一种人源膜联蛋白人源膜联蛋白A5突变体二聚体的晶体结构及其解析方法与流程

一种人源膜联蛋白人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构及其解析方法
技术领域
1.本发明涉及医药工程技术领域，具体涉及一种人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构及其解析方法。


背景技术：

2.研究表明，膜联蛋白a5(annexin a5)简称anxa5，是一种320个氨基酸组成的单链蛋白，研究早期其又被称为胎盘抗凝蛋白i、凝血酶抑制剂v、内皮素ii、钙结合蛋白i和脂皮质素v。早在1985年，研究报道将其描述为血管抗凝剂，之后它又成为第一个被表征三维结构的膜联蛋白，表明对其的结构解析具有十分重要的研究价值。
3.研究表明，anxa5蛋白结构重复序列i至iv组成，其蛋白序列226位上的asp以ca2+和ph依赖的构象方式参与调控分子开关。anxa5与ca2+结合时的构象，发现在anxa5重复序列iii第187位上暴露的trp与磷脂结合，此外，anxa5内部的域间形成了由i/iv和ii/iii组成的交互作用方式。其中，i和iv之间的相互作用是由nh2末端以非共价方式介导产生，而重复序列ii和iii通过短螺旋转动方式共价连接。
4.研究表明，anxa5是一种单体结构，但与磷脂膜结合时，三个anxa5单体会自发形成三聚体，而形成的三聚体可以通过三聚体-三聚体相互作用的方式在暴露有磷脂酞丝氨酸(ps)的表面组装。在涉及到抗炎、纤溶和抗血栓过程中，细胞内的anxa5会在二维晶格中自组装，进而改变细胞膜的曲率以及细胞形状，最终促进细胞膜的修复。
5.研究表明，细胞内的anxa5在质膜上表现出钙通道活性，它能与血小板中的肌动蛋白相互作用，是凝血过程的关键调节因子。另外，在血液凝固过程中需要血小板的激活，以形成一个以ps为主的磷脂膜催化表面，使凝血因子x、凝血酶原等凝血固子活化。由于膜联蛋白具有较强的钙依赖性磷脂结合活性，因而能够竞争性抑制凝血因子和血小板膜磷脂的结合，从而抑制了凝血因子x等的活化，起到抗凝血的作用。
6.综上所述，annexins是一类钙离子依赖型的磷脂结合蛋白，能够调控抗凝血、细胞凋亡、信号转导等过程，并参与多种疾病的发生发展。anxa5是膜联蛋白家族分布最多和最广泛的成员，最早被称为抗凝蛋白，主要起抗凝血的功能，通常作为抗凝剂和抗血栓形成的药。近几年，对于寻找与ps结合能力更强、抗血栓能力更强和毒性更小的anxa5突变体成为研究热点。本发明提供了一个构建此类突变体的新思路，即通过在anxa5的c末端添加一个半胱氨酸，能够通过形成分子间的二硫桥的构建提高分子间的聚集作用，在竞争性抑制凝血因子和血小板膜磷脂的结合中发挥更强的作用。
7.目前，x-射线单晶衍射方法是通过蛋白质单晶获得其三维结构的最重要的研究方法之一。对于x-射线单晶衍射方法，蛋白质单晶必须达到足够大的尺寸和完善程度。然而，由于溶液中蛋白质分子之间的相互作用位点较少，相互作用力比较弱，蛋白质晶体中往往含有很大比重的水，因此，内部结构比较规整的蛋白质晶体仍旧很难获得。获得高质量的蛋白质晶体仍旧是蛋白质结构解析的瓶颈问题。


技术实现要素：

8.本发明提供了一种低毒性、高活性的人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构及其解析方法。
9.本发明提供的一种低毒性、高活性的人源膜联蛋白a5突变体二聚体，与人源膜联蛋白a5相比较，其毒性大大降低、安全性显著提高；人源膜联蛋白a5突变体二聚体蛋白的ps结合能力是人源膜联蛋白a5的4.5倍。
10.为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构，采用技术方案如下：本发明的一种人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构，所述的人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构的氨基酸序列如seq id no.1所示。
11.进一步地，所述的人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构的一个晶格由4个蛋白分子组成，分别为：chain a、chain b、chain c、chain d。
12.进一步地，所述的蛋白晶体每个单分子含有4个repeat，所述的每个repeat由5个α螺旋和连接它们的loop组成。
13.更进一步地，所述的每个repeat由约70个氨基酸组成的5个α螺旋和连接其的loop组成，属于一种典型的膜联蛋白annexins家族类蛋白。
14.进一步地，所述的人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构的晶型外形为块状晶体，空间群为p21212；所述的人源膜联蛋白tp25s的晶体结构的晶胞参数为a为b为c为α＝β＝γ＝90
°
。
15.进一步地，所述的chain a-chain d，chain b-chain c，chain c-chain a之间形成强分子间作用力。
16.本发明所述的人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构的解析方法，包括如下步骤：从母液中可以获得晶体，利用液态氮气流快速冷冻，在100k下利用x射线源获得的晶体数据，具体过程如下：
17.首先使用的尼龙晶体环(如hampton research公司的)，从晶体浸泡液中获取适宜x射线衍射的晶体，并迅速使用冷却系统(如oxford cryosystem公司的)产生的低温氮气流中冷冻至零下150-180℃；使x射线通过晶体，利用旋进法收集x射线衍射数据；收集到晶体的x射线衍射数据后，按照下述步骤进行相应的数据处理：(1)使用hkl2000等软件对上一步骤中收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；(2)使用ccp4程序包中的phaser、molrep等软件，利用分子置换(mr，molecular replacement)方法，以已知的膜联蛋白的结构为搜索模型，制得人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构。
18.有益效果：本发明可以用于设计和/或修改膜联蛋白以提高其抗凝血、抗炎症、识别凋亡细胞等作用，提高稳定性以及降低毒性等方面。本发明所提供的改良蛋白的结构信息可以用于更高效地开展在制备检测试剂、诊断试剂盒制备、药物靶点筛选和治疗效果更好的变体蛋白，满足生物制药应用的要求。
19.与现有技术相比，本发明具有如下优点：
20.(1)本发明在分子水平的基础上解析了人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构。晶体结构及其衍生出的信息适用于设计和鉴定新药物，适用于设计具有高稳定性、药效好、安全性更好的突变体蛋白。本发明可用于诸如，改善蛋白稳定性、提高药物疗效、降低药
物毒性、构建anxa5突变体库、医药领域筛选抑制剂等方面。
21.(2)本发明提供了解析膜联蛋白晶体结构的方法，通过该方法成功获得人源膜联蛋白anxa5突变体二聚体的晶体结构。本发明公布的人源膜联蛋白a5突变体二聚体晶体结构信息可用于解释基于构效关系的膜联蛋白抗凝血、抗炎症、识别凋亡细胞等活性的机制。本发明提供的anxa5突变体结构完整，保留氨基酸信息全面，为anxa5的研究提供了更加详细的结构信息。
附图说明
22.图1为本发明的人源膜联蛋白a5突变体二聚体经过分子筛进一步纯化之后的sds-page电泳结果。
23.图2为本发明的人源膜联蛋白a5突变体二聚体高通量筛选的片状晶体示意图。
24.图3为本发明的人源膜联蛋白a5突变体二聚体优化后的块状晶体示意图。
25.图4为本发明的人源膜联蛋白a5突变体二聚体晶体结构示意图。
26.图5为本发明的人源膜联蛋白a5突变体二聚体单分子晶体示意图。
具体实施方式
27.下面通过实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
28.实施例1
29.本发明的一种人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构，采用技术方案如下：本发明的一种人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构，所述的人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构的氨基酸序列如seq id no.1所示。
30.所述的人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构的一个晶格由4个蛋白分子组成，分别为：chain a、chain b、chain c、chain d。
31.所述的蛋白晶体每个单分子含有4个repeat，所述的每个repeat由5个α螺旋和连接他们的loop组成。
32.所述的每个repeat由约70个氨基酸组成的5个α螺旋和连接其的loop组成，属于一种典型的膜联蛋白annexins家族类蛋白。
33.所述的人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构的晶型外形为块状晶体，空间群为p21212；所述的人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构的晶胞参数为a为b为c为α＝β＝γ＝90
°
。
34.所述的chain a-chain d，chain b-chain c，chain c-chain a之间形成强分子间作用力。
35.本发明的一种人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构的制备方法，包括如下步骤：(1)将人源膜联蛋白的基因序列通过ecori和xholi酶切位点连接至pet-28a(+)质粒上，将表达载体转入宿主大肠杆菌bl21(de3)中表达，通过亲和层析纯化，获得高纯度蛋白；
36.(2)将蛋白浓缩为10mg/ml的蛋白水溶液，将蛋白溶液与池液混合，采取坐滴法对结晶条件进行高通量筛选；对结晶条件进行正交优化，制得人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构。所述的池液含有0.2m氯化钠，0.1m 4-羟乙基哌嗪乙磺酸的ph为6.5和16％聚乙二醇单甲醚3000。
37.本发明所述的人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构的解析方法，包括如下步骤：从母液中可以获得晶体，利用液态氮气流快速冷冻，在100k下利用x射线源获得的晶体数据，具体过程如下：
38.首先使用的尼龙晶体环(如hampton research公司的)，从晶体浸泡液中获取适宜x射线衍射的晶体，并迅速使用冷却系统(如oxford cryosystem公司的)产生的低温氮气流中冷冻至零下150-180℃；使x射线通过晶体，利用旋进法收集x射线衍射数据；收集到晶体的x射线衍射数据后，按照下述步骤进行相应的数据处理：(1)使用hkl2000等软件对上一步骤中收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；(2)使用ccp4程序包中的phaser、molrep等软件，利用分子置换(mr，molecular replacement)方法，以已知的膜联蛋白的结构为搜索模型，制得人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构。
39.实施例2
40.实施例2与实施例1的区别在于：本发明的一种人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体结构的制备方法，包括如下步骤：在步骤(1)中，将人源膜联蛋白a5突变体基因序列与pet-28a(+)质粒相连接，将表达载体转入宿主菌bl 21(de3)中表达，可获得可溶表达产物；培养条件是：采用lb培养基培养，按照2％比例扩大培养，培养到一定时间加入iptg诱导，诱导时间为20h；离心收集菌体超声破碎，离心收集上清液，用亲和层析柱进行蛋白粗酶液的纯化，最后用10kd横纵切向流超滤膜获得浓缩后的高浓度蛋白溶液；利用hiload 16/60superdex 200分子筛进一步纯化蛋白，实验流程为：先用1.2倍柱体积的buffer(10mm tris，100mm nacl，ph 8.5)平衡分子筛，流速1ml/min；将5ml离心后的蛋白加载到分子筛，收集洗脱的蛋白，并用sds-page鉴定。
41.在步骤(2)中，将分子筛纯化后的蛋白浓缩到10mg/ml，用坐滴法对初始结晶条件进新了高通量筛选,共筛选出了10个结晶kit；2天后，在含有0.2μl蛋白和0.2μl池液的结晶液滴中长出了晶体；对培养条件进行优化，优化后，含有2μl蛋白溶液和1μl池液的结晶液滴中长出的晶体符合要求。所述的池液含有0.2m氯化钠，0.1m 4-羟乙基哌嗪乙磺酸ph 7.2和22％聚乙二醇单甲醚3000。
42.实施例3
43.实施例3与实施例1的区别在于：
44.所述的池液含有0.2m氯化钠，0.1m 4-羟乙基哌嗪乙磺酸的ph为7.5和26％聚乙二醇单甲醚3000。
45.试验例1
46.人源膜联蛋白a5突变体二聚体的表达与纯化
47.人工合成编码人源膜联蛋白a5突变体的dna序列。用双酶切位点(ecori和xholi)连入pet-28a(+)载体中。将重组质粒转化大肠杆菌bl 21(de3)感受态细胞，将所得到的转化子克隆挑取转接入适量lb培养基(加入卡那霉素至终浓度为50μg/ml)中，37℃培养至600nm吸光度为0.8，加入诱导剂异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.5mm，20℃诱导20h。以4200r/min离心30min收取菌体后，用缓冲液：20mm tris-hcl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，ph 8.0以菌体：缓冲液＝1(g)：10(ml)比例加入缓冲液使菌体重悬。菌体重悬，高压破碎后，以12000r/min低温离心40min去除沉淀和其他颗粒状杂质。将离心后上清液与ni-nta亲和介质结合后，用含有500mm氯化钠、100mm磷酸盐缓冲液、20mm咪唑的缓冲液
冲洗介质，去除杂蛋白。最终用含有500mm氯化钠、100mm磷酸盐缓冲液、500mm咪唑的洗脱液将目的蛋白从亲和介质上洗脱下来，收集各个不同浓度洗脱液的峰尖蛋白，利用sds-page电泳检测。以10kd横纵切向流超滤膜将洗脱液浓缩并更换至20mm tris-hcl，ph 8.5的缓冲液里储存，用液氮速冻后放置-80℃冰箱保存。
48.试验例2
49.人源膜联蛋白a5突变体二聚体晶体的筛选与优化
50.缓冲液:10mm tris-hcl、100mm nacl ph 8.5；分子筛：hiload 16/60superdex 200
51.实验流程：先用1.2倍柱体积的缓冲液平衡分子筛，流速为1ml/min；将5ml离心后的蛋白加载到分子筛，收集洗脱的蛋白，并用sds-page电泳鉴定(结果如图1所示)。
52.将经过分子排阻层析纯化后的蛋白浓缩到10mg/ml，用坐滴法对初始结晶条件进新了高通量筛选，共筛选了10个结晶kit。2天后，于16摄氏度，在含有0.2μl蛋白和0.2μl池液(0.2m氯化钠，0.1m hepes ph 6.5，26％(w/v)polyethylene glycol monomethyl ether 3000)的结晶液滴中长出了晶体。优化后，含有2μl蛋白和1μl池液(0.2m氯化钠，0.1m hepes ph 7.2，26％(w/v)polyethylene glycol monomethyl ether 3000)的结晶液滴中长出了形状较好的晶体(结果如图2、图3所示)。
53.试验例3
54.人源膜联蛋白a5突变体二聚体晶体结构的解析
55.从母液中可以获得晶体，利用液态氮气流快速冷冻，在100k下利用x射线源获得的晶体数据，具体过程如下：
56.首先使用的尼龙晶体环(如hampton research公司的)，从晶体浸泡液中获取适宜x射线衍射的晶体，并迅速使用冷却系统(如oxford cryosystem公司的)产生的低温氮气流中冷冻至零下150-180℃；使x射线通过晶体，利用旋进法收集x射线衍射数据。收集到晶体的x射线衍射数据后，按照下述步骤进行相应的数据处理：(1)使用hkl2000等软件对上一步骤中收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；(2)使用ccp4程序包中的phaser、molrep等软件，利用分子置换(mr，molecular replacement)方法，以已知的膜联蛋白的结构(1anx)为搜索模型，得到人源膜联蛋白a5突变体二聚体的初始结构，再继续使用phenix软件对人源膜联蛋白a5突变体二聚体的初始结构进行结构优化。
57.人源膜联蛋白a5突变体二聚体晶体一个晶格含有4个蛋白分子，分别为：chain a、chain b、chain c、chain d。晶胞参数为晶胞参数为α＝β＝γ＝90
°
。tp52s的晶胞参数如表1所示。
58.表1
[0059][0060]
试验例4
[0061]
人源膜联蛋白a5突变体二聚体的晶体空间结构特征
[0062]
如图4所示，该人源膜联蛋白a5突变体二聚体晶体每个晶格有4个蛋白分子，分别为chain a、chain b、chain c、chain d。所述的chain a-chain d，chain b-chain c，chain c-chain a之间形成强分子间作用力。
[0063]
每个单分子由322个氨基酸组成，含有4个repeat重复单元，每个重复单元由约70个氨基酸形成的α螺旋组成(图5)。
[0064]
实施例4
[0065]
人源膜联蛋白a5突变体二聚体蛋白急性毒性评价
[0066]
实验组设置有缓冲液空白组(生理盐水，阴性对照组)，人源膜联蛋白a5蛋白，人源膜联蛋白a5突变体二聚体蛋白三组。实验动物采用icr小鼠(常州卡文斯实验动物)，各组总共20只小鼠，雌雄各半。采用小鼠尾静脉单次给药，蛋白注射剂量为700-1000mg/kg，同时设置空白组。
[0067]
单次给药后，连续观察2周，并记录相关信息，相关实验与观察在江苏靶标生物医药研究所有限公司完成。
[0068]
对照组无明显症状。人源膜联蛋白a5蛋白注射组，注射当天小鼠出现嗜睡；注射后第二天小鼠精神萎靡，活动减少等情况。人源膜联蛋白a5突变体二聚体蛋白注射组，注射当天小鼠出现精神不振、活动力下降等情况；注射后第二天，小鼠精神不振，活动力下降甚至趴着不动，眼睛分泌物增多甚至眼睛无法睁开；小鼠活动力下降症状较轻者第5天恢复正
常，重者第12天恢复正常；眼睛分泌物增多症状轻者第3天即恢复正常，重者第6天恢复正常。
[0069]
对照组小鼠解剖后，小鼠各脏器正常，无明显出血点和水肿。人源膜联蛋白a5蛋白注射组，死亡小鼠和存活小鼠在死亡当天或实验结束时均进行解剖，结果发现，各小鼠主要脏器无明显异常变化。尽管注射人源膜联蛋白a5突变体二聚体蛋白后小鼠体重下降，但小鼠未出现明显解剖异常变化。
[0070]
综合上面的毒性实验结果，除了人源膜联蛋白a5蛋白组70％小鼠(雌性小鼠全死)死亡外，其余各组小鼠均存活，人源膜联蛋白a5突变体二聚体蛋白的小鼠静脉给药mld(最小致死剂量)》700mg/kg，其毒性远低于人源膜联蛋白a5，安全性远远好于人源膜联蛋白a5，是开展人源膜联蛋白相关药物研发的很好的起点和基础，更重要的是人源膜联蛋白a5突变体二聚体蛋白的ps结合能力更强，是人源膜联蛋白a5对ps结合力的4.5倍。
[0071]
因人源膜联蛋白a5蛋白的缓冲液成分和内毒素水平与空白缓冲液组一致，因此，可以排除内毒素原因造成小鼠较高死亡率，其他蛋白组小鼠正常存活也说明了这一点。人源膜联蛋白a5突变体二聚体蛋白组小鼠也全部存活，但是体重在实验2-10天内显著低于对照组，之后恢复；另外，和人源膜联蛋白a5蛋白组一样，人源膜联蛋白a5突变体二聚体蛋白组也出现精神不振、活动力下降等现象。
[0072]
缓冲液组、人源膜联蛋白a5突变体二聚体蛋白组小鼠存活，排除了蛋白缓冲液中其他成分如内毒素对小鼠的影响，因此，人源膜联蛋白a5蛋白致小鼠70％死亡的原因可能是蛋白本身原因，如钙离子结合力、ps亲和力、抗凝活性和免疫原性等方面。
[0073]
以上所述，对本发明通过说明及具体实施方式进行了阐述，在本发明的基础上，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。