一种辣椒NaCl诱导启动子、重组载体及其应用

一种辣椒nacl诱导启动子、重组载体及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种辣椒nacl诱导启动子、重组载体及其应用。


背景技术：

2.植物在自然界中经常由于其固着生长而遭受各种生物或非生物胁迫的影响，例如干旱、盐渍、高温或虫害、病害等。这些外界胁迫限制了植物的生长，进一步导致农作物减产。为了应对这些不利的环境因素，植物进化出了一套防御机制来提高自身对外界胁迫的耐受性，这其中重要的一点就是基因的表达调控。
3.基因的表达调控涉及dna、rna等多个层面的调节。而启动子是一段参与起始和调控基因表达的dna序列，其本身是不被转录的，它能够通过本身所含有转录起始所需的保守序列与rna聚合酶特异结合来发挥功能。根据作用方式及功能可将启动子分为3类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子。本专利所涉及的诱导型启动子能够在某些特定的刺激下，该类型启动子可以大幅提高下游基因的转录水平，使目的基因的表达产物在一定时空积累，从而在分子或生理水平上产生对特定刺激的响应。基因工程育种中通常使用诱导型启动子改善植株的抗逆性，这一定程度上解决了转基因应用中食品安全性问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决现有技术中存在的受到盐诱导的启动子在异源植物中对下游基因的表达水平较低的问题，提供一种辣椒nacl诱导启动子、重组载体及其应用。
5.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种辣椒nacl诱导启动子，所述启动子的核苷酸序列如seq id n0.1所示。
6.优选地，扩增所述启动子的引物序列如seq id n0.2和seq id n0.3所示。
7.本发明同时提供了一种重组载体，所述重组载体包含上述辣椒nacl诱导启动子。
8.优选地，所述重组载体还包含报告基因gus，所述重组载体的核苷酸序列如seq id n0.4所示。
9.本发明还提供了上述辣椒nacl诱导启动子在耐盐植物培育上的应用。
10.本发明从辣椒carh20基因启动子区域克隆得到诱导启动子procarh20，通过对该启动子区的分析，其中含有多个可能参与响应生物及非生物胁迫的顺式作用元件。当对含有启动子procarh20和报告基因gus(procarh20::gus)的拟南芥转基因植株用150mm nacl(高盐条件下)处理时，发现启动子procarh20可以增强下游基因gus的表达，致使转基因植株染色加深，证明启动子procarh20明显受到盐的诱导。
11.本发明所具有的有益效果：本发明从辣椒carh20基因启动子区域克隆得到的诱导启动子procarh20，该启动子在高盐条件下能够显著增强下游基因的表达水平，且能够稳定的在异源植物中发挥作用，其实际应用对于基因工程育种具有重要价值。
附图说明
12.图1为实施例1中procarh20启动子片段电泳图；
13.图2为实施例1中procarh20启动子的序列分析；
14.图3为实施例4中procarh20::gus转基因拟南芥植株经nacl处理后的gus染色分析图。
具体实施方式
15.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
16.t-vector(takara)；含有报告基因gus的双元表达载体、农杆菌和野生型拟南芥(col-0)由西南大学植物分子实验室提供；leagene gus染色试剂盒购自leagene。
17.实施例1procarh20启动子克隆及序列分析
18.1.procarh20启动子克隆
19.从pepperhub(http://pepperhub.hzau.edu.cn/)数据库中下载辣椒carh20基因dna序列，选择atg上游约902bp长度作为carh20启动子区域，以序列seq id n0.2和seq id n0.3为引物，通过pcr扩增获得procarh20启动子片段，连入t-vector，通过测序获得正确的procarh20启动子片段，procarh20启动子的核苷酸序列如seq id n0.1所示；procarh20启动子片段电泳图如附图1所示，片段长度为902bp；本实施例中pcr扩增所用引物详见表1；procarh20启动子的pcr扩增体系详见表2：
20.表1 procarh20启动子扩增所用的引物序列
21.primernameprimer sequences(5`-3`)procarh20-fggtaccaacgagggatgcacatc(seq id no.2)procarh20-rgtcgacggcaaattcgtaggagg(seq id no.3)
22.表2 procarh20启动子的pcr扩增体系
[0023][0024][0025]
2.procarh20启动子序列分析
[0026]
利用place数据库(http://www.dna.affrc.go.jp/place/)进行启动子调控元件分析，结果见表3：
[0027]
表3 carh20启动子所含有的启动子必需元件及响应环境胁迫的元件汇总表
[0028][0029]
实施例2构建含有procarh20启动子和报告基因gus的重组载体
[0030]
在实施例1的基础上，将实施例1获得的procarh20启动子片段，通过双酶切的方法接入含有报告基因gus的双元表达载体中，酶切位点为kpnⅰ和salⅰ；获得含有procarh20启动子和报告基因gus的重组载体，即procarh20::gus表达载体，其核苷酸序列如seq id n0.4所示。
[0031]
实施例3构建转基因拟南芥植株
[0032]
在实施例2的基础上，将实施例2中构建成功的procarh20::gus表达载体转入农杆菌中，再通过花序浸染法转入野生型拟南芥(col-0)，收取t0代种子，以含有潮霉素的1/2ms培养基进行培养筛选，得到拥有潮霉素抗性的转基因拟南芥植株procarh20::gus。以序列seq id n0.2和seq id n0.3为引物对转基因拟南芥植株procarh20::gus进行pcr鉴定，可扩增出长度为902bp的基因片段，测序结果与procarh20的核苷酸序列一致；同时对转基因拟南芥植株procarh20::gus进行gus染色鉴定，可检测到gus的组织化学染色情况，说明检测到gus基因的表达，证明procarh20启动子序列是具有启动子功能的，并能在异源植物中有效启动外源基因的表达。
[0033]
实施例4 nacl诱导实验
[0034]
以实施例3中获得的procarh20::gus转基因拟南芥植株为nacl诱导实验对象，设置对照组标记为ck，实验组标记为150mm nacl 12h。实验组将转基因拟南芥幼苗用150mm nacl处理12h；而对照组的转基因拟南芥幼苗在液体1/2ms培养基中培养12h，再对实验组和对照组进行gus染色，结果如图3所示。附图3显示，相对于对照组ck的幼苗，经过nacl处理后
的幼苗染色后颜色加深，证明procarh20启动子在高盐条件下能够显著增强外源基因gus的表达，是一种积极响应nacl诱导表达的诱导型启动子。
[0035]
综上所述，本发明构建了含有诱导型启动子procarh20和外源基因(如gus报告基因)的表达载体，并且转入拟南芥，获得procarh20::gus转基因拟南芥植株。实施例3说明本发明构建的procarh20启动子能有效启动外源基因(gus报告基因)在拟南芥植株中的表达。实施例4的nacl诱导实验进一步说明本发明构建的procarh20启动子在高盐条件下能显著增强外源基因(gus报告基因)的表达，是一种响应外源nacl诱导表达的诱导型启动子，其在基因工程植物育种中有着非常重要的应用价值。
[0036]
本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。