一种检测泌尿生殖道感染病原体核酸的DNA探针及其应用

一种检测泌尿生殖道感染病原体核酸的dna探针及其应用
技术领域
1.本发明涉及核酸检测技术领域，具体的是一种检测泌尿生殖道感染病原体核酸的dna探针及其应用。


背景技术：

2.沙眼衣原体(chlamydia trachomatis，ct)感染是目前诊断发病数最高的一种性传播疾病，据统计，该疾病全球每年约有1.3亿新发病例，其中青少年是受影响较大的群体。女性感染后会出现盆腔炎、尿道炎、宫外孕、输卵管阻塞、异位妊娠等症状，还会增加宫颈癌的发病风险。对于男性，则会出现尿道炎、附睾炎、结膜炎等症状。此外，沙眼衣原体感染还会引发反应性关节炎以及新生儿眼炎和肺炎。
3.目前临床上检测沙眼衣原体的方法主要有培养法、免疫法和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)法。培养法检测沙眼衣原体是传统的病原学检测方法，但由于检测耗时，并且易受标本取材多少，送检时间等因素影响导致假阴性。免疫法操作简单，耗时较短，但是特异性和敏感性却不够理想。pcr法灵敏度高，特异性强，但是需要专门的技术人员，对仪器也有特定的要求，在基层单位和偏远地区不能普及开来。
4.淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae，ng)是淋病的病原菌，淋病不及时诊断和治疗会引起严重的并发症，早期诊断和治疗是控制淋病传播的关键。实验室诊断技术在淋病的诊断和治疗中具有十分重要的作用。目前，常用的实验室诊断方法有涂片镜检、分离培养、免疫学方法、分子生物学检查和快速检查等。分泌物直接涂片染色镜检大多常用革兰染色，但是有其局限性，细菌培养是诊断淋病的金标准，也是目前诊断淋病最可靠的方法，但淋病奈瑟菌培养困难，仅做细菌学培养检查，诊断意义有限。
5.生殖支原体(mycoplasma genitalium，mg)是一种性传播感染病原体，可引起宫颈炎、盆腔炎、前列腺炎、附翠炎、直肠炎、尿道炎、关节炎、输卵管不孕等症状或并发症。据文献汇报，在男性有症状非淋菌性尿道炎患者中，生殖支原体阳性率为15％～25％，我国南京性病门诊有尿道炎症状男性患者中生殖支原体阳性率19.7％，在非衣原体性非淋球菌性尿道炎中生殖支原体阳性率达41.4％。
6.生殖支原体的临床表现缺乏特异性，其诊断依赖于实验室的病原学诊断。生殖支原体缺乏细胞壁，革兰染色镜检不可见。并且体外培养极其困难且耗时长达数月，使得分离培养不能在临床上常规开展。生殖支原体的基因组与肺炎支原体十分相似，由于有交叉反应性，所以血清学试验的特异性较差，且缺乏标准诊断试剂，血清学试验仅在评价生殖支原体与盆腔炎和不孕症的相关性研究中有应用。


技术实现要素：

7.为解决上述背景技术中提到的不足，本发明的目的在于提供一种检测泌尿生殖道感染病原体核酸的dna探针及其应用，可快速、廉价、高灵敏度地检测沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和生殖支原体。
8.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
9.一种检测泌尿生殖道感染病原体核酸的dna探针，泌尿生殖道感染病原体包括沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和生殖支原体，dna探针包括探针h1和探针h2，dna探针与目标序列混合进行催化发夹自组装反应，探针h1的5’端由地高辛修饰，探针h2的5’端由生物素修饰。
10.泌尿生殖道感染病原体为沙眼衣原体，dna探针以seq id no.1所示的基因作为检测靶标，探针h1为序列如seq id no.2所示的ct-h1，探针h2为序列如seq id no.3所示的ct-h2。
11.泌尿生殖道感染病原体为淋病奈瑟菌，dna探针以seq id no.4所示的基因作为检测靶标，探针h1为序列如seq id no.5所示的ng-h1，探针h2为序列如seq id no.6所示的ng-h2。
12.泌尿生殖道感染病原体为生殖支原体，dna探针以seq id no.7所示的基因作为检测靶标，探针h1为序列如seq id no.8所示的mg-h1，探针h2为序列如seq id no.9所示的mg-h2。
13.一种检测泌尿生殖道感染病原体核酸的dna探针在制备检测沙眼衣原体产品中的应用。
14.一种检测泌尿生殖道感染病原体核酸的dna探针在制备检测淋病奈瑟菌产品中的应用。
15.一种检测泌尿生殖道感染病原体核酸的dna探针在制备检测生殖支原体产品中的应用。
16.一种泌尿生殖道感染病原体核酸的检测方法，包括以下检测步骤：
17.(1)取阴道分泌物，并将拭子头浸入含细胞保存液的取样管中；
18.(2)取250μl上述的待测标本，加入到含有h1和h2冻干粉的试管中，充分混匀后，至于35℃水浴锅中，水浴反应15分钟；
19.(3)水浴后，取80μl上述反应液分别滴加在免疫分析试纸条的加样孔中，5-10分钟后，将分析试纸条插入荧光检测仪，读取检测线和质控线的荧光值。
20.本发明的有益效果：
21.本发明利用等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条检测沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和生殖支原体核酸的检测，可快速、廉价、高灵敏度地检测沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和生殖支原体。该方法不需要繁杂的检测前准备，也不需要pcr检测的仪器，因此可实现沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和生殖支原体的即时检验。与pcr不同，由于本发明是无酶信号扩增系统，故无需用到成本较高的dna聚合酶，故能明显降低检测成本，可适用于大规模的筛查和即时检测，可满足未配备pcr仪器的基层医院进行快速检测。
附图说明
22.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
23.图1是本发明催化发夹型dna自组装反应的具体步骤；
24.图2是本发明免疫分析试纸条检测dig和bio双修饰的h1-h2杂交双链的原理；
25.图3是本发明非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证催化发夹型dna自组装反应用于检测沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和生殖支原体的可行性分析结果；
26.图4是本发明等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和生殖支原体核酸检测方法的灵敏度分析结果；
27.图5是本发明等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和生殖支原体核酸检测方法的特异性分析结果。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例1
30.检测探针冻干粉的制备
31.本发明根据已公开的沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和生殖支原体序列进行多序列比对，筛选出基因中长度为22个碱基的保守序列作为检测靶标。根据沙眼衣原体trpr基因的保守序列设计两个探针，分别记为ct-h1和ct-h2。根据淋病奈瑟菌pora假基因的保守序列设计两个探针，分别记为ng-h1和ng-h2。根据生殖支原体mgpb基因的保守序列设计两个探针，分别记为mg-h1和mg-h2。上述各探针h1的5’端标记地高辛(digoxin，dig)，而h2探针的5’端则用生物素(biotin，bio)修饰。相关序列见下表1：
32.表1探针序列
[0033][0034]
将所制备的探针分别用tae/mg
2+
缓冲液溶解至100nm/l后，进行退火处理，让各探针保持发夹结构，退火温度为：从95℃以1℃/min的速度缓慢降温至25℃。退火处理后，取h1探针和h2探针用tae/mg
2+
缓冲液稀释成10nm/l。取150μl稀释后的h1和50μl释后的h2混合于ep管中。将混合物至于真空冻干机做冻干处理。
[0035]
实施例2
[0036]
等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和生殖支原体核酸检测方法灵敏度分析
[0037]
根据选定的检测序列合成单链dna，用于分析该系统的检测灵敏度。将合成的dna
片段分别用tae/mg
2+
缓冲液稀释成100μm/l，再分别用正常健康人群的阴道分泌物标本液进行梯度稀释(1nm～1fm)。分别取250μl梯度目的dna溶液，加入基因探针冻干粉中，充分混匀后，至于37℃水浴锅中反应15分钟。反应结束后，取80μl反应液滴加在免疫分析试纸条(由南京东纳生物科技有限公司制备)加样孔中，5-10分钟后，荧光分析仪读取检测线(t-line)和质控线(c-line)的荧光值。结果如图4所示，以阴性对照荧光值的均值+3个标准差设置cutoff值。ct、ng、mg的阴性对照荧光值分别为100.5
±
17.2、121.3
±
23.3、175.3
±
52.8。所得cutoff值分别为152.1、191.2、333.7。根据cutoff值可知，本发明的检测方法的灵敏度(即最低检测浓度)为1fm。
[0038]
实施例3
[0039]
等温无酶信号放大系统联合免疫分析试纸条的沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和生殖支原体核酸检测方法特异性分析
[0040]
根据选定的检测序列(图3)合成单链dna，随机生成1个单碱基突变序列(记为smtd)和1个双碱基突变序列(记为dmtd)，分别合成单链dna。序列分别如表2所示。将各序列分别用tae/mg
2+
缓冲液稀释成100pm的待测溶液，取250μl上述待测液标本加入到试管中，充分混匀后，至于37℃水浴锅中反应15分钟。反应结束后，取80μl反应液滴加在免疫分析试纸条(由南京东纳生物科技有限公司制备)加样孔中，5-10分钟后，荧光分析仪读取检测线(t-line)和质控线(c-line)的荧光值。结果如图5所示，四管分别加入t、dmtd、smtd和缓冲液，本发明的检测方法具有高度的序列特异性，单碱基突变即可引起检测荧光值的明显下降，其荧光值与双突变的对照序列相当，都和空白对照组接近。
[0041]
表2特异性分析使用序列
[0042][0043]
表注：突变位点以下标线标记。
[0044]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变
化和改进都落入要求保护的本发明范围内。