一种重组长效人透明质酸酶及其生产方法和应用与流程

1.本发明涉及透明质酸酶制备技术领域，具体而言，涉及一种重组长效人透明质酸酶及其生产方法和应用。


背景技术：

2.透明质酸(ha)又名玻尿酸，是由n-乙酰氨基葡萄糖与d-葡萄糖醛酸为双糖单位聚合而成的糖胺聚糖，其双糖单位中的n-乙酰氨基葡萄糖与d-葡萄糖醛酸以β-1，3糖苷键相连，双糖单位之间则以β-1，4糖苷键进行聚合。由于双糖单位聚合度的差异，导致透明质酸的分子量分布较为宽泛，天然的ha主要以高分子透明质酸(hmwha，mr2
×
106da)方式存在。分子量是决定ha生物学功能的重要参数。细胞外基质的主要成分是hmw ha，其高粘弹性是细胞外基质得以抵抗外界压缩力的根源，依赖于高粘弹性，hmw ha也用于眼科手术。低分子量透明质酸(lmw ha，1
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105damr2
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106da)具有良好的保湿性和润滑性，广泛用于化妆品；研究发现，超低分子量透明质酸(vlmw ha，mr1
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105da)具有促血管生成作用、促创伤愈合作用、免疫调节活性和抗肿瘤活性，在机体愈合、免疫增强和肿瘤治疗等领域有重要的潜在应用价值。
3.人源性透明质酸酶主要有三种:haase 1、haase 2和ph20,其中 ph20是降解人体内ha的主要酶类。透明质酸酶可以降解人工生产的重组大分子量透明质酸，产生出小分子量透明质酸。目前，市售的透明质酸酶大多为国外企业垄断，且种类较少。
4.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种重组长效人透明质酸酶及其生产方法和应用以解决上述技术问题。
6.本发明是这样实现的：
7.本发明提供了一种重组长效人透明质酸酶，重组长效人透明质酸酶为人免疫球蛋白igg1fc片段和人透明质酸酶ph20细胞外部分的融合蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
8.本发明提供的重组长效人透明质酸酶具有安全性高、半衰期长、体内活性高的优势，属于人源蛋白质，体内使用更安全。
9.本发明还提供了一种重组长效人透明质酸酶的编码基因，其具有如seq id no.2所示的序列。
10.本发明还提供了一种表达载体，其包括上述重组长效人透明质酸酶的编码基因。
11.本发明还提供了一种宿主细胞，其包括上述的重组长效人透明质酸酶的编码基因。在一种可选的实施方式中，上述宿主细胞选自cho 细胞。
12.本发明还提供了一种生产重组长效人透明质酸酶的方法，方法包括：使用动物细胞表达载体pmh2或pmh7在中国地仓鼠细胞cho 内表达基因序列seq id no.2以获得的
ph20-igfc融合蛋白，然后进行分离纯化即得；表达载体pmh2和pmh7的基因序列参照 http://www.biovector.net/提供的载体序列，可市售购买或合成获得。
13.在本发明应用较佳的实施方式中，上述ph20-igfc使用proteing亲和纯化方法进行分离纯化。
14.本发明还提供了一种重组长效人透明质酸酶制剂，其包括上述重组长效人透明质酸酶或由上述方法制备的重组长效人透明质酸酶，制剂包括200-1200iu的重组长效人透明质酸酶，10-15mm na2hpo4， 0.01-0.03％cacl2，0.1-0.2％edta-na2，145-150mm nacl，0.1-0.2％ hsa，0.1-0.15％甘露醇，且ph值为5-6。
15.例如：200、500、700、800、900、1000、1200iu的重组长效人透明质酸酶。
16.本发明还提供了一种复方制剂，包括重组长效人透明质酸酶制剂和药物。
17.上述复方制剂的剂型选自片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂、喷雾和针剂。
18.在一种可选的实施方式中，上述复方制剂还包括药学上可接受的盐或赋形剂。
19.在一种可选的实施方式中，上述药物为实体瘤治疗药物。实体瘤包括不限于头颈部肿瘤(例如喉癌)、胸部肿瘤(例如乳腺癌、肺癌)、消化系统肿瘤(例如胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌)、泌尿生殖系统肿瘤(例如卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌)、骨肿瘤、中枢神经系统肿瘤、软组织肿瘤、皮肤及附件肿瘤等。
20.本发明还提供了一种重组长效人透明质酸酶或由上述方法制备的重组长效人透明质酸酶在制备配合使用药物的用途，人透明质酸酶制备的配合使用药物用于在其活性不被降解的情况下传递到人免疫球蛋白结合的组织或器官；或用于将特定治疗药物传递到疾病所在的组织或器官。
21.上述配合使用药物的用途包括不限于：化疗，放射疗法，光敏剂，光热剂或免疫疗法。
22.本发明还提供了重组长效人透明质酸酶或上述方法制备的重组长效人透明质酸酶在制备化学偶联剂的用途，人透明质酸酶制备的化学偶联剂用于通过重组长效透明质酸酶的igfc提供非功能位点来化学偶联诊断剂、显影剂、药物、治疗用毒素、基因进入疾病组织器官。
23.在一种可选的实施方式中，将上述方法制备的重组长效人透明质酸酶用于皮下输液、眼周手术麻醉、化药和生物药促渗、尿路造影术中造影剂的吸收。
24.本发明具有以下有益效果：
25.本发明提供的重组长效人透明质酸酶具有安全性高、半衰期长、体内活性高的优势，两段多肽属于人源蛋白质，具有较低的免疫原性，体内使用更安全。本发明构建了表达ph20－igfc融合蛋白的真核表达载体，并且获得了稳定表达ph20－igfc融合蛋白的基因工程 cho细胞系。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这
些附图获得其他相关的附图。
27.图1为本发明提供的融合蛋白ph20－igfc 37℃稳定性试验结果示意图。
具体实施方式
28.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
29.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
30.实施例1
31.本实施例提供了融合蛋白ph20－igfc的基因表达载体的构建方法及融合蛋白的表达、免疫学检测、人透明质酸酶活性检测和反应器生产。
32.基因表达载体的构建方法包括：
33.通过pcr的方法将结构基因ph20－igfc(seq id no.2)分别构建到表达载体pmh2和pmh7中，二者均为基于gc-rich机制超高能力哺乳动物细胞表达载体质粒，由试剂公司合成获得。并进行小量制备这两种表达质粒。
34.将上述制备的两种表达质粒稳定转染到无血清悬浮培养的cho 细胞中。通过g418筛选，用枪头手动挑取稳定克隆到96孔板中。当细胞汇合度大于55％时，更换无血清新鲜培养基；3-6小时后，收集培养基样品，通过抗igg1 fc抗体点杂交或elisa方法检测表达量，选出表达量最高的多个单克隆，继续在尖底小摇瓶内进行无血清培养和做传代稳定性研究；选出传代稳定的克隆在激流式反应器内进行扩增。
35.结果显示：(1)融合蛋白ph20－igfc在cho细胞中成功表达，点杂交和western blot结果表明筛选到融合蛋白ph20－igfc稳定高表达克隆所产生的条带分子量大小正确；(2)高表达克隆在尖底小摇瓶内进行无血清培养和做传代稳定；(3)稳定的高表达克隆在激流式反应器内进行流加培养扩增，各批次丰收液中透明质酸酶活性达到 200－1200活性单位/毫升，达到了工业化生产水平。
36.实施例2
37.本实施例提供了融合蛋白ph20－igfc的分离纯化方法。具体采用protein g亲和纯化。
38.收获上述ph20－igfc高表达的克隆，采用6000rpm离心8min，取离心上清液进行过滤。上样至已用平衡液a液 (20mm tris+100mm nacl，ph 7.4)平衡好的native protein g (alkaline phosphatase)(ab7461)，淋洗至基线不变后，采用洗脱液b 液(100mm gly+50mm arg+0.01％tween 80，ph 3.5)进行洗脱。通过sds－page检测产物的分离纯化情况。
39.融合蛋白ph20－igfc的纯度在95％以上，收率大于30％。
40.实施例3
41.本实施例提供了一种融合蛋白ph20－igfc的重组长效人透明质酸酶制剂和体内外活性研究。
42.重组长效人透明质酸酶制剂为针剂，其配方如下：
43.ph20-igfc+12mm na2hpo4+0.01％cacl2+0.1％edta－ na2+150mm nacl+0.2％has
+0.1％甘露醇，ph 5-6。
44.将600u/ml ph20－igfc过滤后的溶液分装至2ml安培瓶中，将 25瓶溶液置于37℃，湿度为75
±
5％的加速试验培养箱中。分别在第0、7、14、21、28、35、42天取样按照2010版药典附录玻璃酸酶活性检测，稳定性试验结果(表1、图1)显示，从第42天开始，透明质酸酶的活性出现显著性下降(约12％)。
45.表1ph20－igfc 37℃稳定性试验结果
46.时间(天)重复1重复2重复3平均值(u/ml)偏差cv0582609573588.0018.730.037610576615600.3321.220.0414593559585579.0017.780.0321576542622580.0040.150.0728554548579560.3316.440.0335548541570553.0015.130.0342543521536533.3311.240.02
47.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。