1.本发明涉及猪圆环病毒和细小病毒检测
技术领域：
：，更具体地说是涉及同时检测猪圆环病毒2型和猪细小病毒2型的pcr引物和方法。
背景技术：
：：2.猪圆环病毒(porcinecircovirus,pcv)是一类单股环状、无囊膜的dna病毒，其基因组大小约1.7～2.0kb，包含两个主要的开放阅读框(orf)，涉及编码病毒的复制酶蛋白rep及衣壳蛋白(capsidprotein,cap)。pcv1首次被发现于1974年，当时被认为是细胞培养的污染物，无致病性。而pcv2被认为是引起猪圆环病毒病(pcvd)和猪圆环相关疾病(pcvad)的主要病原体，主要包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(pmws)、猪皮炎与肾病综合征(pdns)、猪繁殖障碍及猪呼吸道疾病综合征(prdc)，严重威胁猪群健康。3.猪细小病毒(porcineparvovirus，ppv)是一类单股线性dna病毒，无囊膜，基因组大小约4～6kb，其同样包含两个主要的orf，orf1编码病毒的非结构蛋白(nsp)，orf2编码病毒的cap蛋白。1965年，ppv1首次分离于德国，被认为是引起世界范围内猪繁殖障碍的主要原因之一，感染后可造成猪的smedi(stillbirth,mummification,embryonicdeathandinfertility,smedi),即母猪产死胎、木乃伊胎、胚胎发育不良和死亡及母猪不孕等。而ppv2～7是通过宏基因组测序发现的新型ppv。目前已有的研究均表明ppv2是prdc潜在的致病因子。4.prdc是由多种因素共同引起的呼吸道疾病，主要见于1至3个月大的猪。而pcv2是其最为常见的致病原之一，通常与多种致病原混合感染共同引起prdc，其中便包括ppv2。5.目前有针对pcv2及ppv2单一的pcr诊断方法。多重pcr检测方法能够在一个反应体系中一次性对两种或多种病原进行pcr扩增，从而达到节约检测时间及检测成本的目的。但目前并无可以同时对pcv2和ppv2两种病毒进行检测的双重pcr检测方法。因此，迫切需要发展快速，准确的猪圆环病毒2型与猪细小病毒2型双重pcr检测方法，为两者在临床上的混合感染提供快速检测的技术手段。6.因此，如何提供一种同时检测猪圆环病毒2型和猪细小病毒2型的pcr引物和检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。技术实现要素：7.有鉴于此，本发明提供了一种可以对猪圆环病毒2型和猪细小病毒2型同时进行检测的引物和方法，为两者在临床上的混合感染提供快速检测的技术手段8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：9.一种同时检测猪圆环病毒2型和猪细小病毒2型的pcr引物，其特征在于，包括下述seqno.1～seqidno.4所示的序列：10.pcv2f：5’‑gctaattttgcagacccggaa-3’，如seqidno.1所示；11.pcv2r：5’‑ccactcccgttacttcacacc-3’，如seqidno.2所示；12.ppv2f：5’‑agccctaagactgactacaagc-3’，如seqidno.3所示；13.ppv2r：5’‑tcatgcacgtttgtctcgttg-3’，如seqidno.4所示。14.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护上述同时检测猪圆环病毒2型和猪细小病毒2型的pcr引物在制备检测猪圆环病毒2型和猪细小病毒2型试剂盒中的应用。15.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种同时检测猪圆环病毒2型和猪细小病毒2型的试剂盒，包括：seqidno.1～seqidno.4所述的引物；其中，seqidno.1～seqidno.2引物各0.5μl，seqidno.3～seqidno.4引物各1μl。16.作为上述技术方案优选的技术方案，所述试剂盒还包括：[0017]2×taqmastermixꢀꢀꢀꢀ10μl[0018]模板dnaꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ2μl[0019]ddh2oꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ补充至20μl。[0020]作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种同时检测猪圆环病毒2型和猪细小病毒2型的方法，对待检测样本以上述所述试剂盒进行扩增，猪圆环病毒2型的扩增产物的大小为666bp，猪细小病毒2型的扩增产物的大小为254bp，根据产物大小不同进行区分。[0021]作为上述技术方案优选的技术方案，扩增的反应程序为：[0022][0023]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种同时检测猪圆环病毒2型和猪细小病毒2型的pcr引物、方法和应用，其中，seqidno.1～seqidno.2所示的引物序列为检测猪圆环病毒2型的引物，检测灵敏度可达到100copies/μl，seqidno.3～seqidno.4所示的引物序列为猪细小病毒2型的检测引物，检测灵敏度可达到10copies/μl，对于单个样本的检测时间为1.5h，可同时进行大批量的样本检测，具有良好的特异性、敏感性和稳定性，可以实现对猪圆环病毒2型和猪细小病毒2型快速检测。附图说明[0024]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。[0025]图1附图为猪圆环病毒2型和猪细小病毒2型阳性病料单项pcr和双重pcr扩增结果，其中m:dna分子质量标准；1：猪圆环病毒2型阳性病料扩增结果；2：猪细小病毒2型阳性病料扩增结果；3：猪圆环病毒2型和猪细小病毒2型双阳性病料扩增结果；4：阴性对照；[0026]图2附图为双重pcr检测方法的敏感性试验，其中m:dna分子质量标准；1：1.0×1010copies/μl的混合标准品；2：1.0×109copies/μl的混合标准品；3：1.0×108copies/μl的混合标准品；4：1.0×107copies/μl的混合标准品；5：1.0×106copies/μl的混合标准品；6：1.0×105copies/μl的混合标准品；7：1.0×104copies/μl的混合标准品；8：1.0×103copies/μl的混合标准品；9：1.0×102copies/μl的混合标准品；10：1.0×101copies/μl的混合标准品；11：1.0×100copies/μl的混合标准品；12：1.0×10-1copies/μl的混合标准品；13：阴性对照；[0027]图3附图为双重pcr检测方法的特异性试验，其中m:dna分子质量标准；1：prv阳性核酸；2：tgev、pedv、prov的三阳性核酸；3：csfv阳性核酸；4：prrsv阳性核酸；5：jev阳性核酸；6：ppv1阳性核酸；7：ppv4阳性核酸；8：ppv6阳性核酸；9：ppv7阳性核酸；10：pcv3阳性核酸；11：pcv3阳性核酸；12：以1.0×105copies/μl的混合标准品为阳性对照；13：阴性对照；[0028]图4附图为双重pcr检测方法的引物浓度优化试验，其中m:dna分子质量标准；1～5：pcv2f/r均为0.1μmol/l，ppv2f/r分别为0.1、0.25、0.5、0.75、1.0μmol/l；6～10：pcv2f/r均为0.25μmol/l，ppv2f/r分别为0.1、0.25、0.5、0.75、1.0μmol/l；11～15：pcv2f/r均为0.5μmol/l，ppv2f/r分别为0.1、0.25、0.5、0.75、1.0μmol/l；16～20：pcv2f/r均为0.75μmol/l，ppv2f/r分别为0.1、0.25、0.5、0.75、1.0μmol/l；21～25：pcv2f/r均为1.0μmol/l，ppv2f/r分别为0.1、0.25、0.5、0.75、1.0μmol/l；26：阴性对照；[0029]图5附图为不同的退火温度下扩增结果图；其中，1～12:退火温度52℃～63℃；13：阴性对照；[0030]图6附图为不同的退火时间下的扩增结果图；其中，1～6：退火时间20s、25s、30s、35s、40s、45s；7：阴性对照；[0031]图7附图为不同的循环数下的扩增结果图，其中，1～4：循环数28、30、32、35；5：阴性对照。具体实施方式[0032]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0033]本发明实施例公开了一种可以对猪圆环病毒2型和猪细小病毒2型同时进行检测的引物和检测方法。[0034]病毒株及临床样品来源[0035]用于本实验标准阳性质粒构建的pcv2、ppv2阳性病料及特异性验证的pcv3、ppv4、ppv6、ppv7阳性病料均由龙岩学院动物医学研究所预先置于-80℃保存；伪狂犬病毒(pseμdorabiesvirμs，prv)活疫苗、猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirμs,tgev)弱毒华毒株、猪流行型腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirμs，pedv)cv777株及猪轮状病毒(porcinerotavirμs，prov)nx株均购自吉林正业生物制品股份有限公司；乙型脑炎病毒(japaneseencephalitisvirμs,jev)灭活疫苗及猪细小病毒(porcineparvovirμs，ppv)1型灭活疫苗均购自山东绿都生物制品有限公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereprodμctiveandrespiratorysyndromevirμs，prrsv)ch-1r株购自哈尔滨维科生物技术有限公司；猪瘟病毒(classicalswinefevervirμs，csfv)兔化弱毒株购自广东永顺生物制药股份有限公司。[0036]主要试剂与仪器[0037]柱法病毒总核酸(dna/rna)提取试剂盒(货号d3191-02c)购自广州美基生物科技有限公司；2×taqmastermix、产物纯化试剂盒(货号dc301-01)、质粒小量抽提试剂盒(货号dc201-01)、dh5α感受态细胞及反转录试剂(货号312-01/02)及pmd-19t载体均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；dl2000dnamarker购自宝生物工程(大连)有限公司；abiveriti96孔梯度pcr仪购自abi公司；nanodropnd-2000c微量分光光度计购自没过thermofisher生物公司。[0038]实施例1引物设计及合成[0039]利用mega7软件对genbank已公布的多个pcv2及ppv2全基因序列进行对齐，针对pcv2和ppv2基因组的保守序列分别设计1对特异性引物(p1/p2/p3/p4),引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物稀释至20μmol/l以备用。引物信息见表1。[0040]表1引物table1primerinformation[0041][0042]实施例2[0043]病毒核酸提取[0044]根据柱法病毒总核酸(dna/rna)提取试剂盒(货号d3191-02c)说明书提取pcv2/3、ppv2/4/6/7阳性病料及prv、tgev、pedv、prov、csfv、prrsv、jev、ppv1疫苗的基因组dna/rna，dna置于-20℃保存；将提取的tgev、pedv、prov，csfv、prrsv及jev基因组rna反转录为cdna，-20℃保存。[0045]目的片段的扩增及克隆测序[0046]以提取的pcv2及ppv2阳性病料基因组dna为模板，采用引物p1/p2、p3/p4分别对pcv2及ppv2进行单项pcr扩增。反应体系均为:2×taqmastermix10μl，引物对2μl，样品dna2μl，ddh2o6μl，总反应体系为20μl。反应程序均为：95℃预变性5min；循环反应包括95℃30s、58℃40s、72℃45s，共设置35个循环；72℃充分延伸10min。用2％琼脂糖凝胶电泳实验对pcr产物进行鉴定。根据产物纯化试剂盒(货号dc301-01)说明书回收阳性扩增产物，将阳性扩增产物连接至pmd-19t载体，构建重组质粒pmd-pcv2和pmd-ppv2。将重组质粒转化至dh5α感受态细胞，并将鉴定为阳性的菌株送至广东睿博兴科生物科技有限公司进行测序。[0047]标准品的制备[0048]测序结果正确的菌株经过夜培养后，根据质粒小量抽提试剂盒(货号dc201-01)说明提取重组质粒。使用nanodropnd-2000c微量分光光度计测量重组质粒浓度，并根据公式[拷贝数＝质粒浓度×10-9×6.02×1023/(660×重组质粒长度)]计算其拷贝数，10倍倍比稀释成终浓度为1.0×1010～1.0×10-1拷贝/μl，于-20℃保存备用。[0049]pcv2/ppv2双重pcr方法的优化[0050]将浓度为1.0×104的pcv2及ppv2标准品等体积混合后，作为双重pcr反应模板，采用方阵法对双重pcr反应的退火温度(52～63℃)和时间(20～45s)、引物浓度(0.1～1.0μmol/l)、循环数(25～35)及模板量(0.5～2μl)进行优化。[0051]采用方阵法对双重pcr反应的退火温度、退火时间、引物浓度、循环数及模板量进行优化，确定最终反应体系为20μl:2×taqmastermix10μl，pcv2f/pcv2r各0.5μl，ppv2f/ppv2r各1μl，模板dna2μl，ddh2o将体系补充至20μl。反应程序为：95℃预变性5min；循环反应包括95℃30s，61℃40s，72℃45s，共设置35个循环；72℃充分延伸10min。[0052]分别将引物浓度设置为0.1μmol/l、0.25μmol/l、0.5μmol/l、0.75μmol/l、1.0μmol/l，两个引物不同浓度两两交叉，结果显示pcv2f/r浓度各为0.5μmol/l，ppv2f/r浓度各为1.0μmol/l时灵敏度最优，结果见图4；[0053]分别将退火温度设置为52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃，结果显示，不同的退火温度下灵敏度不会发生太大变化，选择61℃，在不降低灵敏度的情况下，提高反应体系的特异性，见图5；[0054]分别将退火时间设置为20、25、30、35、40、45s，结果显示退火40s时扩增条带亮度最好，如图6所示；[0055]将循环数设定为28303235，结果显示35个循环时扩增条带亮度最高，如图7；[0056]将模板量设置为0.5、1、1.5、2μl，结果显示，不同模板量下灵敏度不会发生太大变化，选择2μl；[0057]建立20μl的反应体系，应用pcv2f/pcv2r和ppv2f/ppv2r两对引物分别对pcv2及ppv2阳性病料进行单项pcr扩增，并将pcv2及ppv2阳性病料dna以1:1混合进行双重pcr扩增，以ddh2o为阴性对照。琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，单项pcr扩增产物在约666bp和254bp出现特异性条带，双重pcr扩增产物在约666bp与254bp位置均出现特异性条带，与预期片段大小相符。将单项pcr扩增产物回收后链接至pmd-19t载体，挑取阳性菌落进行测序。测序结果显示，克隆的pcv2及ppv2目的片段大小分别为666bp及254bp。经ncbiblast比对显示，克隆的目的片段与pcv2及ppv2现有毒株序列同源性最高，均为100％，证明重组质粒构建正确，分别命名为pmd-pcv2和pmd-ppv2。[0058]双重pcr方法的敏感性试验[0059]测序正确的重组质粒经nanodropnd-2000c微量分光光度计测量浓度，计算出pmd-pcv2和pmd-ppv2的拷贝数分别为1.848×1010拷贝/μl和2.208×1010拷贝/μl。将重组质粒稀释至浓度为1.0×1010拷贝/μl，等体积混合后以10倍倍比稀释至浓度为1.0×1010～1.0×10-1拷贝/μl。以10倍倍比稀释后的混合质粒为模板，ddh2o为阴性对照，进行双重pcr扩增。结果如图2，,所建立的双重pcr方法对pmd-pcv2的检测极限为1.0×102拷贝/μl，对pmd-ppv2的检测极限为1.0×101拷贝/μl，表明该方法具有良好的敏感性。[0060]双重pcr方法的特异性试验[0061]应用已优化的pcv2/ppv2双重pcr方法，以prv、tgev、pedv、prov、csfv、prrsv、jev、ppv1/4/6/7和pcv3的核酸为模板，并设立阴阳性对照，对建立的双重pcr方法的特异性进行评价。结果显见图3，阳性对照分别扩增出大小为666bp和254bp的两个条带，而对其他病原核酸及阴性对照均无特异性扩增，表明该方法具有良好的特异性。[0062]临床样品的检测[0063]利用本研究建立的pcv2/ppv2双重pcr检测方法对实验室保存的来自福建地区86份疑似患prdc猪的肺脏组织进行检测，并根据文献：徐通,侯承尧,田润博,等猪圆环病毒2型和4型双重pcr检测方法的建立[j].中国兽医学报,2021,41(08):1490-1494、李静,曾威,朱玲,等.猪细小病毒2型、3型、6型多重pcr检测方法的建立及初步应用[j].中国预防兽医学报,2020,42(01):29-32.报道的pcv2及ppv2pcr检测方法进行复检，比较二者检测结果，计算二者符合率。结果显示，86份临床样品中，所建立的双重pcr方法检出pcv2阳性样品26份，阳性率为30.2％，ppv2阳性样品51份，阳性率为59.3％，两者的共感染率为20.9％。该检测结果与普通单重pcr检测结果100％相符。[0064]本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。[0065]对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。当前第1页12当前第1页12