及筛选
48.(1)引物和探针的设计
49.发明人通过文件检索，分析确定本发明使用肺炎链球菌的特异性序列为目标基因。从ncbi数据库中获得已知的模板基因序列，即seq id no.1所示的核苷酸序列(或表2所示)，并由上海生工生物技术有限公司对上述序列进行合成，作为阳性质粒，在后续引物探针筛选、反应体系的优化等过程中作为模板使用。根据rpa引物及探针设计原则，设计2条引物及1条探针，如表1所示。
50.表1序列、引物及探针
[0051][0052]
表2模板基因序列
[0053]
[0054]
(2)引物筛选
[0055]
人工合成含肺炎链球菌的seq id no.1所示的序列，以此质粒为模板，将引物与探针进行全面组合。引物组合分别进行在37℃条件下进行rpa扩增，以侧向层析核酸检测试纸条检测线显出情况为指标，筛选出在37℃条件下，扩增效率最高的引物探针组合，用于后续rpa检测的评价和应用。
[0056]
筛选用的50μl的rpa反应体系如下：将10μmol/l正向引物2.1μl、5μmol/l反向引物2.1μl、10μmol/l探针0.6μl、5.3
×
10
10
copies/μl模板1μl、12.2μl无dnase和rnase水和29.5μl缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的nfo反应管中。然后将2.5μl的280mm醋酸镁溶液加到反应管的盖子上，考虑到rpa反应灵敏度较高，易出现假阳性的情况，发明者为每一组引物探针组合均设置了一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。发明者还设置了一组阳性对照，阳性对照由rpa nfo试剂盒内提供，同时还为阳性对照设置了一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。
[0057]
扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增20min，在反正第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。
[0058]
结果判断：取5μl的rpa扩增产物用pbst稀释至100μl，再用上述侧向层析核酸检测试纸条对rpa产物进行检测。每个反应设置一个复孔。
[0059]
侧向层析核酸检测试纸条检测结果见图1。图1为检测时间为5min时引物探针组合、阳性对照及其相对应的阴性对照的侧向层析核酸检测试纸条的检测线和质控线的显示情况。
[0060]
本发明确定的引物组合包括：正向引物prf1和反向引物prr2，共两条，分别具有如seq id no.2和seq id no.3所示的寡核苷酸序列。
[0061]
(3)探针的确定
[0062]
表1列出的probe-1探针为本发明优选，探针的长度为49bp，其中5’端34bp，3’端15bp。
[0063]
探针由荧光素(羧基荧光素fam)、5’端序列、四氢呋喃(thf)、3’端序列及3’端延伸阻断基团(磷酸基团)几部分组成。探针具有seq id no.：4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素fam，3’端添加延伸阻断基团(如磷酸基团)，在第34-35位碱基之间插入一个四氢呋喃(thf)。所述探针与扩增后的标记有生物素的dna退火，rpa系统中的nfo酶将在thf部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3’端继续延伸，最终获得fam和biotin双标记的扩增产物。
[0064]
实施例2：rpa反应体系、扩增和检测条件的优化
[0065]
在引物筛选的过程中，侧向层析核酸检测试纸条在检测是仍存在假阳性的情况，因此需对rpa反应体系、扩增和检测条件进行优化
[0066]
(1)引物探针浓度
[0067]
设定反向引物的浓度梯度梯度为10μmol/l、5μmol/l、2.5μmol/l，探针的浓度梯度为10μmol/l、5μmol/l、2.5μmol/l，将一种浓度的反向引物分别与三种浓度的探针进行组合，组合成3组组合，每组组合均设置一组阴性对照。分别进行在37℃条件下进行rpa扩增，扩增完毕以侧向层析核酸检测试试纸条检测线显出情况为指标。筛选出扩增效果最好，且
不出现假阳性的组合。
[0068]
通过对侧向层析核酸检测试试纸条检测结果分析，本发明确定的反向引物的浓度为5μmol/l、探针的浓度为10μmol/l。
[0069]
(2)扩增时间
[0070]
50μl的rpa反应体系如下：将10μmol/l正向引物2.1μl、5μmol/l反向引物2.1μl、10μmol/l探针0.6μl、1
×
104copies/μl模板1μl、12.2μl无dnase和rnase水和29.5μl缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的nfo反应管中。然后将2.5μl的280mm醋酸镁溶液加到反应管的盖子上。
[0071]
扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增10min，15min，20min，均在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。发明者为每一组分别设置了一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。
[0072]
结果判断：取5μl的rpa扩增产物用pbst稀释至100μl，再用上述侧向层析核酸检测试试纸条对rpa产物进行检测。
[0073]
通过对侧向层析核酸检测试试纸条检测结果分析，10min和15min的扩增时间样品检测线条带较浅，考虑到后续灵敏度试验，本发明确定的扩增时间为20min。
[0074]
综上，通过rpa反应体系、扩增和检测条件进行优化，本发现确定在使用5μmol/l浓度的下游引物和10μmol/l浓度的探针扩增20min，加样量为5μl，试纸条显色时间控制在3-5min时，检测效果最好。
[0075]
实施例3：rpa检测的灵敏度评价
[0076]
将阳性质粒按10倍比稀释成104到1个/μl等一系列不同浓度，各取1μl分别加入实施例2所确定的反应体系，利用筛选出的引物组合，采用实施例2确定的扩增和检测条件对上述不同拷贝数的模板进行rpa检测，观察rpa检测的灵敏度。
[0077]
结果：从10个/μl拷贝数开始以上样品均呈阳性，说明本发明rpa检测方法的灵敏度达到10个拷贝/μl。
[0078]
实施例4：rpa检测的特异性评价
[0079]
特异性评价肺炎链球菌的基因组dna和化脓链球菌、无乳链球菌、人血浆dna为对照，以确定本发明rpa检测方法的特异性。
[0080]
分别以肺炎链球菌、化脓链球菌、无乳链球菌的基因组dna和人血浆dna为模板，采用如下反应体系：将10μmol/l正向引物2.1μl、5μmol/l反向引物2.1μl、10μmol/l探针0.6μl、1μl样品、12.2μl无dnase和rnase水和29.5μl缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2ml的twistamp nfo反应管中。然后将2.5μl的280mm醋酸镁溶液加到反应管的盖子上。
[0081]
扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增20min，在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。
[0082]
结果判断：取5μl的rpa扩增产物用pbst稀释至100μl，用上述侧向层析核酸检测试纸条对rpa产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。
[0083]
结果：参见图2所示，化脓链球菌、无乳链球菌的基因组dna和人血浆dna样品检测线均为出现条带，呈阴性，只有肺炎链球菌样品检测线出现清晰条带，呈阳性，说明本发明rpa检测方法对肺炎链球菌有很强的特异性。
[0084]
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。