从无偿献血全血采集装置中分离单个核细胞的方法与流程

1.本发明涉及一种从无偿献血全血采集装置中分离外周血单个核细胞的方法，具体是一种大量的、规模的取得人外周血单个核细胞的实验室内无菌操作技术，用于后续细胞治疗等用途，属于细胞治疗制品技术领域。


背景技术：

2.最近十年，细胞治疗作为医学发展的前沿发展迅猛，细胞治疗最重要的发展方向dc-cik(树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞)治疗机体内在癌变细胞转归，利用激活的免疫细胞来清除癌变的自体细胞，通过体内功能最强大的抗原递呈细胞外周血来源的树突状细胞(dc)与cik细胞共培养，获得dc细胞刺激的clk细胞，通过多次回输cik细胞回病人的体内杀伤残留的肿瘤细胞，抑制肿瘤的复发和转移，另外回输的cik细胞还能提高机体免疫功能。这种方法虽然采用被动性免疫治疗方案，但是对于肿瘤细胞的杀伤具有特异性，单克隆抗体单独或与其他试剂结合,激活的t淋巴细胞特异性的杀伤肿瘤细胞等。过继细胞免疫治疗是利用cik细胞，cik是由多种细胞因子和cd3-ab在体外诱导并大量扩增的具有杀伤肿瘤活性的细胞，是一种具有nk和t细胞类型的cd3+cd56+异质细胞，是目前主要的免疫细胞治疗手段，其主要特点有：
①
选择性杀伤肿瘤细胞，不会伤害正常细胞；
②
杀伤效果好，效率为nk和lak 50倍以上；
③
广谱抗肿瘤，对耐药肿瘤细胞也能高效杀伤。
3.想要获得足够量的dc-cik治疗细胞，可以从肿瘤患者自身采集，一般采集量较大，要达到100ml以上，在实践操作中一些肿瘤病人无法耐受外周血的采集，更大的原因是肿瘤终末期患者外周血单个核细胞活性比较差，在体外培养中根本无法扩增达到治疗的数量级，为了彻底解决细胞来源问题，本发明采用无偿献血全血采集装置中分离滤白盘的外周血单个核细胞，然后经过体外的培养，达到细胞治疗需要的数量级。
4.目前的临床输血分为成分和全血输血，其中全血输血适用于大量失血及血液置换的患者，一个无偿献血全血采集装置由采集袋、滤白器、转移袋i、转移袋ii及抗凝剂储存袋组成，无偿献血者的全血首先采集到采集袋中，然后经过滤白器将滤除单个核细胞的全血转移到转移袋i中，再通过离心和全自动化的设备将转移袋i中的绝大部分血浆转至转移袋ii中，然后再把抗凝剂储存袋中的抗凝剂按照比例加至转移袋i中，形成去白细胞悬浮红细胞发至临床使用，如图1所示。申请人回收四十余个献血者滤白器，经过反复实验，建立了一整套提取滤白器中的单个核细胞、并可成功扩增至细胞治疗需要的数量级的方法。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，而提供一种从无偿献血全血采集装置中分离外周血单个核细胞的方法，本发明提供滤白器的回收、消毒及单个核细胞提取方法，能够从无偿献血采血管道的滤白器中无菌提取单个核细胞及体外培养，并把体外培养的细胞作为dc-cik治疗细胞。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种从无偿献血全血采集装置中分离外周血单个核细胞的方法，包括以下步骤：
8.(1)分离滤白器：
9.将无偿献血全血采集装置放于生物安全柜中，向滤白器表面及两侧管壁喷酒精进行表面消毒；使用管夹夹住两侧管壁，利用无菌剪刀剪开两侧管壁的上下端管口，两侧管壁均预留出一截长管；
10.(2)正反向冲洗提取滤白器：
11.正向悬起滤白器，利用注射器将冲洗液通过长管正向冲洗滤白器，避免气泡产生，用干净的容器接住下端流出的废液，避免污染，冲洗结束后将废液弃掉，正向冲洗是全血过滤白细胞方向，不会冲掉白细胞(单个核细胞)；反向悬起滤白器，利用注射器将冲洗液通过长管反向冲洗滤白器，用两个离心管收集细胞液；
12.(3)分离单个核细胞：
13.将步骤(2)中两个离心管中的细胞液进行离心，离心后吸弃上清，用生理盐水重悬细胞后得到细胞悬液；向另外两个离心管中分别加入等量的ficoll，将两管细胞悬液分别滴加至ficoll中，继续离心；离心结束后吸弃上清，吸取ficoll上方的白膜层至新的离心管中；
14.(4)记数：
15.向步骤(3)中装有白膜层的离心管中补加生理盐水，离心后吸弃上清，生理盐水重悬后采用血球计数板手动计数，每个白盘可以获取1
×
108～1.5
×
108个细胞，经过后期的细胞体外培养和染色，发现活细胞比率在90％以上；在后续的实验中已经得到验证，滤白盘分离的单个核细胞与新鲜血中分离的单个核细胞具有相同的细胞活力，可满足实验要求。
16.上述技术方案中，步骤(1)中，所述的酒精为75％酒精。
17.上述技术方案中，步骤(1)中，所述的长管，长度至少为15cm。
18.上述技术方案中，步骤(2)中，所述的正向悬起滤白盘，指的是与采集袋相通的侧管剪断后预留出的长管位于上方，冲洗液从此长管通过向下冲洗为正向冲洗。
19.上述技术方案中，步骤(2)中，所述的注射器为50ml注射器，分两次用100ml冲洗液正向冲洗滤白盘。
20.上述技术方案中，步骤(2)中，所述的反向悬起滤白盘，指的是与转移袋i相通的侧管剪断后预留出的长管位于上方，冲洗液从此长管通过向下冲洗为反向冲洗。
21.上述技术方案中，步骤(2)中，所述的注射器为50ml注射器，分两次用100ml冲洗液反向冲洗滤白盘，用2个50ml离心管收集细胞悬液。
22.上述技术方案中，步骤(2)中，冲洗液为dmem-lg培养液和胎牛血清的混合液，dmem-lg培养液和胎牛血清的体积比为4:1。
23.上述技术方案中，步骤(3)中，两个离心管中的细胞液按重量配平后再进行离心，若两管细胞量差异较大可将两管细胞混合后均分。
24.上述技术方案中，步骤(3)中，使用水平转子低温离心机进行离心，两个离心管中的细胞液进行离心时，控制温度18℃-20℃，400g，离心10min，离心结束后吸弃上清，使用15ml生理盐水重悬细胞得到细胞悬液。
25.上述技术方案中，步骤(3)中，另外两个离心管中分别加入15ml ficoll，使用水平转子低温离心机进行离心，格控制温度18℃-20℃，800g，离心25min。
26.上述技术方案中，步骤(3)中，离心结束后小心地将离心管从离心机中取出，离心管中液体分层，避免猛烈震动破坏分层，用吸管吸弃10ml上清液，小心吸取ficoll上方的白膜层至新的50ml离心管中，尽可能减少ficoll转移。
27.上述技术方案中，步骤(4)中，向步骤(3)中装有白膜层的离心管中补加生理盐水至40ml，吸管轻轻混匀，室温650g，离心10min，离心结束后弃上清，用40ml生理盐水重悬，血球计数板手动计数。
28.与现有技术相比，具有以下特点：
29.1.细胞来源充足，以青岛市中心血站为例，2022年共采集全血约13万人次，就有13万个滤白器提供单个核细胞，可以大大促进该技术的发展。
30.2.废物利用，无偿献血滤白盘在血液制备流程后被当做医疗废物处置，如果当作细胞治疗的来源，既可以避免浪费又可以当细胞治疗的种子细胞。3.滤白器中单个核细胞富集程度高，相比现有的抽取细胞提供者50ml外周血得到的单个核细胞，前者是后者的5-8倍。
附图说明
31.图1为无偿献血全血采集装置(其中，1为采集袋，2为滤白器，3为转移袋i，4为转移袋ii，5为抗凝剂储存袋)；
32.图2-1为正向冲洗提取滤白器单个核细胞的示意图，其中6为管夹，7为无菌剪刀，向下的箭头代表正向冲洗；
33.图2-2为反向冲洗提取滤白器单个核细胞的示意图，其中6为管夹，7为无菌剪刀，向上的箭头代表反向冲洗；
34.图3-1为加入ficoll未离心时的示意图，a代表细胞悬浮液层，b代表ficoll层；
35.图3-2为加入ficoll离心后的示意图，b代表ficoll层，c代表生理盐水层，d代表白膜层，e代表细胞层；
36.图4为实施例1中经过后期的细胞体外培养和染色的示意图。
具体实施方式
37.以下对本发明技术方案的具体实施方式详细描述，但本发明并不限于以下描述内容：
38.无偿献血全血采集装置由采集袋、滤白器、转移袋i、转移袋ii及抗凝剂储存袋组成，如图1所示：无偿献血者的全血首先采集到采集袋中，然后经过滤白器将滤除单个核细胞的全血转移到转移袋i中，再通过离心和全自动化的设备将转移袋i中的绝大部分血浆转至转移袋ii中，然后再把抗凝剂储存袋中的抗凝剂按照比例加至转移袋i中，形成去白细胞悬浮红细胞发至临床使用。申请人回收四十余个献血者滤白器，经过反复实验，建立了一整套提取滤白器中的单个核细胞、并可成功扩增至细胞治疗需要的数量级的方法，下面结合具体的实施例对本发明方法进行阐述：
39.实施例1：
40.一种从无偿献血全血采集装置中分离外周血单个核细胞的方法，包括以下步骤：
41.(1)分离滤白器：
42.将无偿献血全血采集装置放于生物安全柜中，向滤白器表面及两侧管壁喷75％酒精进行表面消毒；使用管夹6夹住两侧管壁，利用无菌剪刀7剪开两侧管壁的上下端管口，两侧管壁均预留出一截长管，长度至少为15cm。
43.(2)正反向冲洗提取滤白器：
44.将与采集袋相通的侧管剪断后预留出的长管位于上方，如图2-1所示，箭头方向朝下正向悬起滤白器，使用50ml注射器，分两次用100ml冲洗液正向冲洗滤白盘，避免气泡产生，用干净的容器接住下端流出的废液，避免污染，冲洗结束后将废液弃掉，正向冲洗是全血过滤白细胞方向，不会冲掉白细胞(单个核细胞)；
45.将与转移袋i相通的侧管剪断后预留出的长管位于上方，如图2-2所示，箭头方向朝上反向悬起滤白器，使用50ml注射器，分两次用100ml冲洗液反向冲洗滤白盘，用2个50ml离心管收集细胞悬液。
46.本步骤中，冲洗液为dmem-lg培养液和胎牛血清的混合液，dmem-lg培养液和胎牛血清的体积比为4:1。
47.(3)分离单个核细胞：
48.将步骤(2)中两个离心管中的细胞液按重量配平后再进行离心，若两管细胞量差异较大可将两管细胞混合后均分；使用水平转子低温离心机进行离心，控制温度18℃-20℃，400g，离心10min，离心结束后吸弃上清，使用15ml生理盐水重悬细胞得到细胞悬液；
49.向另外两个离心管中分别加入15ml ficoll，将两管细胞悬液分别滴加至ficoll中，如图3-1所示；使用水平转子低温离心机进行离心，格控制温度18℃-20℃，800g，离心25min；离心结束后小心地将离心管从离心机中取出，离心管中液体分层如图3-2所示，避免猛烈震动破坏分层，用吸管吸弃10ml上清液，小心吸取ficoll上方的白膜层至新的50ml离心管中，尽可能减少ficoll转移。
50.(4)记数：
51.向步骤(3)中装有白膜层的离心管中补加生理盐水至40ml，吸管轻轻混匀，室温650g，离心10min，离心结束后弃上清，用40ml生理盐水重悬，血球计数板手动计数；每个白盘可以获取1
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108～1.5
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108个细胞，经过后期的细胞体外培养和染色，如图4所示，发现活细胞比率在90％以上；在后续的实验中已经过验证，滤白盘分离的单个核细胞与新鲜血中分离的单个核细胞具有相同的细胞活力，可满足实验要求。
52.上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。