诃子中没食子酸酯新化合物及其制备方法和应用

1.本发明涉及中藏药提取分离、分离技术领域，尤其涉及一种诃子中没食子酸酯新化合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.藏药诃子为使君子科植物诃子(terminalia chebula retz.)的干燥成熟果实，别称为诃黎勒、诃黎、随风子，原产于印度、缅甸等国，在我国西藏、云南、广东、广西等地均有分布。诃子具有涩肠敛肺、降火利咽之功效，现代药理研究证实其具有抗氧化、神经保护、抗肿瘤、抗病毒、抗菌等多种药理作用，其所含有的主要化学成分包括鞣质类、酚酸类、三萜类、黄酮类等。在藏医药和蒙医药中，诃子最为常用，其使用频率几乎与汉医方剂中甘草相等，被视为“藏药之王”。诃子作用多样、临床应用广、药用价值高，但目前对其研究较少且比较零散，其药效成分尚不够明确。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种诃子中没食子酸酯新化合物及其制备方法和应用。本发明提供的诃子中没食子酸酯新化合物具有较好的蔗糖酶和麦芽糖酶抑制活性，可用于制备降血糖的药物和保健品。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了一种诃子中没食子酸酯新化合物，具有式i所示的结构：
[0006][0007]
本发明还提供了上述技术方案所述的诃子中没食子酸酯新化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0008]
将诃子干果粉碎后利用乙醇水溶液回流提取，经浓缩，得到诃子提取物；
[0009]
将所述诃子提取物经ab-8大孔树脂水洗后用乙醇洗脱，再浓缩，得到浓缩物；
[0010]
将所述浓缩物与硅胶拌样后，进行硅胶柱层析粗分，所述硅胶柱层析粗分使用氯仿/甲醇溶剂体系划段，分别得到fr.1、fr.2、fr.3、fr.4、fr.5和fr.6，所述氯仿/甲醇溶剂中氯仿与甲醇的体积比分别为9：1、8：2、7：3、6：4、1：1和0：1；
[0011]
将所述fr.6依次进行正相硅胶柱色谱梯度洗脱和反相硅胶柱色谱等度洗脱，得到所述诃子中没食子酸酯新化合物。
[0012]
优选地，所述乙醇水溶液的体积分数为75～95％。
[0013]
优选地，所述浓缩物与硅胶的质量比为1:1.5。
[0014]
优选地，所述硅胶柱层析粗分时使用10倍重量的100目硅胶。
[0015]
优选地，所述梯度洗脱的洗脱液为氯仿-甲醇混合液，所述氯仿-甲醇混合液中氯
仿与甲醇的体积比为20:1
→
0:1。
[0016]
优选地，所述梯度洗脱的洗脱液的质量为fr.6的500倍。
[0017]
优选地，所述等度洗脱的洗脱液为甲醇-水混合液，所述甲醇-水混合液中甲醇的体积百分含量为20％。
[0018]
本发明还提供了上述技术方案所述诃子中没食子酸酯新化合物在抑制蔗糖酶和麦芽糖酶活性中应用。
[0019]
本发明还提供了上述技术方案所述诃子中没食子酸酯新化合物在制备降血糖药物中应用。
[0020]
本发明提供了一种诃子中没食子酸酯新化合物，具有较好的蔗糖酶和麦芽糖酶抑制活性，可用于制备降血糖的药物和保健品。
[0021]
本发明还提供了上述技术方案所述诃子中没食子酸酯新化合物的制备方法，依次为提取、大孔树脂分离、硅胶正反向柱纯化，成功分离出诃子中没食子酸酯新化合物，该方法操作简单快速，且分离得到的化合物纯度较高，均大于90％。本发明的制备方法简单，能够实现诃子中没食子酸酯新化合物的快速和高纯度的提取分离。
附图说明
[0022]
图1为的诃子中没食子酸酯新化合物的dept135谱图；
[0023]
图2为诃子中没食子酸酯新化合物的dept90谱图；
[0024]
图3为诃子中没食子酸酯新化合物的hsqc谱图；
[0025]
图4为诃子中没食子酸酯新化合物的hmbc谱图；
[0026]
图5为诃子中没食子酸酯新化合物的蔗糖酶ic
50
值；
[0027]
图6为诃子中没食子酸酯新化合物的麦芽糖酶ic
50
值。
具体实施方式
[0028]
本发明提供了一种诃子中没食子酸酯新化合物，具有式i所示的结构：
[0029][0030]
本发明中所述诃子中没食子酸酯新化合物的分子式为c
13h10
o7，化学命名为没食子酸-5-羟甲基糠醛酯。
[0031]
本发明还提供了上述技术方案所述的诃子中没食子酸酯新化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0032]
将诃子干果粉碎后利用乙醇水溶液回流提取，经浓缩，得到诃子提取物；
[0033]
将所述诃子提取物经ab-8大孔树脂水洗后用乙醇洗脱，再浓缩，得到浓缩物；
[0034]
将所述浓缩物与硅胶拌样后，进行硅胶柱层析粗分，所述硅胶柱层析粗分使用氯仿/甲醇溶剂体系划段，分别得到fr.1、fr.2、fr.3、fr.4、fr.5和fr.6，所述氯仿/甲醇溶剂中氯仿与甲醇的体积比分别为9：1、8：2、7：3、6：4、1：1和0：1；
[0035]
将所述fr.6依次进行正相硅胶柱色谱梯度洗脱和反相硅胶柱色谱等度洗脱，得到
所述诃子中没食子酸酯新化合物。
[0036]
本发明将诃子干果粉碎后利用乙醇水溶液回流提取，经浓缩，得到诃子提取物。
[0037]
本发明对所述诃子干果粉碎的具体方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可。
[0038]
在本发明中，所述乙醇水溶液的体积分数优选为75～95％。本发明对所述乙醇水溶液的用量没有特殊的限定，能够实现完全提取即可。
[0039]
在本发明中，所述回流提取的次数优选为3次，每次的时间优选为2h。
[0040]
在本发明中，所述浓缩优选为减压浓缩，本发明对所述减压浓缩的时间和温度没有特殊的限定，能够实现完全除去乙醇和水即可。
[0041]
得到诃子提取物后，本发明将所述诃子提取物经ab-8大孔树脂水洗后用乙醇洗脱，再浓缩，得到浓缩物。
[0042]
本发明优选将所述诃子提取物与水溶解后，上ab-8大孔树脂柱，水洗脱除糖和蛋白。
[0043]
在本发明中，所述乙醇洗脱时乙醇优选为使用体积百分含量为95％的乙醇水溶液。
[0044]
在本发明中，所述浓缩优选为减压浓缩，本发明对所述减压浓缩的时间和温度没有特殊的限定，能够实现完全除去乙醇和水即可。
[0045]
得到浓缩物后，本发明将所述浓缩物与硅胶拌样后，进行硅胶柱层析粗分，所述硅胶柱层析粗分使用氯仿/甲醇溶剂体系划段，分别得到fr.1、fr.2、fr.3、fr.4、fr.5和fr.6，所述氯仿/甲醇溶剂中氯仿与甲醇的体积比分别为9：1、8：2、7：3、6：4、1：1和0：1。
[0046]
在本发明中，所述浓缩物与硅胶的质量比优选为1:1.5。在本发明中，所述硅胶的粒径优选为100目。
[0047]
在本发明中，所述拌样后优选还包括晾干。
[0048]
在本发明中，所述硅胶柱层析粗分时优选使用10倍重量的100目硅胶。
[0049]
本发明对所述氯仿/甲醇溶剂的用量没有特殊的限定，能够实现各部分完全分离即可。
[0050]
在本发明中，所述硅胶柱层析粗分的过程中优选进行薄层板监测，合并薄层板监测相同部分得到所述fr.1、fr.2、fr.3、fr.4、fr.5和fr.6。
[0051]
得到fr.6后，本发明将所述fr.6依次进行正相硅胶柱色谱梯度洗脱和反相硅胶柱色谱等度洗脱，得到所述诃子中没食子酸酯新化合物。
[0052]
在本发明中，所述梯度洗脱的洗脱液优选为氯仿-甲醇混合液，所述氯仿-甲醇混合液中氯仿与甲醇的体积比优选为20:1
→
0:1。
[0053]
在本发明中，所述氯仿-甲醇混合液优选按氯仿与甲醇的体积比分别为20：1、10：1、5：1、2：1和0：1梯度进行洗脱，每个梯度使用洗脱液质量为fr.6的100倍，每个梯度洗脱1小时。
[0054]
在本发明中，所述梯度洗脱的洗脱液的质量优选为fr.6的500倍。
[0055]
在本发明中，所述反相硅胶柱色谱优选为反相硅胶柱色谱rp-18。
[0056]
在本发明中，所述等度洗脱的洗脱液优选为甲醇-水混合液，所述甲醇-水混合液中甲醇的体积百分含量优选为20％。
[0057]
在本发明中，所述等度洗脱优选在常压流速下进行。
[0058]
在本发明中，所述等度洗脱的过程中优选进行薄层层析监测。
[0059]
所述等度洗脱完成后，优选浓缩所得洗脱液，得到所述诃子中没食子酸酯新化合物。本发明对所述浓缩的具体方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可。
[0060]
本发明还提供了上述技术方案所述诃子中没食子酸酯新化合物在抑制蔗糖酶和麦芽糖酶活性中应用。
[0061]
本发明还提供了上述技术方案所述诃子中没食子酸酯新化合物在制备降血糖药物中应用。
[0062]
在本发明中，所述降血糖药物优选包含有效剂量的所述诃子中没食子酸酯新化合物、其立体异构体、可药用盐和药学上可接受的载体、辅料、赋形剂和稀释剂。
[0063]
在本发明中，所述降血糖药物的剂型优选包括片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、缓释制剂、控释制剂或纳米制剂药学上可接受的剂型。
[0064]
为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明提供的诃子中没食子酸酯新化合物及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0065]
实施例1
[0066]
(1)将3kg自然阴干诃子果实粉碎后过筛，用体积百分数95％的乙醇溶液回流提取3次，每次2h，减压浓缩回收乙醇得到总提取物。
[0067]
(2)将步骤(1)得到的提取物用纯净水溶解后，上ab-8大孔树脂柱，水洗脱除糖和蛋白，然后用体积百分数的95％乙醇溶液洗脱，洗脱液经减压浓缩后得到浓缩物320g；
[0068]
(3)将步骤(2)得到的浓缩物使用1.5倍重量的100目硅胶拌样晾干后，用10倍重量的100目硅胶进行硅胶柱层析粗分，使用氯仿/甲醇溶剂体系(体积比9：1、8：2、7：3、6：4、1：1和0：1)划段，合并薄层板监测相同部分得到fr.1、fr.2、fr.3、fr.4、fr.5、fr.6共六个部分。fr.6经正相硅胶柱色谱以500倍重量氯仿-甲醇混合液(氯仿-甲醇混合液按氯仿与甲醇的体积比分别为20：1、10：1、5：1、2：1和0：1梯度进行洗脱，每个梯度使用洗脱液质量为fr.6的100倍，每个梯度洗脱1小时)梯度洗脱后，再经反相硅胶柱色谱(rp-18)，以甲醇-水(其中甲醇的体积百分数为20％)常压流速等度洗脱，薄层层析监测，浓缩洗脱液，得到新化合物11mg。
[0069]
对诃子中没食子酸酯新化合物进行结构分析：
[0070]
具体数据为：没食子酸-5-羟甲基糠醛酯，黄色固体。uv(meoh)λmax(logε)225(4.66),293(4.19)nm；ir(kbr)νmax 3415,1669,1384,1212,1050,1025,766cm-1；1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.48(1h,s,-cho),7.30(1h,d,j＝3.6hz,h-3),6.96(2h,s),6.65(1h,d,j＝3.6hz,h-4),5.22(2h,s,h-6)；
13
c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ:178.3,166.2,156.4,153.0,145.2,122.6,119.3,112.3,108.9,57.6；hresi-ms m/z 277.0350[m-h]-(calcd.for c
13h10
o7,277.0354).
[0071]
图1为的诃子中没食子酸酯新化合物的dept135谱图，图2为诃子中没食子酸酯新化合物的dept90谱图，图3为诃子中没食子酸酯新化合物的hsqc谱图，图4为诃子中没食子酸酯新化合物的hmbc谱图。
[0072]
由以上结构分析可知，本发明制得了具有式i所示结构的诃子中没食子酸酯新化合物。
[0073]
活性评价例
[0074]
取实施例分离得到的诃子中没食子酸酯新化合物进行蔗糖酶和麦芽糖酶抑制活性研究。
[0075]
具体实验方法
[0076]
(1)大鼠小肠蔗糖酶和麦芽糖酶提取及活力测定：大鼠禁食12小时的，脱颈椎处死，立即取出小肠置冰台上，剖开小肠并翻转暴露肠粘膜，用4℃预冷的pbs冲洗后拭干，用玻片刮取小肠粘膜，按质量体积比1：5加入4℃预冷的pbs，匀浆，4℃、8000r/min离心20min，取上清液分装，-20℃贮备备用。取上清酶液0.1ml加0.35ml pbs，37℃水浴10min，加入0.25mol/l蔗糖(麦芽糖)溶液50μl，20min后立即投入冰水浴中5min，继续加入na2co3溶液0.5ml终止反应。3孔平行测定，将37℃、ph6.8条件下，1l溶液中每分钟生成1μmol葡萄糖定义为1个酶活力单位。酶活力＝葡萄糖浓度
×2×
1000/20。
[0077]
(2)蔗糖酶抑制活性筛选：将50μl含有17.5u/ml的酶液和50μl、5mg/ml样品加入48孔板，在37℃下预孵育10min。然后加入50μl、0.5mol/l蔗糖溶液，将该混合物在37℃下孵育20min。立即投入冰水浴5min，降低酶活性，继续加入0.1mol/l的na2co3溶液50μl终止反应，重复在三次。采用葡萄糖试剂盒测定葡萄糖浓度，并计算样品对蔗糖酶的抑制活性。
[0078]
(3)麦芽糖酶抑制活性筛选：将50μl含有11.56u/ml的酶液和50μl、5mg/ml样品加入48孔板，在37℃下预孵育10min。然后，加入50μl、1.39mmol/ml麦芽糖溶液，将该混合物在37℃下孵育20min。立即投入冰水浴5min，降低酶活性，继续加入0.1mol/l的na2co3溶液50μl终止反应，重复在三次。采用葡萄糖试剂盒测定葡萄糖浓度，并计算样品对麦芽糖酶的抑制活性。
[0079]
蔗糖酶和麦芽糖酶抑制活性研究表明没食子酸酯结构新化合物具有蔗糖酶抑制活性ic
50
值为499.1μm，对麦芽糖酶半数抑制ic
50
值为482.7μm，分别见图5和图6。
[0080]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。