DS早期筛查试剂盒、基因芯片和测试仪的制作方法

ds早期筛查试剂盒、基因芯片和测试仪
技术领域
1.本发明属于医疗技术领域，具体涉及ds早期筛查试剂盒、基因芯片和测试仪。


背景技术：

2.唐氏综合征(down syndrome，ds)即21-三体综合征，又称先天愚型或down综合征，是由染色体异常(多了一条21号染色体)而导致的疾病。60％患儿在胎内早期即流产，存活者有明显的智能落后、特殊面容、生长发育障碍和多发畸形。1866年，dr.johnlangdondown第一次对唐氏综合征的典型体征包括这类患儿具有相似的面部特征进行完整的描述并发表，因此，这一综合征以其名字命名为唐氏综合征(down综合征)。1959年证实了唐氏综合征是由染色体异常而导致的。现代医学证实，唐氏综合征发生率与母亲怀孕年龄有相关，系21号染色体的异常，有三体、易位及嵌合三种类型。【本段内容来自百度百科：唐氏综合征】
3.唐氏筛查是唐氏综合症产前筛选检查的简称。目的是通过化验孕妇的血液，检测母体血清中甲型胎儿蛋白、绒毛促性腺激素和游离雌三醇的浓度，并结合孕妇的年龄，体重，孕周等方面来判断胎儿患先天愚型、神经管缺陷的危险系数。唐氏筛查结果为“高危”的孕妈妈需要确诊胎儿是否为唐氏综合症患儿。目前产前诊断最常用的技术是羊膜腔穿刺技术，即在b超指引下，将针通过孕妇腹部刺入羊水中，抽取羊水，对胎儿细胞进行染色体分析。【本段内容来自pcbaby百科：唐氏综合症筛查什么时候做】
4.因而，对唐氏综合症羊水差异蛋白进行筛选和鉴定，进而开发出专用的ds早期筛查基因组、ds早期筛查试剂盒、ds早期筛查基因芯片以及ds早期筛查测试仪对于ds的防治具有重要的意义。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明公开了ds早期筛查试剂盒、ds早期筛查基因芯片以及ds早期筛查测试仪，以解决现有技术中存在的技术问题。
6.本技术为解决其技术问题而采用的技术方案为为：
7.一种ds早期筛查试剂盒，其特征在于：包括能够扩增筛查标记物的引物，所述筛查标记物包括rraga_human、csn1_human、cspg4_human、rad26_human、a2ml1_human、ldhb_human和basp1_human。
8.一种ds早期筛查基因芯片，其特征在于：包括能够与筛查标记物杂交的探针，所述筛查标记物包括rraga_human、csn1_human、cspg4_human、rad26_human、a2ml1_human、ldhb_human和basp1_human。
9.一种ds早期筛查测试仪，其特征在于：使用前述ds早期筛查试剂盒和/或ds早期筛查基因芯片进行唐氏综合症的早期筛查。
10.有益的技术效果：
11.本技术公开的ds早期筛查试剂盒、ds早期筛查基因芯片和ds早期筛查测试仪，能够通过对筛选标记物的基因检测，对唐氏综合症进行有效的早期筛查，具有一定的实用价
值和技术进步意义。
12.以下结合说明书附图和具体实施方式，对本技术的技术方案和技术效果进行详细介绍。
附图说明
13.图1：正常组羊水和病例组羊水的二维凝胶电泳扫描结果。
具体实施方式
14.本技术公开的唐氏综合症羊水差异蛋白筛查标记物的筛选与鉴定步骤为：
15.1、材料与方法
16.1.1材料与试剂
17.羊水上清标本来源于深圳市宝安区妇幼保健院产前诊断中心,孕周为16-20周,羊膜腔穿剌前均巳签署知情同意书。应用低丰度蛋白富集试剂盒、bradford测定法蛋白测定试剂盒、3-10两性电解质、2-d蛋白净化试剂盒、血浆血清处理试剂盒、chaps两性离子去垢剂、总蛋白提取试剂盒、分离胶缓冲液、ief样本缓冲液、碘乙酰胺、矿物油、甲叉/丙烯酰胺预混液37.5：1，尿素(urea)购自伯乐公司，去高丰度蛋白提取试剂盒(sigma)，sds、苯甲基磺酰氟(pmsf)、过硫酸铵(ammonium persulfate)、硫脲(thiourea)购自sigma、考马斯亮蓝g250购自上海生工，dtt购自solarbio、盐酸、丙酮、三氯乙酸、甲醇、乙醇、冰乙酸均购自广州化学试剂厂。ph4-7/7cm/12胶条、电极滤纸购自伯乐公司、超滤离心管、购自millipore。
18.1.2仪器设备
19.等电聚焦电泳系统(ief
tm
system)、垂直电泳仪(proteanⅱxi 2-d cell)、图像分析软件、扫描仪(model gs-800 calibrated imaging)电源(powerpac
tm
hv)、紫外一可见微量分光光度计(merinton sma4000)、台式高速冷冻离心机(eppendorf)、振荡器，移液器(thermo)。
20.1.3方法
21.1.3.1羊水上清分离
22.将羊水标本以1500g，离心10min，细胞沉淀部分用于细胞培养和染色体核型分析，上清部分(10ml)立即放入-80℃保存。分别选择正常核型的羊水上清10例、唐氏综合症的核型羊水上清标本10例，用于羊水蛋白组学实验分析。
23.1.3.2样本浓缩
24.样本取出复温，加入1mmol的苯甲基磺酰氟pmsf，混匀。然后对其进行配平离心，20min12000rpm，离心完后取上清去除下沉淀。而后加到适当的量到10k的超滤管中进行超滤，离心。最后超滤剩下的上层体积约200左右就可以停止超滤了。吸出上层的蛋白液到新的ep管中，置冰上。
25.1.3.3去高丰度蛋白
26.取400μl树脂均化液，在2.0ml过滤柱离心管内用10000r/min离心10分钟，取出保存液。加入400μl平衡液，离心10分钟，清洗树脂，重复操作一次。取80μl血清样本加入树脂中，吸附10分钟，再离心10分钟，用100μl平衡液洗涤，离心10分钟，加入滤液后，加入4倍体
积的丙酮沉淀，在-20℃下过夜。沉淀蛋白在12000r/min下在4℃离心20分钟，除去上清液，干燥，并在-80℃下保存，以备以后使用。
27.1.3.4二维凝胶电泳
28.每块凝胶上样500μg，与水合溶液(7m尿素，2m硫脲，2％chaps，0.4％dtt，0.5％ipg缓冲液)混匀，装载量为500μl。将ipg胶条(24cm，ph3-10)在平衡缓冲液ⅰ和ⅱ中各平衡15分钟，覆盖矿物油。等电聚焦程序为500v 1h
→
1000v 1h
→
8000v 3h
→
8000v 5：20h，总电压时间乘积为6000vh。等电聚焦结束后，将胶条置于平衡溶液(50mm tris-hcl ph8.8，6m尿素，2％sds，30％甘油)中，e平衡2次。第一次浓度添加为20mg/ml的dtt溶液平衡10分钟，第二次浓度添加为25mg/ml的iaa平衡15分钟。平衡完成后，将粘胶条放置在12％ssds凝胶的顶部，用琼脂糖密封溶液固定和去除气泡以进行第二次方向凝胶电泳。
29.1.3.5凝胶图像获取与分析
30.用考马斯亮蓝染液将电泳胶染色，并使用10％乙酸脱色。扫描完后，用保鲜膜将凝胶包好置于4℃冷藏。应用分析软件imagemaster 2d platinum 6.0(ge)对凝胶图像进行分组、背景消减、强度纠正、蛋白点检测、点配对等。
31.1.3.6质谱处理与数据分析
32.选择正常组与对照组间差一点，切取这些点脱色、酶切、肽段抽取、质谱分析。uv波长设置为355nm，速率200hz，加速电压为20000v，最优质量分辨率为1500da，扫描质量范围为700-3200da，采集信号。内标质谱仪的胰蛋白酶自动检测校准，所有实验样品的质谱都是在默认模式下得到的。
33.1.3.7数据库检索
34.采用软件flexanalysis(bruker-dalton)对基线峰值进行滤波，识别信号峰值。利用生物工具(bruker-dalton)软件对ncbi数据库进行检索，找出匹配的相关蛋白，同时查询其功能，确定识别出的蛋白种类。
35.2、结果分析
36.2.1二维凝胶电泳结果
37.用imagemaster 2d platinum 6.0软件分析正常羊水和唐氏综合症羊水的二维凝胶电泳扫描结果(图1)，同一蛋白样品重复3次，蛋白点重复性、稳定性均良好。正常羊水组可识别蛋白点数为1236
±
35个。唐氏综合症病例组可辨识蛋白点数为1156
±
29个。以等电点4-9和分子量30-100kd间蛋白点分布最多。在两组样品的比较中，匹配差异表达蛋白点的比例大于2，并且在同一组三个凝胶图谱中的所有相同的蛋白质点被认为是差异表达的蛋白质。
38.2.2质谱鉴定结果
39.在胶图中选择匹配较佳的18个差异蛋白点进行分析，经酶解等过程，进行maldi-tof-ms分析，得到蛋白质点的肽质量指纹图。应用肽质量指纹图谱，通过mascot查询软件搜索swissprot数据库，在这些蛋白点中，有7个差异表达蛋白点被成功鉴定，经鉴定的这些蛋白请参考表格1。其中除第23号蛋白为低表达外，其余鉴定蛋白均为高表达。
40.表格1经鉴定的蛋白
[0041][0042]
3、讨论
[0043]
产前筛查的血清学标记物包括妊娠相关血清蛋白a(pregnancy-associated plasm protein a，papp-a)，甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，afp)，人绒毛膜促性腺激素(hcg)和游离雌三醇(steroid hormone unconjugated estriol，ue3)和抑制素a(inhibin a)。这些生化标记为来源于胎儿肝脏和胎盘滋养层细胞，根据不同地区的情况，ds的检出率在70-90％，存在约5％的假阳性率，说明唐氏综合症的早期筛查还需要更有效的分子标志物。
[0044]
本技术以唐氏综合症和正常羊水上清为研究对象，对唐氏综合症在二维凝胶电泳图谱中出现的差异蛋白进行maldi质谱和生物信息学分析，成功鉴定了7个蛋白。与正常组相比，rraga_human、csn1_human、cspg4_human、rad26_human、a2ml1_human、ldhb_human为高表达，basp1_human为低表达。
[0045]
4、应用
[0046]
基于筛查结果，本技术公开了ds早期筛查试剂盒、基因芯片和测试仪。ds早期筛查试剂盒包括能够扩增筛查标记物的引物，筛查标记物包括rraga_human、csn1_human、cspg4_human、rad26_human、a2ml1_human、ldhb_human和basp1_human。ds早期筛查基因芯片包括能够与筛查标记物杂交的探针，筛查标记物包括rraga_human、csn1_human、cspg4_human、rad26_human、a2ml1_human、ldhb_human和basp1_human。
[0047]
本技术ds早期筛查试剂盒和基因芯片的具体应用结果请参阅表格2和表格3。
[0048]
表格2 ds早期筛查试剂盒和基因芯片临床应用结果统计表
[0049][0050]
表格3 ds早期筛查试剂盒和基因芯片已确诊病例检测统计表
[0051][0052]
由以上统计结果可知，本技术公开的ds早期筛查试剂盒和基因芯片能够通过对筛查标记物的基因检测，对唐氏综合症进行有效的早期筛查，具有一定的实用价值和技术进步意义。
[0053]
以上结合说明书附图和具体实施例对本发明的技术方案和技术效果进行了详细阐述，应该说明的是，说明书中公开的具体实施方式仅是本发明较佳的实施例而已，所述领域的技术人员还可以在此基础上开发出其他的实施例；任何不脱离本发明创新理念的简单变形和等同替换均涵盖于本发明，属于本专利的保护范围。