用于鉴别马哇椰子的InDel标记及其应用

用于鉴别马哇椰子的indel标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学及生物信息学领域，具体涉及用于鉴别马哇椰子的indel标记及其应用。


背景技术：

2.椰子(cocos nucifera l.)是棕榈科椰子属中唯一的一个种，属于单子叶多年生常绿乔木，其浑身是宝，被誉为“生命之树”是热带地区重要的木本油料作物和食品能源作物，经济寿命达40-80年，自然寿命可达100年以上。
3.按照常规分类方法可将椰子分为高种椰子、矮种椰子以及介于高种和矮种之间的中间类型。其中高种椰子的主要特征为植株高大，椰干基部膨大呈“葫芦头”，异花授粉；而矮种椰子植株矮小，椰干基部没有“葫芦头”，自花授粉，经济寿命和自然寿命较短；中间类型则介于以上两者之间。此外，在各类变种中根据果实大小、果实形状和果皮颜色等，又将椰子种质资源分为若干类型，例如矮种椰子可根据果皮颜色分为黄矮、红矮、褐矮和绿矮等。
4.马哇椰子是法国油料油脂研究所(irho)在科特迪瓦试验站用马黄矮和西非高种杂交而成。马哇于1979年首次引进海南岛，经多年布点试种观察，结果表明：
①
马哇种比海南高种(对照)生长快，投产早，产量高。
②
马哇种的生育习性和果实主要营养(椰干、脂肪、蛋白质等)含量以及抗病、虫能力与海南高种无显著差异。
③
马哇种的不良性状有：果实偏小，叶痕距大，树干拔高太快，底层老叶衰落过早，同时，叶软而脆，抗风能力较次。尽管马哇种抗风、寒(幼龄期)能力比海南高种略次，但即使是在海南岛北部重风害和低温区之一的文昌县种植，仍能获得高产，其产量仍比海南高种高50％，甚至1倍以上，因此经济效益较高，马哇椰子可在海南岛已有的高种椰区种植，而在东南沿海的万宁、陵水、三亚和乐东一带种植更能表现其高产特性。
5.indel标记(insertion-deletion)是在全基因组重测序的基础上开发的，是等位基因位点上dna插入或缺失一段短序列产生的多态性变异。简单来说就是两个亲本在全基因组中的差异，对于其中的一个亲本基因组，另外一个亲本中有一定数量的核苷酸的插入或者缺失，可以根据基因组中插入或缺失的位点，设计扩增这些位点的pcr引物，就是indel标记。
6.indels广泛分布在整个基因组中，与其它的分子标记相比，在基因组的相同位置出现相同大小的indel标记的几率很小，避免了后续分析的模糊性。在基因组序列测定的基础上，indel标记可以通过生物信息学的方法方便简单地获得。与ssr标记相比，indel标记的扩增产物带型清晰简单，稳定性和产物分离效果均优于ssr标记。indel标记具有其它分子标记的优点。基于全基因组重测序的indel标记，具有在基因组内分布广、密度高、多态性强、检测容易、分型系统简单、遗传稳定。indel标记适用于全基因组分子标记的开发，目前已开始应用于动植物群体遗传分析、构建高密度分子标记遗传图谱和基因定位、生物的遗传多样性分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于克服现有技术中的不足，首次利用椰子重测序所得的插入和缺失序列开发椰子indel标记，应用多态性indel标记获取部分椰子品种的指纹特征图谱，利用筛选得到的分子标记组合开展椰子品种纯度鉴定和苗种的早期选育，通过分子标记辅助选育缩短椰子新品种的繁育周期。
8.本发明的第一个方面是提供一种用于鉴别马哇椰子的indel标记的引物对，所述indel标记引物对为如seq id no.1-2所述引物对、如seq id no.3-4所述引物对或者如seq id no.5-6所述引物对。
9.本发明的第二个方面是提供一种用于鉴别马哇椰子的indel标记引物组，所述indel标记引物组由以下引物对中的两种或两种以上组成：如seq id no.1-2所述引物对、如seq id no.3-4所述引物对、如seq id no.5-6所述引物对。
10.本发明的第三个方面是提供一种用于鉴别马哇椰子的试剂盒，其包括本发明的第一个方面所述的indel标记引物对或者本发明的第二个方面所述的indel标记引物组。
11.优选地，所述试剂盒还包括进行pcr反应和/或电泳所需的试剂。
12.本发明的第四个方面是提供本发明的第一个方面所述的indel标记引物对或者本发明的第二个方面所述的indel标记引物组或者本发明的第三个方面所述的试剂盒在鉴别马哇椰子中的应用。
13.本发明的第五个方面是提供一种鉴别马哇椰子的方法，采用第一个方面所述的indel标记引物对或者本发明的第二个方面所述的indel标记引物组或者本发明的第三个方面所述的试剂盒进行。
14.优选地，所述方法，包括以下步骤：(1)提取椰子叶片dna；(2)采用indel标记引物对或indel标记引物组或试剂盒对椰子叶片dna进行pcr扩增；(3)对扩增结果进行凝胶电泳检测；(4)根据检测结果对不同品种椰子进行鉴别，凝胶电泳结果显示两条带的为马哇椰子，一条带的为其他品种椰子(如海南高种椰子、红矮椰子、黄矮椰子、褐矮椰子、香水椰子等)。
15.进一步地，凝胶电泳结果显示凝胶电泳结果有两条电泳条带的，且存在电泳结果大于或小于目的条带或目的片段的插入片段的是马哇椰子，而电泳结果显示条带与目的条带或目的片段大小一致的是其他品种椰子，(如海南高种椰子、红矮椰子、黄矮椰子、褐矮椰子、香水椰子等)，其中：当所述indel标记引物对为如seq id no.1-2所示引物对时，目的条带或目的片段为109bp；当所述indel标记引物对为如seq id no.3-4所示引物对时，目的条带或目的片段为140bp；当所述indel标记引物对为如seq id no.5-6所示引物对时，目的条带或目的片段为141bp。
16.如需验证凝胶电泳结果，也可将马哇椰子凝胶电泳结果进行胶回收后测序，以海南高种椰子基因组序列为参照与马哇椰子测序结果进行blast比对，存在插入片段的是马哇椰子。在这种情况下，所述方法，包括以下步骤：
17.(1)提取马哇椰子叶片dna；(2)采用indel标记引物对或indel标记引物组或试剂盒对马哇椰子叶片dna进行pcr扩增；(3)对pcr产物进行聚丙烯酰胺胶电泳检测，并用胶回收试剂盒进行回收；(4)回收产物进行pcr扩增后将pcr产物进行纯化，连接转化后挑单克隆测序；(5)根据测序结果以高种椰子基因组为参照对马哇椰子测序序列进行blast比对，存
在插入片段的是马哇椰子。
18.本发明的有益效果：
19.马哇椰子是马黄矮和西非高种杂交而成。在杂交育种中，确定亲本的品种以及亲缘关系尤为重要，明确的椰子品种是椰子分子育种的重要前提和保障，采用本发明的indel标记引物对或indel标记引物组或试剂盒对椰子进行pcr扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测或者测序，即可根据电泳条带或者测序结果鉴别出马哇椰子品种，可以在苗期到成年大树中随时检测，对于区分马哇椰子与其他椰子品种具有重要意义，鉴定准确率高，能够保证马哇椰子的纯度，在椰子杂交育种领域应用前景广阔。
附图说明
20.图1为本发明的indel标记引物对id251、id314和id317对6个椰子品种扩增产物电泳图。r1、r2和r3为红矮椰子；y1、y2和y3为黄矮椰子；x1、x2和x3为褐矮椰子；g1、g2和g3为香水椰子；m1、m2和m3为马哇椰子；b1、b2和b3为高种椰子。
21.图2为本发明的indel标记引物对id251和id314对马哇椰子的测序比对结果。其中存在插入片段的是马哇椰子。
具体实施方式
22.下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
23.一、椰子叶片的dna提取
24.实验材料：选择6个椰子品种共18个样品，其中马哇椰子3个、海南高种椰子3个、红矮椰子3个、黄矮椰子3个、香水椰子3个、褐矮椰子3个。以上样品均来源于海南省文昌市中国热带农业科学院椰子研究所。
25.椰子叶片的dna提取参考ctab法，具体操作为：
26.称取1g左右椰子叶片，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末，转入2ml离心管中，加1ml提取缓冲液，摇匀后置于冰上；4℃条件下8000r/min离心5min，弃去上清，再次加入1ml提取缓冲液，摇匀后，4℃条件下8000r/min离心5min，弃去上清；加入800μl预热至65℃的裂解缓冲液，摇匀后65℃水浴60min，每10min摇一次；加入等体积加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)抽提液抽提，充分混匀，8000r/min 25℃离心10min，取上清转入新离心管；再加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，充分混匀，8000r/min 25℃离心10min，取上清转入新离心管；加入0.6倍体积的冰冻异丙醇和1/10体积的3m乙酸钠(ph 5.2)，缓慢摇匀至絮状聚合沉淀析出，4℃放置过夜；将沉淀钩出，转入新离心管，用75％的酒精漂洗2次，25℃条件下8000r/min离心5min，倒干酒精；加200μl te缓冲液中溶解，用nanodrop核酸测定仪检测dna的浓度并加te缓冲液将所有dna浓度调至50ng/μl，-20℃保存备用。
27.二、indel标记引物的设计
28.根据香水椰子和黄矮椰子基因组重测序所得大量的序列，以海南高种椰子基因组为参考，通过blastn序列比对，得到indel序列的相关信息，根据插入和缺失序列，从中选取
400个序列片段采用软件primer premier 5.0设计引物，引物设计分为插入缺失片段大小为5bp和＞5bp两种类型。筛选得到3对引物，可用于鉴别马哇椰子，如表1所示。
29.表1用于筛选马哇椰子的indel标记引物
30.引物编号正向引物(5'-3')反向引物(5'-3')产物长度(bp)id251acattcaatcagggaaaaccagttgggtattgcattg109id314tctttgccgtcaccctgtttctccaccattttgacatt140id317tgcaggagggttgctagacattgtgctcccttgattgt141
31.三、鉴别马哇椰子品种
32.1、根据凝胶电泳结果进行鉴别
33.①
indel标记引物对id251
34.用于鉴别马哇椰子品种的indel标记引物对为id251(表1)。采用id251对“一、椰子叶片的dna提取”中所得的不同品种椰子叶片的dna进行pcr扩增；pcr扩增体系为：10
×
buffer(mg 2+
)2μl，4
×
dntp mixture(10mm each)0.5μl；10μmol/l正、反向引物各1.0μl；20ng/μl dna 2μl；5u/μl taq dna聚合酶0.2μl；加无菌ddh 2
o至20μl；pcr扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸50s，重复循环30次；72℃延伸10min。pcr扩增产物中加入3μl 6
×
上样缓冲液混匀后取1.2μl点样，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离条带；聚丙烯酰胺胶30(ml)：ddh2o15.81ml；5
×
tbe 6ml；30％(丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺＝29：1)贮存液7.98ml；10％ap(过硫酸铵)0.21ml，temed15μl，电泳条件为6％page，150v、400ma、30w，电泳时间为1h 20min；使用硝酸银进行染色并拍照。结果见图1，目的条带为109bp，香水椰子、红矮椰子、黄矮椰子、褐矮椰子、海南高种椰子的带型为长度109bp的条带，马哇椰子有两条带，其中一条条带的大小大于目的条带。说明indel标记引物对id251可特异性鉴别马哇椰子。
35.②
indel标记引物对id314
36.采用与
“①
indel标记引物对id251”相同的方法，用indel标记引物对id314(表1)对马哇椰子品种进行鉴别，结果如图1所示，目的条带为140bp，香水椰子、红矮椰子、黄矮椰子、褐矮椰子、海南高种椰子的带型为长度140bp的条带，马哇椰子有两条带，其中一条条带的大小大于目的条带。说明indel标记引物对id314可特异性鉴别马哇椰子。
37.③
indel标记引物对id317
38.采用与
“①
indel标记引物对id251”相同的方法，用indel标记引物对id317(表1)对马哇椰子品种进行鉴别，结果如图1和示，目的条带为141bp，香水椰子、红矮椰子、黄矮椰子、褐矮椰子、海南高种椰子的带型为长度141bp的条带，马哇椰子有两条带，其中一条条带的大小小于目的条带。说明indel标记引物对id317可特异性鉴别马哇椰子。
39.2、根据测序结果进行鉴别或验证凝胶检测结果
40.采用与“上节中
①
indel标记引物对id251”相同的方法，以马哇椰子dna为模板用引物对id251、id314和id317进行pcr扩增，以pcr产物为模板进行胶回收(马哇椰子的电泳结果有两条条带，对两条条带分别进行胶回收)，以回收产物为模板进行pcr扩增，将pcr产物纯化后对纯化产物进行连接转化，挑单克隆进行菌落pcr检测(pcr所用引物为m13通用引物)，挑阳性克隆进行测序分析。以高种椰子基因组为参照，对测序序列进行blast比对，存在插入片段的是马哇椰子(结果如图2所示)。
41.以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。