FruR蛋白及其筛选方法和应用与流程

frur蛋白及其筛选方法和应用
技术领域
1.本发明属于合成生物学技术领域，具体涉及一种frur蛋白及其制备方法和 应用。


背景技术：

2.l-苯丙氨酸(l-phenylalanine,英文简写phe)，是最重要的芳香族氨基酸。 phe的用途主要是作为苯丙素类化合物的前体，例如阿斯巴甜 (l-phenylalanyl-laspartyl-methyl ester)。
3.phe主要通过经基因工程改造的大肠杆菌发酵合成。phe的合成代谢受到多 维度的调控，其包括反馈抑制、阻遏抑制和衰减等等。因此，为了消除负调控 抑制以提高phe产量，科研人员主要通过蛋白质改造等理性或者半理性策略改造 和调控蛋白，进而解除相关调控抑制。与此同时，科研工作者通过加强phe合成 途径的关键基因表达，阻断竞争代谢途径和加强phe向胞外转运效率等策略，以 提高大肠杆菌产phe的能力。这些改造策略主要集中在phe合成途径，但系统地、 全局地改造微生物代谢网络途径，特别是中心碳代谢途径，鲜有报道。
4.在大肠杆菌中，phe合成起始于磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvicacid，英文简写pep)和赤藓糖-4-磷酸(erythrose 4-phosphate，英文简写e4p) 的缩合反应，这两个前体物质分别是中心碳代谢途径和磷酸戊糖途径的重要中 间代谢产物。因此，对中心碳代谢途径和磷酸戊糖途径的改造以增加上述两种 前体物质的积累，是phe高产菌株遗传改造一种新的关键策略。在中心碳代谢途 径中，糖酵解和糖异生途径之间的碳代谢平衡主要受全局碳代谢调控因子frur (又名cra)调控。frur的调控功能又受到胞内果糖-1,6-二磷酸(fructose 1,6 diphosphate，英文简写fdp)等诱导剂诱导调控。当不存在诱导剂时，furr调控 因子与受调控的基因相结合，进而抑制参与糖酵解的基因并激活参与糖异生和 乙醛酸循环的基因；反之，当存在诱导剂时，furr调控因子与受调控的基因解 离，并与诱导剂相结合，从而解除了受调控基因的被抑制和激活效应。基于上 述原理，可以通过改造furr调控因子以激活糖异生途径和乙醛酸循环，从而增 加pep和e4p的积累，最终促进phe的生成。
5.目前，通过改造furr调控因子进而促进phe的生成的研究还未见有相关报 道。因此，本专利通过半理性改造furr调控因子，并结合phe响应的生物传感 器筛选出具有激活效应的furr突变调控因子，对提高苯丙氨酸及上游代谢途径 中的代谢产物的产量有着十分重要的应用价值。
6.因此，如何提供一种frur蛋白及其筛选方法和应用是本领域亟待解决的问 题。


技术实现要素：

7.本发明公开了一种frur蛋白及其筛选方法和应用。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.调控因子frur蛋白突变体，包括以下突变之一：e173k、a18p、p129h、 i144t、
frur
e173k
蛋白突变体相关的生物材料在提高乙酰辅酶a、苹果酸、琥珀酸、延 胡索酸、磷酸烯醇式丙酮酸、葡萄糖酸-6-磷酸、核糖-1-磷酸、莽草酸和苯丙氨 酸中的应用；
33.如上所述的调控因子frur
e173k
蛋白突变体和权利要求2-3所述的与调控因 子frur
e173k
蛋白突变体相关的生物材料在制备提高乙酰辅酶a、苹果酸、琥珀 酸、延胡索酸、磷酸烯醇式丙酮酸、葡萄糖酸-6-磷酸、核糖-1-磷酸、莽草酸和 苯丙氨酸制剂中的应用；
34.如上所述的调控因子frur蛋白突变体基因序列的筛选方法，其特特征在于， 方法为：
35.将苯丙氨酸的转录调控响应元件-报告基因、frur突变基因表达盒转入缺失 frur基因的工程菌，通过报告基因的指示来选择可行性frur突变基因；
36.优选的，所述苯丙氨酸的转录调控响应元件为色氨酸特异的转运蛋白启动 子；
37.优选的，报告基因为荧光报告基因；更优选的，所述荧光报告基因为红色 荧光蛋白；
38.frur野生型dna序列:
39.gtgaaactggatgaaatcgctcggctggcgggagtgtcgcggaccac tgcaagctatgttattaacggcaaagcgaagcaataccgtgtgagcgaca aaaccgttgaaaaagtcatggctgtggtgcgtgagcacaattaccacccg aacgccgtggcagctgggcttcgtgctggacgcacacgttctattggtctt gtgatccccgatctggagaacaccagctatacccgcatcgctaactatcttg aacgccaggcgcggcaacggggttatcaactgctgattgcctgctcagaa gatcagccagacaacgaaatgcggtgcattgagcaccttttacagcgtca ggttgatgccattattgtttcgacgtcgttgcctcctgagcatcctttttatc aacgctgggctaacgacccgttcccgattgtcgcgctggaccgcgccctc gatcgtgaacacttcaccagcgtggttggtgccgatcaggatgatgccga aatgctggcggaagagttacgtaagtttcccgccgagacggtgctttatct tggtgcgctaccggagctttctgtcagcttcctgcgtgaacaaggtttccg tactgcctggaaagatgatccgcgcgaagtgcatttcctgtatgccaacag ctatgagcgggaggcggctgcccagttattcgaaaaatggctggaaacgc atccgatgccgcaggcgctgttcacaacgtcgtttgcgttgttgcaagga gtgatggatgtcacgctgcgtcgcgacggcaaactgccttctgacctggc aattgccacctttggcgataacgaactgctcgacttcttacagtgtccggt gctggcagtggctcaacgtcaccgcgatgtcgcagagcgtgtgctggaga ttgtcctggcaagcctggacgaaccgcgtaagccaaaacctggtttaacg cgcattaaacgtaatctctatcgccgcggcgtgctcagccgtagctaa
40.pmtr启动子序列：
41.gcagttactgggcgatgcacagccgcatactggcggtgagcgtcgtggcggtggtcgtggtttcggtggcgaac gtcgtgaaggcggtcgtaacttcagcggtgaacgccgtgaaggtggccgtggtgatggtcgtcgttttagcggcgaacgt cgtgaaggccgcgctccgcgtcgtgatgattctaccggtcgtcgtcgtttcggtggtgatgcgtaatcatcgctgaacagc gaacacaatctgtaaaataatatatacagccccgatttttaccatcggggctttttttctgtcttttgtactcgtgtactggtacag tgcaatgcatactagatactagagaaagaggagaaatactag
42.rfp基因序列：
43.atggttagcaaaggcgaagagctgatcaaggagaacatgcacatgaa actgtacatggaaggtaccgttaacaaccaccattttaagtgcaccagcga aggcgagggtaaaccgtatgagggcacccagaccatgcgtatcaaggtgg ttgaaggtggcccgctgccgtttgcgttcgatattctggcgaccagcttta tgtacggcagccgtaccttcatcaaccatacccagggtattccggatttctt taaacagagctttccggagggcttcacctgggaacgtgtgaccacctacg aggacggtggcgttctgaccgcgacccaggataccagcctgcaagacggt tgcctgatctataa
cgtgaaaattcgtggcgttaactttccgagcaacggt ccggtgatgcagaaaaagaccctgggctgggaagcgaacaccgagatgc tgtacccggcggatggtggcctggaaggtcgtagcgacatggcgctgaag ctggttggtggcggtcacctgatctgcaacttcaaaaccacctatcgtagc aaaaagccggcgaaaaacctgaagatgccgggcgtgtactatgttgatca tcgtctggaacgtattaaagaggcggacaaggaaacctacgtggaacagc acgaggtggcggttgcgcgttattgcgacctgccgagcaaactgggtcat aagctgaactaa
44.frur野生型氨基酸序列：
45.mkldeiarlagvsrttasyvingkakqyrvsdktvekvmavvrehnyh pnavaaglragrtrsiglvipdlentsytrianylerqarqrgyqlliacsed qpdnemrciehllqrqvdaiivstslppehpfyqrwandpfpivaldraldre hftsvvgadqddaemlaeelrkfpaetvlylgalpelsvsflreqgfrtawk ddprevhflyansyereaaaqlfekwlethpmpqalfttsfallqgvmdvt lrrdgklpsdlaiatfgdnelldflqcpvlavaqrhrdvaervleivlaslde prkpkpgltrikrnlyrrgvlsrs
46.综上所述，本发明公开了一种frur蛋白及其筛选方法和应用，本技术提供 一种调控因子frur蛋白，将工程菌中野生型frur基因替换成本技术frur基因， 重组的工程菌在乙酰辅酶a、苹果酸、琥珀酸、延胡索酸、磷酸烯醇式丙酮酸、 葡萄糖酸-6-磷酸、核糖-1-磷酸、莽草酸和苯丙氨酸的产量上明显提高，为相关 代谢产物合成生物学打下基础。
附图说明
47.图1：pgrb-δfrur敲除质粒的图谱。pgrb-δfrur质粒包含sgrna-frur序列和 δfrur上下同源臂；
48.图2：frur基因敲除的验证跑胶图；
49.m：dnamaker；
50.1-2：frur野生型；
51.4-11：frur缺失型；
52.图3：pgrb-δfrur::cmr质粒的图谱，质粒包含sgrna-frur序列、δfrur上下同 源臂和cmr插入片段；
53.图4：cmr基因整合的验证跑胶图；
54.m：dnamaker；
55.1-2：阴性对照(w3110基因组为模板)；
56.3-4：阴性对照(pgrb-δfrur::cmr质粒为模板)；
57.5-14：阳性重组子；
58.图5：pcmn20-frur
mt
质粒的图谱，质粒包含sgrna-cmr序列、δfrur上下同源 臂和frur
mt
突变文库插入片段；
59.图6：pmtr-rfp质粒的图谱，质粒包含可响应胞内phe的pmtr启动子和表达红 色荧光蛋白的rfp；
60.图7：w3110-pmtr-rfp在不同phe浓度中的rfp荧光值/od610的曲线图；
61.图8：frur
mt
突变体和frur
wt
野生型的荧光强度(mfu)/od610值的热图(heatmap)，其中，h:n10-n12、p:n22-n24和z：n34-n36所处的单元为对照组frur
wt
野生型的mfu/od610值，其余的为突变体的mfu/od610值。
具体实施方式
62.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述 的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
63.实施例1 frur调控因子缺失影响菌株产phe生成能力
64.frur是全局碳代谢调控因子，其通过响应胞内的果糖-1,6-二磷酸(fructose 1,6diphosphate，英文简写fdp)等诱导剂浓度，对糖酵解和糖异生途径之间的 碳平衡进行调控。据先前文献报道，frur调控因子的缺失会导致碳代谢流的重 置，使得代谢流导向苯丙氨酸合成途径，最终增加phe的生成(liu et al.,2016； chen et al.,2019)。基于此，本专利以氨基酸生产及代谢调控研究中常用到的大 肠杆菌k12-w3110感受态细胞为底盘菌株(购自上海吐露港生物科技有限公 司，货号cc96148-01)，通过crispr/cas9基因编辑技术敲除w3110的frur 调控因子基因，从而获得该调控因子的缺失的苯丙氨酸高产菌株w3110δfrur。
65.crispr/cas9基因编辑质粒的构建
66.本专利采用的大肠杆菌crispr/cas9基因编辑系统包含pgrb和predcas9 两个质粒(购自ntcc典型培养物保藏中心，货号分别为plasmid 71539和 plasmid 071541)。pgrb质粒包含了sgrna序列以及同源重组融合臂和插入目 的基因的序列片段，而predcas9包含了iptg诱导的λ-red同源重组系统和l
‑ꢀ
阿拉伯糖诱导的可识别pgrb的sgrna。
67.本专利所采用的质粒感受态宿主菌为大肠杆菌dh5α(购自北京擎科生物科 技有限公司，货号为tsc-c14)。
68.为了定点定位敲除w3110基因组的frur基因，pgrb-δfrur质粒的构建如 下：
69.(1)利用一对引物sgrna-rev(actagtattatacctaggactgagctagctgtc)和sg-frur (gtcctaggtataatactagtagcccagctgccacggcgttgttttagagctagaaatagcaag)， 并以pgrb质粒作为模板，通过kapahifi高保真酶试剂盒(kapa hifihotstratpcrkit，货号为kk2502，购自罗氏诊断产品(上海)有限公司生命科学部)环扩 整个pgrb质粒，进而将sgrna-frur序列引入pgrb质粒。接着，pcr产物通 过胶回收试剂盒(e.z.n.a.gel extraction kit,d2500-02,omega)分离和纯化 pcr产物，然后将纯化的pcr产物直接转至大肠杆菌dh5α感受态细胞，最终 得到含pgrb-sgrna-frur的dh5α菌。sgrna-frur序列的正确通过dna测序 验证。
70.(2)为了将同源重组上下融合臂整合至pgrb-sgrna-frur质粒中，首先 利用两对引物frur-out-ff(gagtcggtgcttttttccggccgtcattcacaatcttatatg)/frur-out-fr (gttaaaccaggttttggctttgccgttaataacatagcttgcagtggt)和frur-out-rf (gttaaaccaggttttggctttgccgttaataacatagcttgcagtggt)/frur-out-rr (cagtgagcgaggaagcagcatcacttcttttgtca)，以w3110基因组为模板，分别扩增得到上 下同源重组融合臂；接着，以pgrb-sgrna-frur质粒为模板，通过利用一对引 物ptragtf-for(cttcctcgctcactgactcgctg)/ptragtf-rev (aaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaag)扩增该质粒，获得质粒骨架pgrb-sgrna-frur；然后，将纯化之后的三个dna片段通过seamless cloning kit (无缝克隆试剂盒，货号为d7010m，上海碧云天生物技术有限公司)，无缝地将 三个片段整合为完整的质
al., 2016；chen et al.,2019)。因此，我们推断通过进一步增加frur调控因子的抑制 或者激活功能可以进一步提高phe的产量。基于此，我们将通过半理性手段改 造frur调控因子，并结合phe生物传感器筛选有利于phe合成的突变体。
92.表1：比较frur缺失菌株和对照组之间的发酵性能参数
[0093][0094]
注，nd：代表发酵液中未检测到苯丙氨酸
[0095]
实施例2改造frur调控因子促进phe生成
[0096]
本研究，我们将通过半理性的蛋白质改造手段改造frur调控因子，即利用 易错pcr对frur基因引入随机突变，进而建立随机突变库。然后，这些突变库 通过crispr/cas9基因编辑技术直接整合至w3110的基因组中。最后，我们将 结合phe生物传感器和hplc方法分别检测胞内外phe浓度，筛选出有利于 phe生成的突变体。
[0097]
frur突变库的建立
[0098]
frur突变库的建立通过使用takara bio公司的pcr randommutagenesis kit(pt3393-2)。首先，根据已知的frur基因的序列，使用引物对 frur-for(gtgaaactggatgaaatcgctcggctggcgggag)/frur-rev(ttagctacggctgagcacgccgcgcgatag)扩增frur基因。同时，为了获得较高的突变率，易错pcr反应体系的 配制和pcr运行条件参考表2。接着，为了进一步增加突变率，第一步得到的 产物将作为模板，继续下一轮的易错pcr。最后，得到的突变库通过pcr产物 回收试剂盒回收。
[0099]
表2:易错pcr反应体系和条件
[0100][0101]
crispr/cas9介导突变文库的整合
[0102]
抗性标记基因cmr整合替换frur基因
[0103]
为了将frur基因突变文库整合至w3110的frur基因位点且消除野生型 frur基因背景的影响，我们先利用crispr/cas9技术将基因组中frur基因替换 为氯霉素抗性基因cmr。之后，我们再利用crispr/cas9技术把氯霉素抗性基 因cmr替换为frur基因突变文库，这保证得到的菌株为frur突变体。
[0104]
为了将cmr抗性基因整合至frur基因位点，(1)pgrb-δfrur::cmr质粒的 构建。首先以pacycduet-1质粒为模板，利用引物对 cmr-for(tgatcggcacgtaagaggttccaactttcac)/cmr-rev(ttacgccccgccctgccactcatcgca gtac)，扩增得到抗性基因片段cmr。接着，以pgrb-δfrur质粒为模板，利用引 物对 frur-out-rev(aacctcttacgtgccgatcagttaaaccaggttttggctttgccgttaataacatagcttgcagtggt)/ frur-out-rev(gtactgcgatgagtggcagggttaaaccaggttttggctttgccgttaataacatagcttgcagtggt) ，环扩pgrb-δfrur质粒。最后，将纯化好的基因片段cmr和线性质粒骨架 pgrb-δfrur通过seamless cloning kit无缝地连接为一个环状质粒 pgrb-δfrur::cmr(图3)，并热转导至dh5α感受态细胞。
[0105]
(2)crispr/cas9介导cmr抗性基因的整合。w3110/predcas9电转化感 受态细胞的制备和pgrb-δfrur::cmr质粒的转化参考第1.2章节。阳性重组子的 验证通过氯霉素抗性验证和克隆pcr验证。其中，克隆pcr验证的引物对为 frur-check-for(ctgggaatgcacggtacctacgaagc) /cmr-rev(ttacgccccgccctgccactcatcgcagtac)，验证跑
胶图结果如图4所示。
[0106]
crispr/cas9介导frur突变文库的整合
[0107]
frur突变文库的整合参考第2.2.1章节的cmr抗性基因整合。(1) pgrb-δcmr::frur
mt
(mt：mutant)质粒的构建。首先，以pgrb-δfrur::cmr质粒为模板，通过引物对sgrna-rev(actagtattatacctaggactgagctagctgtc)/sg-cmr (gtcctaggtataatactagttgatgaacctgaatcgccaggttttagagctagaaatagcaag)环 扩该质粒，进而得到含有sgrna-cmr的pcmn20-δfrur::cmr质粒。接着，以 pcmn20-δfrur::cmr质粒为模板，通过引物对 ptragtf-for(cttcctcgctcactgactcgctg)/ptragtf-rev (aaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaag)环扩该质粒，得到质粒骨架片段pcmn20。然 后，将第2.1章节构建的frur突变文库片段与质粒骨架片段pcmn20，通过 seamless cloning kit无缝地两个片段整合为完整的质粒：pcmn20-frur
mt
(图5)； 最终，整合的质粒产物pcmn20-frur
mt
转化至dh5α感受态细胞，得到的转化子 通过克隆pcr和dna测序验证。
[0108]
(2)crispr/cas9介导frur
mt
突变文库的整合。首先，提取和纯化 pcmn20-frur
mt
质粒。利用质粒提取试剂盒(tianprep mini plasmid kit, tiangen)提取和纯化pcmn20-frur
mt
质粒，以制备frur
mt
突变文库。接着，制 备w3110δfrur::cmr/predcas9电转化感受态细胞(方法参考上述章节)，之后， 将pcmn20-frur
mt
质粒与w3110δfrur::cmr/predcas9感受态细胞共孵育15 min。然后，进行电转化，电转化条件参考上述章节。最后，得到的重组子将通 过筛选鉴定和dna测序，确定表型和基因型。
[0109]
phe生物传感器介导frur突变子的筛选和鉴定
[0110]
转录调控因子(transcriptionfactor)是微生物体内一种重要的调控蛋白，它以 特定的胞内代谢物作为配体，与被调控蛋白的启动子区域结合后对下游基因进 行调控。据文献报道，mtr是色氨酸特异的转运蛋白，其启动子可以响应胞内的 phe(苯丙氨酸)浓度，进而调控下游基因的转录和表达。当存在phe时，phe 会结合strong tyrrbox，从而启动基因的转录；当存在色氨酸时，色氨酸会与 trprboxes相结合，从而阻遏基因的转录。基于此，我们构建了一套能够利用转 录调控因子响应胞内苯丙氨酸含量，并且可将苯丙氨酸浓度转化为荧光信号的 元件，phe生物传感器，应用于高通量筛选和鉴定重组突变体。
[0111]
phe生物传感器的构建和表征
[0112]
phe生物传感器的构建流程如下：
[0113]
(1)phe响应的转录调控元件pmtr的扩增。以w3110菌的基因组为模板， 利用引物对pmtr-for(gcagttactgggcgatgcacagccgcatac)/pmtr-rev (tatgcattgcactgtaccagtacacgagtac)扩增基因组dna，得到pmtr转录调控元件。
[0114]
(2)pmtr-rfp质粒的构建。为了将胞内phe浓度转化为荧光信号，pmtr 启动子元件被整合至表达红色荧光蛋白rfp的5’段。基于此，以pet-28a质粒 为模板，利用引物对rfp-for (ctggtacagtgcaatgcatactagatactagagaaagaggagaaatac)/rfp-rev (gtgcatcgcccagtaactgcaattcttataagggattttgccgatttc)环扩pet-28a质 粒，得到质粒骨架pet-28a。接着，将pmtr片段、人工合成的rfp基因序列以 及pet-28a骨架，通过seamless cloning kit无缝地连接为一个环状质粒 pmtr-rfp(图6)。最后，并分别热转导至w3110和w3110感受态细胞。
[0115]
phe生物传感器的表征流程如下：
[0116]
(1)配制含不同苯丙氨酸浓度的m9培养基。m9培养基(1l)的配方为： 100ml的10
×
m9盐浓液(75.2g/lna2hpo4·
2h2o，30g/lkh2po4，5g/lnacl， 5g/lnh4cl，ph 7.2)，7ml的60％葡萄糖(单独灭菌)，1ml的1mol/l 硫酸镁(单独灭菌)，0.3ml的1mol/l氯化钙(单独灭菌)，1ml的1g/l生 物素(过滤除菌)，1ml的1g/l硫胺素(过滤除菌)和10ml的100
×
微量 元素浓缩液(见表3)。l-苯丙氨酸添加浓度为0、10、25、50、75、100、150 和200μm。
[0117]
表3：100
×
微量元素溶液成分表
[0118][0119][0120]
(2)w3110-pmtr-rfp的培养。首先，将第2.3.1章节构建好的 w3110-pmtr-rfp单克隆子转接至lb培养基(含50μg/l卡那霉素)中，于37℃ 摇床培养箱，200rpm，培养过夜。接着，将过夜培养液按相等od610分装至 1.5ml的离心管，分装成24份。然后，12,000rpm，2min离心，收集菌体并 移除上清液。紧接着，用m9培养基洗涤菌体，重复两次。最后，将菌体重悬至 含10ml不同苯丙氨酸浓度的m9培养基中，每个浓度设置3个平行样，于37℃ 摇床培养箱，200rpm，培养12h。
[0121]
(3)红色荧光蛋白荧光值的测定。在本实验中，红色荧光蛋白的荧光值的 测定采用tecan m200 pro多功能酶标仪测定。首先，12,000rpm 2min离心收 集培养了12h的菌体。然后用pbs缓冲液洗涤菌体三次，并用pbs缓冲液稀释 100倍。接着，每个样品中的三份等量200μl样品被转移至96孔板。最后，配 制好的样品通过tecanm200 pro多功能酶标仪测定荧光值和菌体od610，其中 测定荧光值时，激发光波长为540nm，吸收光波长为600nm。w3110-pmtr-rfp 在不同phe浓度培养中，rfp荧光值/od610的结果如图7所示。由图7可知， rfp荧光值/od610与phe浓度有较好的线性关系，其中拟合曲线方程为 y＝12276ln(x)-22465，r2＝0.9524。另外，pmtr-rfp生物传感器也有很宽的响应 范围，在phe浓度为200μm时，rfp荧光值/od610还未达到饱和值。以此同 时，该生物传感器具有很低的背景干扰(不存在phe时，rfp荧光值/od610 为1800)。综上所述，pmtr-rfp是个具有响应曲线好、响应范围宽和响应背景 低的生物传感器，可以应用于突变文库的筛选和鉴定。
[0122]
phe生物传感器应用于突变文库的筛选和鉴定
[0123]
在本章节中，为了利用生物传感器去筛选和鉴定frur
mt
突变体，pmtr-rfp 质粒被转化至w3110δfrur::cmr/predcas9(phe01)细胞中，得到 phe01/pmtr-rfp。基于此，pcmn20-frur
mt
突变文库将通过crispr/cas9基因 编辑工具整合至phe01/pmtr-rfp基因组中，得到的突变重组子 w3110δcmr::frur
mt
/pmtr-rfp将通过m9平板筛选分离。phe生物传感器应用 于突变文库的筛选和鉴定流程如下：
[0124]
(1)frur
mt
突变体初筛选。根据菌落的大小和荧光的强度，m9平板上的 frur
mt
突变子将被挑选至96孔板中进行初筛。本实验中，我们挑取了279个重 组子至3块96孔板中，其中每块96孔板含有三个阳性对照平行样： w3110/pmtr-rfp(含有野生型frur基因)。
[0125]
(2)frur
mt
突变体第二次筛选。挑选的突变子在培养15小时之后，279 个突变子的荧光值和od610通过tecan m200 pro多功能酶标仪测定。每个突 变体的rfp荧光值/od610通过热图(heat map)形式展示，如图8所示。通过 比对分析，我们选取了其中50个具有较高的rfp荧光值/od610的突变体，分 别通过iptg诱导消除pcmn20-frur
mt
质粒以及高温42℃诱导消除predcas9质 粒，最后得到w3110δcmr::frur
mt
/pmtr-rfp菌株。利用每个突变子作为模板， 利用高保真酶kapa扩增了frur基因。最后，分离纯化后的片段通过dna测 序确认突变位点，这50个突变子的突变类型有八种，其中frure173k占比为 40％，frura18p占比为22％，frurl3f-l170n占比为16％，frurs75i-v160e 占比为10％，frurp129h占比为6％，fruri144t占比为2％，frure72r-p128a 占比为2％，frurr312g占比为2％。
[0126]
(3)frur
mt
突变体第三次筛选。基于第二次筛选得到的八种类型突变体，我 们将通过摇瓶发酵这八种突变体和野生型菌株，通过测量其最终产物phe的浓 度和od610，进而确认最佳突变体。通过对发酵结果的比对分析可知，突变体 frur
e173k
、frur
a18p
和frur
p129h
为前三个最优phe生产菌，其产量分别为1.16
±ꢀ
0.14g/l、0.94
±
0.02g/l和0.90
±
0.05g/l，较对照组分别提高了227％、184％和 176％。因此，突变体frur
e173k
为最佳突变体，将被作为目标菌种进行后续比较 转录组学和代谢组学，进而揭示frur的突变对碳代谢流的影响。
[0127]
实施例3 frure173k调控因子重置碳代谢流
[0128]
为了研究frur
e173k
调控因子的突变对宿主菌w3110δcmr::frur
e173k (phe02)的碳代谢流影响以及对phe生物合成的影响，我们比对了突变菌 phe02和原始菌w3110之间的转录组学和代谢组学。
[0129]
代谢组学和转录组学样品的制备
[0130]
突变菌phe02和原始菌w3110的摇瓶发酵培养基和培养过程，参考第1.3 章节。当两株菌株生长至对数期中期(20h)时，我们将收集样品进行下一步的 转录组学和代谢组学分析，样品的制备条件为：6个2ml样品用于代谢组学分 析，3个10ml样品用于转录组学分析。样品制备完毕之后，所有的样品在液氮 中淬灭1min，之后迅速转移至干冰中。样品的分析将交付给上海百趣生物医学 科技有限公司分析。样品的转录组学和代谢组学比对分析结果总结于表4和表5。
[0131]
表4：原始菌w3110和突变菌phe02的转录组比对分析
[0132][0133]
[0134][0135]
frur
e173k
调控参与碳代谢基因的转录与表达
[0136]
全局碳代谢调控因子frur(又名cra)可调控糖酵解途径和糖异生/乙醛酸 途径之间的碳代谢流平衡，其调控功能受到胞内诱导剂(如果糖-1,6-二磷酸等) 诱导调控。当不存在诱导剂时，furr调控因子与受调控的基因相结合，进而抑 制参与糖酵解的基因并激活参与糖异生/乙醛酸循环的基因；反之，当存在诱导 剂时，furr调控因子从受调控的基因解离，并与诱导剂相结合，这解除了受调 控基因的被抑制和激活效应。
[0137]
通过对突变菌phe02和原始菌w3110之间的转录组学数据比较分析可得 (表4)，在以葡萄糖为碳源(存在诱导剂)时，相对于原始菌w3110，在突变 菌phe02中，参与糖异生途径的基因(pgi、fbp、ppsa、gpmm)和参与乙醛酸 循环途径的基因(aceab、maeb、frda-d)的转录都被显著地上调；参与糖酵 解途径中的基因没有显著地被调控。这些结果表明，存在诱导剂时，参与到糖 异生和乙醛酸循环途径的基因仍被frure173k调控因子激活，而参与糖酵解途 径的基因处于正常的转录水平。基于此，存在诱导剂时，糖异生和乙醛酸循环 的激活，分别促进了赤藓糖-4-磷酸(磷酸戊糖途径的中间体)和磷酸烯醇式丙 酮酸的积累，这为phe的合成提供足量的前体物质。
[0138]
表5：原始菌w3110和突变菌phe02的代谢组比对分析
[0139][0140][0141]
如表4所示，由于糖异生途径相关基因被激活，前体物质(果糖-6-磷酸等) 的积累进而促进了磷酸戊糖途径的相关基因的上调，这些基因包括zwf、tktab 和rpiab。从表5可知，由于磷酸戊糖途径的激活，葡萄糖酸-6-磷酸等中间体 在突变菌phe02中显著地积累。另外，由于糖异生生途径和乙醛酸循环的激活， 在phe02突变菌中，磷酸烯醇式丙酮酸、马来酸、延胡索酸等中间代谢产物也 显著上调。基于此，合成phe的前体物质的积累，导致代谢流重置导向phe生 物合成途径，这导致了参与合成phe的关键基因的转录被显著上调，这些基因 包括arof、arolk、aroc、aroa、phea和tyrb等(表4)。在phe03突变菌中， 参与phe合成基因的转录的显著上调，使得目标产物phe的产量也显著上调(表 5)。
[0142]
总之，新改造的frur
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的突变调控因子，使得即使存在诱导剂时，参与糖 异生途径和乙醛酸循环的基因仍被激活，且未影响参与糖酵解途径基因的转录。 基于此，frur
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的突变调控因子导致碳代谢流重置，进而导向磷酸戊糖途径和 phe生物合成途径，最终实现phe的高产。
[0143]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是 与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0144]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本 发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的， 本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它 实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要 符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。