一种肿瘤干细胞获取方法

1.本发明属于细胞生物学领域，尤其是涉及一种肿瘤干细胞获取方法。


背景技术：

2.肿瘤干细胞(cscs)是一种具有类似于体细胞干细胞能力的癌细胞亚群。cscs在肿瘤的发生、转移、复发和耐药过程中起着关键作用。绝大部分的肿瘤被认为起源于cscs，这可能是导致肿瘤临床治疗原发性和获得性耐药的重要原因之一，因此，近年来对于肿瘤干细胞的研究吸引了国内外肿瘤基础科研的广泛关注。
3.目前肿瘤干细胞主要从肿瘤组织及肿瘤细胞系中获得，由于从临床来源的肿瘤组织获得有限，且部分肿瘤组织需要进行临床病理分析，用来分离肿瘤干的大部分肿瘤组织以癌旁组织为主，这也制约着肿瘤干细胞的获取。从肿瘤细胞系获得肿瘤干细胞也存在一定局限，比如肿瘤细胞系具备干性的细胞比例低，利用磁珠或者流式细胞仪分选时会造成一定干细胞的损失，最终导致获得的肿瘤干细胞偏低或者分离失败等风险。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明旨在提出一种肿瘤干细胞获取方法，以肿瘤干细胞分选前进行干性培养，并通过低温刺激等方法，以激活并扩增起始肿瘤干种子细胞，并通过磁珠/流式分选，并在分选后培养过程中去除贴壁的无干性特征的胶质瘤细胞，以获得肿瘤干细胞，为目前肿瘤干资源匮乏提供了夯实的技术基础。
5.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
6.一种肿瘤干细胞获取方法，该方法包括如下步骤：
7.1)胶质瘤细胞系u118mg干性培养，并在培养过程中进行低温刺激；
8.2)免疫磁珠分选；
9.3)分选后差速贴壁纯化；
10.4)肿瘤干快速扩增。
11.进一步，低温刺激的方法为：在4℃-10℃的环境下培养1-5次，每次10-30分钟。
12.进一步，步骤1)具体包括如下步骤：将u-118mg细胞接种在肿瘤干细胞培养基中培养3-5天，肿瘤干细胞培养基为包含1-40ng/ml的bfgf、1-20ng/ml的egf、0.5-4％的b27-50x、0.1-0.4％青链霉素-100x的dmem/f12无血清完全培养基。
13.进一步，在进行步骤1)之前还包括u118mg细胞复苏和u-118mg细胞传代。
14.进一步，u118mg细胞复苏包括如下步骤：从液氮罐中取出冻存的u-118mg细胞，迅速置于37℃水浴锅内快速解冻，然后吸取细胞悬液到预先放置的盛有6ml预热的基础培养基的离心管中离心，弃去上清液后对细胞进行培养。
15.进一步，u-118mg细胞传代以u-118mg细胞生长密度达到培养瓶底面积的95％以上进行细胞传代，包括如下步骤：使用胰酶对培养后的细胞进行消化，消化终止使细胞复悬；对细胞悬液进行离心，弃上清，之后进行细胞培养。
16.进一步，步骤2)具体包括如下步骤：
17.1)对步骤1)得到的细胞结构进行消化处理并重悬，对细胞悬液离心，收集细胞沉淀，并再次重悬；
18.2)向细胞悬液中加入fcr阻断试剂、cd133磁珠，充分混匀后在冰箱中孵育；
19.3)对孵育后的细胞清洗、离心、重悬，之后加入分离柱中洗去未标注的细胞cd133细胞，使阳性细胞cd133
+
留在分离柱内。
20.进一步，在步骤3)之后、步骤4)之前还包括对肿瘤干细胞的鉴定。
21.进一步，肿瘤干细胞的鉴定包括如下步骤：
22.1)收集培养后的细胞并进行消化，向细胞中加入4％多聚甲醛固定液固定15min，之后离心并复悬；
23.2)分别向细胞悬液中加入fitc-cd133、apc-oct4、pe-cd44抗体各2μl，室温避光孵育1h；
24.3)pbs清洗去除未结合的cd133、oct4、cd44抗体；
25.4)进行流式细胞仪检测。
26.相对于现有技术，本发明所述的肿瘤干细胞获取方法具有以下优势：
27.本发明所述的肿瘤干细胞获取方法改进肿瘤干细胞提取的方法，将胶质瘤细胞系进行干性培养，干性培养过程中对细胞进行低温刺激等手段，以激活并扩增起始肿瘤干种子细胞，然后利用干性相关标志物进行分选，分选后培养过程中去除贴壁的无干性特征的胶质瘤细胞，该类细胞表达三种干细胞特异性生物标记物(cd133
+
、oct4
+
和cd44
+
)，并显示出多系分化的干细胞样特征，此方法能够快速扩增大量肿瘤干细胞，以满足常规肿瘤生物医学基础研究、临床研究以及抗肿瘤药物开发等工作需求。
附图说明
28.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
29.图1为肿瘤干细胞图。
30.图2为肿瘤干细胞流式鉴定图；
31.图3为本发明实施例培养的肿瘤干细胞图；
32.图4为本发明对比例培养的肿瘤干细胞图。
具体实施方式
33.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
34.下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
35.肿瘤干细胞获取方法具体包括如下步骤：
36.1)u118mg细胞复苏：将癌细胞培养液及dmem/f12基础培养基于水浴锅内预热至37℃,在15ml离心管中加入6ml预热的基础dmem/f12培养基。从液氮罐中取出冻存的u-118mg细胞，迅速置于37℃水浴锅内快速解冻(解冻程度以冻存管中剩余少量冰晶为宜)，然后吸取细胞悬液到预先放置的盛有6ml基础培养基的离心管中，室温1000r/min离心5min，弃去
上清液后加入适量培养液，细胞浓度为1
×
105细胞/ml种植于培养瓶中，置于37℃、5％co2培养箱中培养，每2d进行一次换液处理。
37.2)u-118mg细胞传代：u-118mg细胞生长密度达到培养瓶底面积的95％以上进行细胞传代。
38.具体步骤：
39.(1)提前将培养基及pbs 37℃预热。
40.(2)吸除细胞培养液，加入少量pbs润洗细胞。
41.(3)吸除pbs加入适量胰酶，使胰酶能够覆盖细胞，然后放入37℃、5％co2培养箱中消化3min左右，当细胞趋于圆形、细胞间隙变大且有少量细胞漂起时加入2倍胰酶体积的培养基终止消化，用枪头轻轻吹打细胞，使细胞完全悬浮。
42.(4)收集细胞悬液，室温1000r/min离心5min,吸弃上清，用培养基吹悬，使细胞浓度为1
×
105个细胞/ml种植于培养瓶中，置于37℃、5％co2培养箱中培养。
43.3)肿瘤细胞干性培养：细胞以1
×
105个细胞/ml接种在肿瘤干细胞培养基中培养4天，每100ml培养基包含10ng/ml的bfgf、20ng/ml的egf、2ml的b27-50x、200μl青链霉素-100x的dmem/f12无血清完全培养基，并在培养过程中在4℃的环境下培养3次，每次15分钟。
44.4)免疫磁珠分选：严格按照miltenyi biotec磁珠分选说明书进行分选操作，具体步骤如下：
45.(1)pbs清洗u-118mg贴壁细胞以去除死细胞，加胰酶进行消化处理。
46.(2)使用基础培养基重悬细胞，1000r/min的速度离心5min，收集细胞沉淀。
47.(3)以107个总细胞加入60μl缓冲液重悬细胞沉淀。
48.(4)每107个总细胞加入20μl fcr阻断试剂。
49.(5)每107个总细胞加入20μl cd133磁珠，充分混匀后在冰箱中(2-8℃)孵育15min。孵育时使用macsmix旋转器缓慢连续旋转以防止细胞沉淀。
50.(6)对孵育好的细胞进行清洗，加入1-2ml缓冲液洗涤细胞，然后以300g/min的速度离心10min，吸弃上清液。
51.(7)以107个细胞使用500μl缓冲液吹悬细胞(107个细胞)。
52.(8)将分离柱子(500μl)放入分离器中，使用润洗液润洗分离柱。
53.(9)将孵育好的细胞缓慢的加入分离柱中，收集未标注的细胞再一次加入分离柱中。
54.(10)用适量缓冲液清洗柱子，重复3次，此步骤为了洗去未标注的细胞(cd133)细胞，使阳性细胞(cd133
+
)留在分离柱内。
55.(11)从分离架上取下分离柱，把分离柱放在收集管上进行洗脱。
56.5)分选后的细胞成球培养：将磁珠分选后的细胞以1
×
105个细胞/ml接种在肿瘤干细胞培养基中，成球培养的第一代细胞贴壁的较多，收集成球生长的细胞，进行胰酶消化，反复收集成球细胞去除贴壁细胞有利于纯化肿瘤干细胞，经过反复多次传代后获得完全悬浮成球生长的干性细胞。
57.6)肿瘤干细胞鉴定：(1)收集成球的u-118mg干性细胞，经0.05％胰酶消化，培养基终止，1000r/min的速度离心5min，pbs洗涤后重悬计数。
58.(2)将细胞悬液经1000r/min的速度离心5min，弃上清。
59.(3)加入4％多聚甲醛固定液固定15min后pbs清洗，1000r/min的速度离心5min，pbs吹悬制成密度为1
×
106个细胞/ml的细胞悬液。
60.(4)分别加入fitc-cd133，apc-oct4，pe-cd44抗体各2μl(按照美天旎抗体说明书建议比例1:50稀释抗体)，室温避光孵育1h。
61.(5)pbs清洗3次，以去除未结合的cd133，oct4，cd44抗体。
62.(6)细胞重悬于500μl pbs中，进行流式细胞仪检测，如图2所示。
63.7)肿瘤干快速扩增：将磁珠分选后的细胞以1
×
105个细胞/ml接种在肿瘤干细胞培养基中，虽然去除血清，但培养基中添加了细胞生长的多个生长因子，如bfgf，egf等血清替代物，还保留了细胞赖以生存的必须营养物质，如胰岛素、转铁蛋白等。在没有血清促分化剂的情况下，分选后的细胞更有利于悬浮成球生长。
64.该方法获取的肿瘤干细胞如图1所示，所获得的肿瘤干细胞悬浮生长，并聚集成球生长。
65.通过流式鉴定图2可知，所获得的肿瘤干细胞具备cd133
+
cd44
+
oct4
+
三阳性特性。
66.对比例
67.在上述实施例的基础上，在肿瘤细胞干性培养过程中不进行低温刺激。
68.培养结果如图4所示，从图4中可以看出细胞成球效果差，还有大部分细胞是贴壁生长状态，说明低温条件能够刺激肿瘤干细胞的生长。
69.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。