烟草花叶病毒在刺激巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞中应用

烟草花叶病毒在刺激巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞中应用
技术领域
1.本发明涉及免疫治疗技术领域。更具体地，涉及烟草花叶病毒在刺激巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞中应用。


背景技术：

2.近年来，癌症的免疫疗法成为了治疗癌症的新型高效手段，例如使用靶向细胞程序性死亡配体/受体的抗体来治疗黑色素瘤的免疫检查点疗法，使用嵌合抗原受体t细胞治疗急性淋巴细胞白血病的过继细胞疗法等。然而，由于实体瘤的成纤维化作用，导致淋巴细胞和抗体药物难以有效浸润，故当前的免疫疗法对血液癌症的治疗效果较好，而对实体瘤的治疗效果较差。
3.巨噬细胞作为肿瘤微环境中最主要的浸润免疫细胞，是影响肿瘤进展的重要介质。巨噬细胞可以极化为不同的表型并发挥不同的功能。替代极化的m2型巨噬细胞通常会分泌可以刺激细胞外基质表达并加速肿瘤血管生成的细胞因子，导致肿瘤生长和转移。而促炎极化的m1型巨噬细胞表现出促炎因子分泌的增强，如肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白介素6(il-6)和白介素12(il-12)等，从而促进癌细胞坏死和凋亡。此外，m1型巨噬细胞表达高水平的组织相容性复合物及共刺激因子，如cd80和cd86等，可以进一步激活适应性免疫系统对肿瘤细胞进行杀伤。因此将肿瘤内的巨噬细胞从促进肿瘤发展的m2型巨噬细胞极化成为抑制癌症发展的m1型巨噬细胞成为了提高实体肿瘤免疫疗法的关键。
4.目前，许多基于哺乳动物病原体或病原微生物的m1型巨噬细胞极化方法已经被用于肿瘤治疗的实验或临床研究。例如，溶瘤病毒、腺病毒、李斯特菌等已被证明可以通过刺激巨噬细胞表面的模式识别受体来促进巨噬细胞m1型极化。溶瘤疱疹病毒已经被美国食品药品监督管理局批准用于治疗黑色素瘤。尽管一般实验或临床上使用的哺乳动物病原体经过设计或减毒处理，但在人体内依旧存在严重的复制感染风险，造成系统性的伤害。目前，尚未有关于烟草花叶病毒和巨噬细胞之间关系的报道。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的在于提供一种烟草花叶病毒作为刺激巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞的产品的用途。
6.本发明的另一个目的在于提供一种刺激巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞的方法。
7.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案。
8.第一方面，本发明提供了烟草花叶病毒在制备产品中应用，所述产品的功能是刺激巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞。也就是说，该烟草花叶病毒可以促进巨噬细胞向m1型极化，使其具有杀伤作用，为肿瘤免疫治疗提供治疗方案。
9.进一步的，所述刺激巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞表现为(1)、(2)和/或(3)：
10.(1)增强m1型巨噬细胞相关基因的转录；
11.(2)增强炎性因子的分泌；
12.(3)提高共刺激因子cd86的表达量。
13.进一步的，所述炎性因子包括肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白介素6(il-6)和白介素12(il-12p70)等。所述m1型巨噬细胞相关基因包括cd86、inos、tnfα和il6等。
14.烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，tmv)是一种仅可以感染烟草及其他茄科植物的植物病毒，对人体无感染风险。烟草花叶病毒具有一维棒状结构，由2130个相同的衣壳蛋白围绕一段手性螺旋的rna链组装而成，长约300nm，外直径18nm，内部具有4nm宽的孔道。发明人发现：烟草花叶病毒内部的rna链，或者衣壳蛋白的组装体(不含rna的部分，又称为“病毒样纳米颗粒”)，二者均可通过与巨噬细胞表面的模式识别受体(prrs)作用去刺激巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞。即将其用于刺激免疫细胞，尤其是巨噬细胞，可以产生促炎极化行为，进而达到肿瘤免疫治疗的目的。在本发明中，所述烟草花叶病毒可以包括天然的烟草花叶病毒、自然突变的烟草花叶病毒、基因工程改性的烟草花叶病毒、化学修饰小分子或肽段的烟草花叶病毒、或仅包含衣壳蛋白不包含rna链的烟草花叶病毒样纳米粒子。
15.进一步的，所述巨噬细胞包括巨噬细胞系raw264.7、巨噬细胞系thp-1、巨噬细胞系u937、骨髓诱导的巨噬细胞bmdm、外周血来源的单核巨噬细胞pbmc、肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，tams)或哺乳动物组织来源的原代巨噬细胞。
16.第二方面，本发明提供了一种刺激巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞的方法，所述方法包括将烟草花叶病毒加入到巨噬细胞的培养体系中。
17.进一步的，所述烟草花叶病毒在培养体系中的浓度为5～100μg/ml。
18.进一步的，所述巨噬细胞的培养体系是含10％fbs，1％青霉素和链霉素的dmem培养基。
19.进一步的，所述烟草花叶病毒刺激巨噬细胞的时间为0.5～48h。
20.进一步的，所述烟草花叶病毒包括天然的烟草花叶病毒、自然突变的烟草花叶病毒、基因工程改性的烟草花叶病毒、化学修饰小分子或肽段的烟草花叶病毒、或仅包含衣壳蛋白不包含rna链的烟草花叶病毒样纳米粒子。
21.进一步的，所述巨噬细胞包括巨噬细胞系raw264.7、巨噬细胞系thp-1、巨噬细胞系u937、骨髓诱导的巨噬细胞bmdm、外周血来源的单核巨噬细胞pbmc、肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，tams)或哺乳动物组织来源的原代巨噬细胞。
22.本发明的有益效果如下：
23.使用烟草花叶病毒来刺激巨噬细胞，能有效极化巨噬细胞为m1表型的同时，又避免了哺乳动物病毒的感染风险。
附图说明
24.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
25.图1示出本发明实施例1中烟草花叶病毒的tem电镜图。
26.图2示出本发明实施例2中巨噬细胞raw 264.7经过烟草花叶病毒处理后的cd86蛋白阳性细胞百分数。
27.图3示出本发明实施例3中巨噬细胞raw 264.7经过烟草花叶病毒处理后的cd86蛋白免疫荧光染色；白色：cd86；标尺：20μm。
28.图4示出本发明实施例4中巨噬细胞raw 264.7经过烟草花叶病毒处理后，上清液
中的炎性细胞因子(tnf-α、il-6、il-12p70)含量变化。
29.图5示出本发明实施例5中巨噬细胞raw 264.7经过烟草花叶病毒处理后，其cd86、inos、tnfα和il6基因的转录水平变化。
30.图6示出本发明实施例6中巨噬细胞bmdm经过烟草花叶病毒处理后的cd86蛋白阳性细胞百分数。
31.图7示出本发明实施例7中巨噬细胞bmdm经过烟草花叶病毒处理后的cd86蛋白免疫荧光染色；白色：cd86；标尺：20μm。
32.图8示出本发明实施例8中巨噬细胞bmdm经过烟草花叶病毒处理后，上清液中的炎性细胞因子(tnf-α、il-6、il-12p70)含量变化。
33.图9示出本发明实施例9中巨噬细胞bmdm经过烟草花叶病毒处理后，其cd86、inos、tnfα和il6基因的转录水平变化。
具体实施方式
34.为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
35.下述实施例中的材料，如无特殊说明，均为本领域常用材料，均可从商业途径得到。下述实施例中的细胞培养条件如无特殊说明，均为37℃，5％co2，饱和湿度。
36.本发明的实施例中所使用的试剂、细胞来源如下：
37.dmem培养基、胎牛血清(fbs)和青霉素/链霉素购买自gibco公司。使用时，将fbs和青霉素/链霉素加入到dmem培养基中，使fbs和青霉素/链霉素的终体积分数分别为10％和1％。
38.巨噬细胞系raw264.7购买自国家生物医学实验细胞资源库(bmcr)。骨髓诱导的巨噬细胞bmdm是从balb/c小鼠的骨髓细胞诱导而来。具体方法为，取出小鼠的股骨与胫骨后将骨髓用预冷的pbs冲出。收集骨髓，过200目的细胞滤网后，滤下的细胞置于红细胞裂解液中，4℃静置15min。离心收集剩余细胞，置于含有20ng/ml m-csf、10％fbs、1％青霉素和链霉素的dmem中培养。于第3日、第5日弃旧培养基并更换新鲜的培养基，第7日即为成熟的bmdm细胞。
39.实施例1烟草花叶病毒的获得
40.通过现有技术的方法得到烟草花叶病毒(g.xie,s.gao,j.ou,m.zhu,m.wu,x.ju,z.li,y.tian,z.niu,conjugating peptides onto 1d rodlike bionanoparticles for enhanced activity against gram-negative bacteria.nano lett.21,1722-1728(2021))。方法具体如下：
41.(1)将感染了烟草花叶病毒的烟草科植物nicotiana benthamiana的叶子置于榨汁机中，加入浓度为10mm的pbs(ph 7.4)和β-巯基乙醇(0.2-0.3％)，充分粉碎成匀浆。
42.(2)收集匀浆并使用棉布过滤，收集滤液。将滤液于4℃下8000rpm离心40分钟去除未被过滤的微小叶沫。
43.(3)收集上层清液。冰水浴条件下，向滤液中缓缓加入与滤液等体积的三氯甲烷和正丁醇混合液(1:1)，持续搅拌30分钟。
44.(4)混合液于4℃下6000rpm离心10分钟，提取上层水相。
45.(5)提取的水相中加入分子量为6000的聚乙二醇至质量分数为8％，加入氯化钠至终浓度为0.2m。冰水浴下搅拌30分钟后静置1小时。
46.(6)将混合液于4℃下8000rpm离心40分钟，得到白色沉淀。使用少量浓度为10mm的pbs(ph 7.4)使沉淀复溶。
47.(7)将复溶液于4℃下45000rpm超速离心2.5小时，获得微黄色胶状沉淀。加入适量超纯水复溶后，置于截留分子量为1000kda的透析袋中，纯水透析去除杂质。透析后即获得烟草花叶病毒，其tem照片如附图1所示。
48.实施例2
49.将一定量的烟草花叶病毒加入小鼠巨噬细胞系raw 264.7中，使其终浓度分别为5、25和100μg/ml，常规细胞培养条件下(37℃、5％co2、饱和湿度)共培养24小时。该试验设计未刺激的小鼠巨噬细胞raw 264.7作为阴性对照，细菌脂多糖(lps)和ifn-γ刺激的raw 264.7作为阳性对照，其他所有实验步骤一致。培养结束后，将细胞吹下并收集，使用荧光标记的抗cd86抗体标记细胞。最后使用流式细胞术检测cd86
+
的raw 264.7比例。结果表明，与未刺激的raw 264.7细胞相比，随着烟草花叶病毒浓度的升高，raw 264.7细胞中cd86阳性细胞的百分数逐渐升高(附图2)。
50.实施例3
51.将一定量的烟草花叶病毒加入小鼠巨噬细胞系raw 264.7中，使其终浓度为100μg/ml，常规细胞培养条件下(37℃、5％co2、饱和湿度)共培养24小时。对刺激后的巨噬细胞进行免疫荧光染色标记cd86蛋白，使用激光共聚焦显微镜观察其表面cd86蛋白表达情况(附图3)。结果表明，与未刺激的raw 264.7细胞相比，使用tmv刺激的raw 264.7细胞表面表达更多的m1型巨噬细胞标志物cd86蛋白。
52.实施例4
53.将一定量的烟草花叶病毒加入小鼠巨噬细胞系raw 264.7中，使其终浓度为100μg/ml，常规细胞培养条件下(37℃、5％co2、饱和湿度)共培养24小时。收取细胞培养上清液，通过elisa方法测定培养上清液中的炎性细胞因子(tnf-α、il-6、il-12)含量。结果表明，与未刺激的raw 264.7细胞相比，使用tmv刺激的raw 264.7细胞分泌更多的炎性细胞因子(附图4)。
54.实施例5
55.将一定量的烟草花叶病毒加入小鼠巨噬细胞系raw 264.7中，使其终浓度为100μg/ml，常规细胞培养条件下(37℃、5％co2、饱和湿度)共培养12小时。收集刺激后的巨噬细胞的全rna，通过qrt-pcr方法测定炎性基因的表达情况。结果表明，与未刺激的raw 264.7细胞相比，使用tmv刺激的raw 264.7细胞其cd86、inos、tnfα和il6基因的转录水平明显上调(附图5)。
56.为证明烟草花叶病毒是通过与巨噬细胞表面的tlr4相互作用导致巨噬细胞极化为m1型，在烟草花叶病毒与raw 264.7细胞共培养前，向raw 264.7细胞中加入tlr4抑制剂resatorvid(终浓度为100nm)预处理2小时。结果显示，resatorvid有效抑制了raw 264.7由烟草花叶病毒引起的cd86、inos、tnfα和il6基因的转录(附图5)。
57.实施例6
58.将一定量的烟草花叶病毒加入小鼠骨髓诱导的bmdm细胞中，使其终浓度分别为5、25和100μg/ml，常规细胞培养条件下(37℃、5％co2、饱和湿度)共培养24小时。该试验设计未刺激的小鼠骨髓诱导的bmdm细胞作为阴性对照，细菌脂多糖(lps)和ifn-γ刺激的bmdm作为阳性对照，其他所有实验步骤一致。培养结束后，将细胞吹下并收集，使用荧光标记的抗cd86抗体标记细胞。最后使用流式细胞术检测cd86
+
的bmdm比例。结果表明，与未刺激的bmdm细胞相比，随着烟草花叶病毒浓度的升高，bmdm细胞中cd86阳性细胞的百分数逐渐升高(附图6)。
59.实施例7
60.将一定量的烟草花叶病毒加入小鼠骨髓诱导的bmdm细胞中，使其终浓度为100μg/ml，常规细胞培养条件下(37℃、5％co2、饱和湿度)共培养24小时。对刺激后的巨噬细胞进行免疫荧光染色标记cd86蛋白，使用激光共聚焦显微镜观察其表面cd86蛋白表达情况(附图7)。结果表明，与未刺激的bmdm细胞相比，使用tmv刺激的bmdm细胞表面表达更多的m1型巨噬细胞标志物cd86蛋白。
61.实施例8
62.将一定量的烟草花叶病毒加入小鼠骨髓诱导的bmdm细胞中，使其终浓度为100μg/ml，常规细胞培养条件下(37℃、5％co2、饱和湿度)共培养24小时。收取细胞培养上清液，通过elisa方法测定培养上清液中的炎性细胞因子(tnf-α、il-6、il-12)含量。结果表明，与未刺激的bmdm细胞相比，使用tmv刺激的bmdm细胞分泌更多的炎性细胞因子(附图8)。
63.实施例9
64.将一定量的烟草花叶病毒加入小鼠骨髓诱导的bmdm细胞中，使其终浓度为100μg/ml，常规细胞培养条件下(37℃、5％co2、饱和湿度)共培养12小时。收集刺激后的巨噬细胞的全rna，通过qrt-pcr方法测定炎性基因的表达情况。结果表明，与未刺激的bmdm细胞相比，使用tmv刺激的bmdm细胞其cd86、inos、tnfα和il6基因的转录水平明显上调(附图9)。
65.为证明烟草花叶病毒是通过与巨噬细胞表面的tlr4相互作用导致巨噬细胞极化为m1型，在烟草花叶病毒与bmdm细胞共培养前，向bmdm细胞中加入tlr4抑制剂resatorvid(终浓度为100nm)预处理2小时。结果显示，resatorvid有效抑制了bmdm由烟草花叶病毒引起的cd86、inos、tnfα和il6基因的转录(附图9)。
66.显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。