一种芳基硼酸取代阳离子卟啉阵列传感器及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种芳基硼酸取代阳离子卟啉阵列传感器及其制备方法和应用。


背景技术：

2.糖类化合物在生命体内以多种形式存在，从单糖到分子量上万的多糖，都有被发现在生命体系中扮演着各种重要的角色。在生物医学领域，糖类化合物的重要性也是不言而喻。例如，通过测定血液中的葡萄糖含量，所获得的血糖数据是衡量人体糖代谢过程是否正常的最重要标准，也是糖尿病人日常身体检查的重要项目。开发用于糖类化合物定量检测的新技术、新方法具有重要的意义。
3.迄今，血糖检测的核心技术是依靠葡萄糖氧化酶对葡萄糖特异性的催化氧化反应，才实现了对葡萄糖的特异性检测(h.teymourian,a.barfidokht,j.wang,chem.soc.rev.2020,49,7671-7709)。例如近期han等人将葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和二氨基联苯胺显色剂载入到三维的peg-da水凝胶中，构建的复合水凝胶材料可以直接用于全血样品中葡萄糖浓度的检测(j.dai,h.zhang,c.huang,z.chen,a.han,analytical chemistry 2020,92,16122-16129.)。liu等人报道了基于葡萄糖氧化酶和卟啉-氧化镍纳米复合物的传感体系用于葡萄糖显色法检测(q.liu,y.yang,h.li,r.zhu,q.shao,s.yang,j.xu,biosens.bioelectron.2015,64,147-153.)。此外，最近著名期刊《nature biomedical engineering》上面还有文献报道利用葡萄糖核酸适配体构建纳米探针，用于葡萄糖的特异性检测(m.poudineh,c.l.maikawa,e.y.ma,j.pan,d.mamerow,y.hang,s.w.baker,a.beirami,a.yoshikawa,m.eisenstein,s.kim,j.e.a.appel,h.t.soh,nat.biomed.eng.2021,5,53-63.)。再如利用环状多肽分子对葡萄糖的特异性结合能力构建的探针体系等也有文献报道(x.wu,j.yin,j.liu,y.gu,s.wang,j.wang,analyst 2020,145,7234-7241.)。这些已有的葡萄糖检测方法虽然在一定程度上可行，但是其材料的核心部分依赖对葡萄糖具有天然靶向性的生物分子，如葡萄糖氧化酶、核酸适配体和环状多肽等。这些原材料或者需要从生物组织中提取，或者其人工合成成本很高。更重要的是，如葡萄糖氧化酶等生物活性分子，其活性受到环境因素的影响很大，可能直接导致检测结果的假阳性或者假阴性。此外，这些方法的设计思路缺少新意，换汤不换药。
4.由此可见，由于糖类检测对象在化学结构上的特殊性，现有方法往往依赖自然界中已发现的糖靶向性生物分子作为识别单元构建传感体系，这一方面增加了成本，另一方面检测结果容易受到这些生物分子自身活性的影响。发展低成本、易合成、准确高效的新材料、新方法用于葡萄糖等单糖的检测具有重要意义。


技术实现要素：

5.发明目的：针对现有技术的不足与缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供了一
种新化合物芳基硼酸取代的阳离子卟啉。
6.本发明还要解决的技术问题是提供了该新化合物芳基硼酸取代的阳离子卟啉的制备方法和应用。
7.本发明最后要解决的技术问题是提供了一种检测灵敏度高、快速、准确的芳基硼酸取代阳离子卟啉阵列传感器及其制备方法和应用。
8.技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种芳基硼酸取代的阳离子卟啉，其结构式如下：
[0009][0010]
本发明内容还包括所述的芳基硼酸取代的阳离子卟啉的制备方法，包括如下步骤：称取原料5,10,15,20-四(4-吡啶基)卟啉和4-溴甲基苯硼酸，用干燥的dmf溶解，并将溶液在氮气保护下加热，然后真空浓缩，丙酮稀释，形成的沉淀物通过过滤收集并溶解在甲醇中，再次过滤，除去不溶性物质，滤液真空浓缩至干，通过从甲醇到丙酮的再沉淀纯化，得到深紫色粉末。
[0011]
本发明内容还包括所述的芳基硼酸取代的阳离子卟啉在制备芳基硼酸取代阳离子卟啉阵列传感器中的应用。
[0012]
本发明内容还包括一种芳基硼酸取代阳离子卟啉阵列传感器，所述阵列传感器包括多个传感单元构成，所述传感单元包括所述的芳基硼酸取代的阳离子卟啉构建得到。
[0013]
其中，所述阵列传感器包括多个传感单元组成，所述多个传感单元是分别将七叶内酯和芳基硼酸取代的阳离子卟啉在不同ph的乙醇/pbs缓冲溶液中混合获得。
[0014]
其中，所述不同ph分别为ph 6.2、ph 7.4或ph 7.8。
[0015]
本发明内容还包括所述的芳基硼酸取代阳离子卟啉阵列传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0016]
1)baap-1传感单元制备：向离心管中加入ph 6.2的乙醇/pbs＝3/1混合溶液，加入储备液a和储备液b，得baap-1传感单元；
[0017]
2)baap-2传感单元制备：向离心管中加入ph 7.4的乙醇/pbs＝3/1混合溶液，加入储备液a和储备液b，得baap-2传感单元；
[0018]
3)baap-3传感单元制备：向5ml离心管中加入ph 7.8的乙醇/pbs＝3/1混合溶液，加入储备液a和储备液b，得baap-3传感单元；
[0019]
4)七叶内酯-芳基硼酸取代的阳离子卟啉阵列传感器即由baap-1、baap-2、baap-3三个传感单元组成。
[0020]
其中，所述储备液a是将baap溶于dmf中，得储备液a；所述储备液b是将七叶内酯溶
于dmf中，得储备液b。
[0021]
本发明内容还包括所述的芳基硼酸取代阳离子卟啉阵列传感器在单糖检测中的应用。
[0022]
其中，本发明所述单糖包括但不仅限于果糖、d-葡萄糖-6-磷酸二钠盐、d-果糖-6-磷酸二钠盐、d-果糖-1,6-二磷酸三钠盐、半乳糖或甘露糖中的一种或几种。
[0023]
本发明检测原理：本发明通过对芳基硼酸取代的阳离子卟啉进行超分子组装，得到三组分的传感单元，不同传感单元对所检测单糖有差异性的荧光响应信号，从而获得高维度的检测数据。在此基础上，通过线性判别分析对高维数据进行降维，获得每种单糖特定的模式，从而实现对单糖的种类、浓度的区分和检测。
[0024]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：
[0025]
1、本发明首次合成获得了一种新化合物芳基硼酸取代的阳离子卟啉，该芳基硼酸取代的阳离子卟啉可以用于芳基硼酸取代阳离子卟啉阵列传感器的构建。
[0026]
2、本发明的检测试剂制备简便、成本低；本发明所设计的方案只需少量合成1-2种荧光染料分子，通过两种组分的混合或者溶液ph的调控即可获得相应的阵列传感器。该方法使用便捷、成本低廉，不需要大型贵重仪器，可以用于现场即时检测。
[0027]
3、本发明的阵列传感器荧光检测的灵敏度高：本发明可以在0.5mm浓度下对7种重要单糖进行准确的识别检测。
[0028]
4、检测操作简便、速度快：检测过程只需按照步骤简单配制指定的溶液，在酶标仪上读取数据即可分析得到最终结果，方便快捷。酶标仪读数仅需1分钟左右，速度快、效率高。
[0029]
5、本发明能够用于常见7种单糖在水样和血清环境中的定量、准确、快速的检测。
[0030]
此外，本发明解决了现有血糖检测技术对葡萄糖氧化酶、或葡萄糖适配体、或葡萄糖环状靶向肽等生物活性分子的依赖性问题，通过化学手段实现对葡萄糖的快速准确检测；解决了现有糖化合物分析技术对核磁、质谱、高效液相色谱等贵重仪器的依赖性问题。以低成本的付出，获取准确的糖类化合物区分检测信号；本发明的方法不需要用到蛋白酶、核酸、多肽等复杂生物活性分子，可以避免因这些复杂生物分子活性变化造成的结果不确定性；本发明的荧光传感阵列用于单糖检测时不产生任何有害副产物，没有二次污染。综上考虑，本发明荧光传感阵列的检测成本和检测性能都明显优于依赖于大型仪器的分析检测方法。
附图说明
[0031]
图1为baap在(cd3)2so中的1h nmr谱图(400mhz)；
[0032]
图2荧光传感阵列测试糖类化合物荧光的示意图。
[0033]
图3用baap传感器阵列区分单糖：a)0.5mm；b)1.0mm；c)4.0mm；d)10.0mm；e)20.0mm；
[0034]
图4在含有5％血清的pbs中，使用baap荧光传感阵列对于各种单糖：a)0.5mm；b)1.0mm；c)4.0mm；d)10.0mm；e)20.0mm的响应。
具体实施方式
[0035]
下面结合附图对本发明的技术方案进行进一步说明。
[0036]
实施例1芳基硼酸取代的阳离子卟啉(baap)的制备
[0037]
于150ml史莱克管中称取原料5,10,15,20-四(4-吡啶基)卟啉(104.6mg，0.16mmol)和4-溴甲基苯硼酸(350.5mg，1.6mmol)，用15ml干燥的dmf溶解，并将溶液在氮气保护下加热至80℃反应24h。然后真空浓缩，丙酮稀释，形成的沉淀物通过过滤收集并溶解在甲醇中。再次过滤，除去不溶性物质，滤液真空浓缩至干。通过从甲醇到丙酮的再沉淀纯化，甲醇：丙酮＝1：1.5，得到深紫色粉末190.4mg，产率为80.44％。1h nmr(dmso-d6,400mhz,298k):6.28(8h,s,arch2)，7.88、7.89、8.04、8.06(16h,m,arh)，9.07、9.08和9.70(16h,each d,arh in pyridyl)，9.25(8h,br s,β-h)。其1h nmr谱图见图1。
[0038]
实施例2叶内酯-芳基硼酸取代的阳离子卟啉传感阵列在检测葡萄糖中的应用
[0039]
以葡萄糖为例介绍三组分传感阵列baap的结构参见图2。
[0040]
向离心管中分别加入3ml的10mm pbs(ph＝6.2、7.4、7.8)缓冲溶液，各加入30μl baap储备液和30μl七叶内酯储备液，构成荧光传感阵列。再加入30μl 1m的葡萄糖，摇匀。将96孔板的每4行
×
3列划分为一组，在每一组第1至3列依次加入200μl baap-1、baap-2、baap-3与葡萄糖反应后的混合溶液，测试每个孔的荧光强度。baap的浓度为18μm，七叶内酯浓度为10μm，pbs缓冲溶液的ph分别为6.2、7.4、7.8，改变离心管中加入葡萄糖的浓度和体积来改变葡萄糖的测试浓度。
[0041]
实施例3七叶内酯-芳基硼酸取代的阳离子卟啉传感阵列的制备
[0042]
卟啉荧光传感阵列是由三个相应的传感单元构成，所述三个相应的传感单元是将七叶内酯和芳基硼酸取代的阳离子卟啉baap在不同ph的乙醇/pbs缓冲溶液中混合获得。所得传感阵列可以用于水样、血清等环境中常见单糖的种类鉴别和含量检测。本方案所使用的芳基硼酸取代的阳离子卟啉为新合成化合物。
[0043]
一、七叶内酯-芳基硼酸取代的阳离子卟啉荧光传感阵列的制备方法如下：
[0044]
1、配制baap储备液a：将26.6mg卟啉化合物baap溶于10ml的dmf中，得浓度为1.8mm的baap储备液a；
[0045]
2、配制七叶内酯储备液b：称取2mg七叶内酯溶于10ml的dmf中，得浓度为1mm的储备液b；
[0046]
3、baap-1传感单元制备：向5ml离心管中加入3ml乙醇/pbs＝3/1(10mm,ph 6.2)混合溶液，加入30μl储备液a和30μl储备液b，得baap-1传感单元；
[0047]
4、baap-2传感单元制备：向5ml离心管中加入3ml乙醇/pbs＝3/1(10mm,ph 7.4)混合溶液，加入30μl储备液a和30μl储备液b，得baap-2传感单元；
[0048]
5、baap-3传感单元制备：向5ml离心管中加入3ml乙醇/pbs＝3/1(10mm,ph 7.8)混合溶液，加入30μl储备液a和30μl储备液b，得baap-3传感单元；
[0049]
6、所述七叶内酯-芳基硼酸取代的阳离子卟啉传感阵列即由baap-1、baap-2、baap-3三个传感单元组成。
[0050]
二、已知待测样品储备液配制：
[0051]
1、配制葡萄糖(glu)储备液c：称取360.0mg的葡萄糖溶解到2ml的10mm pbs(ph 7.4)缓冲溶液中，得到浓度为1m的葡萄糖储备液c；
[0052]
2、配制果糖(fru)储备液d：称取360.0mg的果糖溶解到2ml的10mm pbs(ph 7.4)缓冲溶液中，得到浓度为1m的果糖储备液d；
[0053]
3、配制d-葡萄糖-6-磷酸二钠盐(g6p)储备液e：称取608.2mg的d-葡萄糖-6-磷酸二钠盐溶解到2ml的10mm pbs(ph 7.4)缓冲溶液中，得到浓度为1m的d-葡萄糖-6-磷酸二钠盐储备液e；
[0054]
4、配制d-果糖-6-磷酸二钠盐(f6p)储备液f：称取608.2mg的d-果糖-6-磷酸二钠盐溶解到2ml的10mm pbs(ph 7.4)缓冲溶液中，得到浓度为1m的d-果糖-6-磷酸二钠盐储备液f；
[0055]
5、配制d-果糖-1,6-二磷酸三钠盐(f2p)储备液g：称取812.0mg的d-果糖-1,6-二磷酸三钠盐溶解到2ml的10mm pbs(ph 7.4)缓冲溶液中，得到浓度为1m的d-果糖-1,6-二磷酸三钠盐储备液g；
[0056]
6、配制半乳糖(gal)储备液h：称取360.0mg的半乳糖溶解到2ml的10mm pbs(ph 7.4)缓冲溶液中，得到浓度为1m的半乳糖储备液h；
[0057]
7、配制甘露糖(man)储备液i：称取360.0mg的甘露糖溶解到2ml的10mm pbs(ph 7.4)缓冲溶液中，得到浓度为1m的甘露糖储备液i。
[0058]
三、建立传感阵列训练矩阵：
[0059]
1、向三个分别含有3mlbaap-1、baap-2、baap-3传感单元的离心管中各自加入30μl储备液c，摇匀得三组葡萄糖待测样品(葡萄糖浓度10mm)；
[0060]
2、在96孔板上任意选取一个4行
×
3列的区域，在该区域内的第1至3列依次分别移取200μl上述三组葡萄糖待测样品；
[0061]
3、使用酶标仪检测96孔板上述区域每个孔中溶液的荧光强度(激发波长390nm，检测波长为465nm和652nm)，得到葡萄糖样品的训练数据矩阵；
[0062]
4、重复以上步骤，使用步骤三中的储备液d、4e、4f、4g、4h、4i，分别得到果糖、d-葡萄糖-6-磷酸二钠盐、d-果糖-6-磷酸二钠盐、d-果糖-1,6-二磷酸三钠盐、半乳糖、甘露糖的训练数据矩阵；
[0063]
5、改变步骤1中加入储备液的体积，并重复1-4的步骤，测试得到浓度分别为0.5mm、1.0mm、4.0mm、20.0mm的单糖训练矩阵。
[0064]
四、训练矩阵数据处理
[0065]
将步骤四中所得已知糖胺聚糖样品训练矩阵数据通过线性判别分析进行数据处理，获得对浓度为0.5mm、1mm、4mm、10mm、20mm单糖的鉴别。
[0066]
五、鉴别未知的单糖
[0067]
1、将未知的单糖样品配置储备液j，浓度为1m；
[0068]
2、向三个分别含有3mlbaap-1、baap-2、baap-3传感单元的离心管中各自加入30μl储备液j，摇匀得三组未知待测样品(样品浓度10mm)；
[0069]
3、在96孔板上任意选取一个4行
×
3列的区域，在该区域内的第1至3列依次分别移取200μl上述三组未知样待测样品；
[0070]
4、使用酶标仪检测96孔板上述区域每个孔中溶液的荧光强度(激发波长390nm，检测波长为465nm和652nm)，得到未知样品的数据，作为线性判别分析的测试数据矩阵；
[0071]
5、将步骤四中的已知样品数据作为训练数据矩阵，与未知样品的测试数据矩阵进
行线性判别分析，得到对未知样品的鉴别结果。
[0072]
实施例4七叶内酯-芳基硼酸取代的阳离子卟啉传感阵列的应用
[0073]
1、水样中糖胺聚糖的检测
‑‑
不同浓度的单糖：
[0074]
1)配制0.05m、0.1m、0.4m、1m、2m的单糖储备液：glc、fru、g6p、f6p、f2p、gal和man；
[0075]
2)配制储备液a和b：将将卟啉化合物baap溶于dmf中，得浓度为1.8mm的baap储备液a；将七叶内酯溶于dmf中，得浓度为1mm的储备液b；
[0076]
3)向离心管中分别加入3ml的10mm pbs(ph＝6.2、7.4、7.8)缓冲溶液，各加入30μl上述储备液a和30μl储备液b，构成荧光传感阵列。再分别加入30μl含血清不同浓度的单糖，摇匀；
[0077]
4)将96孔板的每4行
×
3列划分为一组，在每一组第1至3列依次加入200μl步骤3反应后的混合溶液；。用酶标仪测得96孔板每个孔的荧光强度，用origin进行线性判别分析，可有效识别不同浓度的7种单糖(图3)。
[0078]
从图3可以看出，不同单糖在分析后被归属到各自的簇中，且相互分开，没有明显的交叉和重叠，由此说明不同单糖可以被很好地区分，最低有效区分浓度为0.5mm。
[0079]
2、血清环境中单糖的检测：
[0080]
1)储备液的配制：配制0.05m、0.1m、0.4m、1m、2m的含5％血清的单糖储备液：glc、fru、g6p、f6p、f2p、gal和man；
[0081]
2)向离心管中分别加入3ml的10mm pbs(ph＝6.2、7.4、7.8)缓冲溶液，各加入30μl上述储备液a和30μl储备液b，构成荧光传感阵列。再分别加入30μl含血清不同浓度的单糖，摇匀；
[0082]
3)将96孔板的每4行
×
3列划分为一组，在每一组第1至3列依次加入200μl步骤2反应后的混合溶液。用酶标仪测得96孔板每个孔的荧光强度，用origin进行线性判别分析或主成分分析，可有效区分血清中的单糖(图4)。