一株促进采后马铃薯块茎愈伤的根癌农杆菌

1.本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株促进采后马铃薯块茎愈伤的根癌农杆菌。


背景技术：

2.马铃薯(solanum tuberosum l.)是重要的粮菜兼用的农作物，块茎富含淀粉、维生素和矿物质，营养价值高，养活了地球上约10亿人口。全球有超过150个国家和地区均可栽培马铃薯。我国是马铃薯的生产大国，随着马铃薯种植面积的不断扩大，马铃薯在我国农业生产中占有越来越重要的地位。然而，马铃薯块茎表皮脆嫩，采收及采后贮运过程极易受到机械损伤，这些伤口使块茎组织容易失水，且成为病原菌入侵块茎的主要通道，导致块茎贮藏期品质下降，腐烂严重。
3.虽然马铃薯块茎表皮机械损伤后能够自然愈合，但是所需时间较长，在较长时间的伤口自我愈合过程中，病菌侵染块茎的概率增加，使采后腐烂率增加。同时在商业生产中，马铃薯采后需要尽快入库贮藏，减少周转所需的场所及搬运的人工，因此导致采后缺乏自我愈伤的条件，愈伤效果较差，增加了贮藏期烂窖的风险。块茎表皮自我愈伤速度慢的缺陷极大影响了马铃薯块茎的采收及采后贮藏和运输的管理。尽管已有一些利用高温或化学药剂处理可促进马铃薯块茎受伤部位愈伤的次生周皮生成的报道，然而过高的温度易增加采后块茎的生理代谢加速品质劣变，化学药物处理会伴随药物残留的问题。因此，生物源促愈剂的开发对解决马铃薯产业发展中块茎自然愈伤慢的问题具有相当大的优势。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中的问题，本发明提供了一株促进采后马铃薯块茎愈伤速度的根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens菌株。
5.根癌农杆菌是可侵染双子叶植物的农杆菌，由于可通过t-dna的转移，整合入植物组织中，并诱导产生植物生长素和细胞分裂素，从而导致细胞生长加快。其广泛存在于土壤中，只有少数具有致病力，一般被应用于植物转基因工程中，但本技术发明人意外发现，从马铃薯块茎伤口处分离的根癌农杆菌，可加快马铃薯块茎采后次生周皮的形成和加厚。
6.本发明提供一株促进采后马铃薯块茎愈伤的根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no：24362。
7.本发明还提供促进采后马铃薯块茎愈伤的根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens菌液，是将上述的根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens菌株扩大培养得到的。
8.作为优选，所述菌液的制备方法为：将根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens菌株接种于培养基中，于37
±
1℃，摇床培养。
9.作为优选，所述培养基为：蛋白胨5g/l，酵母浸粉1g/l，nacl 5g/l，ph 7.0。
10.本发明还提供上述的根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens菌株或根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens菌液在制备促进采后马铃薯块茎愈伤的产品中的应用。
11.作为优选，所述促进采后马铃薯块茎愈伤具体为加快马铃薯块茎采后次生周皮的形成和加厚。
12.本发明还提供一种促进采后马铃薯块茎愈伤的方法，是将上述的根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens菌株或根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens菌液喷施到损伤的或刚采收的新鲜马铃薯块茎表面，晾干后室温黑暗条件下保存。
13.在生产实践中，一般选择将根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens菌液直接喷施到刚采收的所有新鲜马铃薯块茎表面，晾干后室温黑暗条件下保存。由于采收和运输马铃薯时都是大批量操作，相比于将其中的损伤马铃薯块茎挑选出，再单独喷施损伤的马铃薯块茎，直接将根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens菌液喷施到所有新鲜马铃薯块茎表面，处理效率会更高。
14.本发明还提供一种针对马铃薯的生物源促愈剂，其有效成分包括上述的根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens菌株或根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens菌液。
15.本发明所涉及的根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens菌株，分离自愈伤的马铃薯组织，具有繁殖快、菌种容易收集、易于采后块茎的处理、加速块茎愈伤表皮封闭层(即次生周皮，次生周皮主要由木质素、聚酚软木脂和聚酯软木脂的细胞层组成)的生成速度，从而降低了块茎的重量损失速度(见图2)和镰刀菌侵染病斑扩展程度(见图3)。
16.本发明在马铃薯块茎采后24h内进行根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens菌悬液的喷雾处理：将采收后的马铃薯块茎冲洗，用次氯酸钠浸泡消毒，去离子水冲洗晾干；将目标菌悬液均匀喷洒到人工损伤马铃薯块茎表面，自然晾干后装入打孔的保鲜袋中，室温、黑暗条件下进行愈伤。本发明所用的根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens，是分离自受损伤马铃薯块茎自然愈合的表皮，未经基因改造，经鉴定属于野生型根癌农杆菌，可促进马铃薯块茎采后次生周皮的形成，加速愈伤过程。本发明可解决马铃薯块茎采后表皮伤口自然修复所需时间长，而引起的愈伤速度慢的问题。
附图说明
17.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
18.图1为本发明根癌农杆菌菌株的菌落形态图。
19.图2为本发明菌株对马铃薯块茎愈伤期间失重率的影响。
20.图3为本发明菌株对马铃薯块茎愈伤期间接骨木镰刀菌引起的病斑直径的影响。a为愈伤7天的块茎接种后的病斑直径；b为愈伤14天的块茎接种后的病斑直径；c为病斑直径抑制率。
21.图4为本发明菌株对马铃薯块茎愈伤期间聚酚软木脂(spp)的沉积(图a)及细胞层数(图b)的影响。
22.图5为本发明菌株对马铃薯块茎愈伤期间聚酯软木脂(spa)的沉积(图a)及细胞层数(图b)的影响。
具体实施方式
23.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
24.实施例1
25.本发明中的根癌农杆菌菌株从甘肃省定西市渭源县会川镇马铃薯通风库中贮藏的损伤块茎表皮中筛选得到，分类命名为根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens，于2022年1月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏单位地址为，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号cgmcc no：24362。
26.根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens的筛选方法是：采集甘肃省定西市渭源县会川镇通风库中贮藏的块茎，选择表皮损伤且经过自然愈伤的块茎，装入保鲜袋中，4℃的低温条件下运至实验室后，用自来水清洗，次氯酸钠消毒后自然晾干，无菌条件下用刀片削去损伤表皮，取皮下1mm～2mm块茎组织，并切成约1mm2小块，称取1g于9ml无菌水中稀释到10-3
～10-7
cells/ml，吸取1ml涂布于lb培养基中，37℃恒温培养，选择单菌落进一步进行划线分离，直到分离得到纯菌种后进行分子生物学鉴定，其中一株为根癌农杆菌。
27.其中，lb培养基的组成：胰蛋白胨(蛋白胨)10g/l，酵母提取物(酵母粉)5g/l，nacl 5g/l，ph 7.0。121℃25min灭菌后备用。
28.本发明的根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens具有以下生物学特性：
29.1.形态特征：菌株革兰氏染色结果为阴性，杆状，无芽孢，有荚膜。
30.2.培养特征：菌株在lb培养基平板上37℃恒温培养24h，菌落浅黄色，圆形、凸起、表面光滑边缘整齐。
31.3.遗传学特征(菌株16srrna序列)：本发明测了菌株的16srrna序列，如下，全长为1406bp。
32.ggttagctgcctccttgcggttagcgcactaccttcgggtaaaaccaactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcagcatgctgatctgcgattactagcgattccaacttcatgcactcgagttgcagagtgcaatccgaactgagatggcttttggagattagctcgacatcgctgtctcgctgcccactgtcaccaccattgtagcacgtgtgtagcccagcccgtaagggccatgaggacttgacgtcatccccaccttcctctcggcttatcaccggcagtccccttagagtgcccaactaaatgctggcaactaagggcgagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgttctggggccagcctaactgaaggacaatgtctccactgcccaaaccccgaatgtcaagagctggtaaggttctgcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttttaatcttgcgaccgtactccccaggcggaatgtttaatgcgttagctgcgccaccgaacagtatactgcccgacggctaacattcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctcagcgtcagtaatggaccagtaagccgccttcgccactggtgttcctccgaatatctacgaatttcacctctacactcggaattccacttacctcttccatactcaagatacccagtatcaaaggcagttccagagttgagctctgggatttcacccctgacttaaatatccgcctacgtgcgctttacgcccagtaattccgaacaacgctagcccccttcgtattaccgcggctgctggcacgaagttagccggggcttcttctccggataccgtcattatcttctccggtgaaagagctttacaaccctaaggccttcatcactcacgcggcatggctggatcaggcttgcgcccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggctgatcatcctctcagaccagctatggatcgtcgccttggtaggcctttaccccaccaactagctaatccaacg
cgggccaatccttccccgataaatctttcccccgtagggcgtatgcggtattaattccagtttcccggagctattccgcaggaaagggtatgttcccacgcgttactcacccgtctgccactccccttgcggggcgttcgacttgcatgtgttaagcctgcccgccagcgttcgttctgagccaggattcaaactcta。
33.实施例2本发明的根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens cgmcc no：24362促进马铃薯块茎愈伤的性能实验
34.一、根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens cgmcc no：24362促进马铃薯块茎愈伤
35.根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens cgmcc no：24362菌悬液的制备：在250ml三角瓶中装100ml种子培养基，接种一环根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens，37℃、摇床转速为180r/min的条件下振荡培养24h得到种子液，在4℃、8000r/min离心10min，得到的沉淀为菌体，用无菌水重悬收集的菌体，制备成107cells/ml浓度的菌悬液，用喷雾器进行喷施。
36.其中，种子培养基组成：蛋白胨5g/l，酵母浸粉1g/l，nacl 5g/l，ph 7.0。
37.喷雾器：电动喷雾器或手动喷雾器，雾化液滴的颗粒约为5μm～15μm。
38.马铃薯块茎处理方法：采用“大西洋”马铃薯品种(或甘肃地产马铃薯品种)，将马铃薯块茎先用自来水冲洗，再用体积浓度为0.1％的次氯酸钠浸泡消毒10min，最后用无菌水冲洗晾干；用刮皮刀在块茎浅层表皮进行人工损伤，模拟采后形成的伤口。生产中建议在块茎采后24h内进行处理。此次实验在块茎损伤后立即进行喷雾处理。实验组用无菌的喷雾器将制备得到的根癌农杆菌agrobacterium tumefaciens cgmcc no：24362菌悬液均匀喷洒到马铃薯块茎伤口表面，待自然风干后装入打孔的保鲜盒中，在室温黑暗条件下进行愈伤。以不加菌悬液的无菌水喷洒处理作为对照处理。
39.二、马铃薯块茎愈伤期间失重率的测定：
40.采用差量法测定贮藏中马铃薯块茎的失重率。无菌水和菌液分别喷施处理后的马铃薯块茎置于室温黑暗条件下愈伤，分别在愈伤3天、愈伤5天、愈伤7天和愈伤14天测定块茎重量，根据下列公式计算愈伤过程中的失重率。试验重复3次。
41.失重率的计算：
42.失重率(％)＝[(w
1-w2)/w1]
×
100
[0043]
式中w1为愈伤前块茎的重量(g)；
[0044]
w2为愈伤后块茎的重量(g)。
[0045]
经测量，马铃薯块茎在愈伤后测量点的时间，根癌农杆菌处理组马铃薯块茎的失重率均显著低于无菌水处理的对照组的失重率。约从愈伤后第3天至愈伤后第14天，根癌农杆菌处理组马铃薯块茎失重率约低于对照组块茎失重率的32％～49％。
[0046]
三、马铃薯块茎愈伤期间病斑直径的测定：
[0047]
分别在马铃薯块茎愈伤7d和14d，接种接骨木镰刀菌(fusarium sambucinum)的孢子悬浮液，孢子悬浮液的浓度为107cells/ml，之后将马铃薯块茎放入保鲜盒于黑暗室温条件下保存，接种后每天定点利用十字交叉法测量马铃薯块茎损伤部位菌落的直径。经测量，马铃薯块茎经过7d和14d的愈伤后，与对照相比，根癌农杆菌处理降低了马铃薯块茎接骨木镰刀菌侵染的速度，病斑直径显著低于对照处理组病斑直径。
[0048]
病斑直径抑制率的计算：
[0049]
病斑直径抑制率(％)＝[(d
ck-d
at
)/d
ck
]
×
100
[0050]
式中d
ck
为无菌水处理的对照组病斑直径(mm)；
[0051]dat
为根癌农杆菌处理组病斑直径(mm)。
[0052]
经测量，马铃薯块茎经过7d的愈伤后，与对照相比，根癌农杆菌处理的块茎对接骨木镰刀菌侵染引起的病斑直径的抑制率可高达35％；马铃薯块茎块茎经过14d的愈伤后，与对照相比，根癌农杆菌处理的马铃薯块茎块茎对接骨木镰刀菌侵染引起的病斑直径的抑制率可高达31％。
[0053]
四、马铃薯损伤块茎表面周皮中聚酚软木脂spp的染色观察及细胞层厚度的测定：
[0054]
分别取愈伤3d、5d、9d、12d的马铃薯块茎，用不锈钢刀片垂直于伤口表面将伤口组织切成薄片(长宽各为1cm左右，厚0.2～0.3mm)。首先用无菌水冲洗6～8遍洗去淀粉，用0.1％小檗碱染色45min后，用无菌水冲洗2～3遍，75％乙醇冲洗2～3遍，再用95％乙醇冲洗1～2遍，脱去染料，之后用0.25％甲苯胺蓝进行复染1.5min，最后用无菌水和75％乙醇冲洗去染料，spp即被染色，在显微镜下荧光观察拍照。采用is capture图像软件进行spp细胞层厚度的测量。
[0055]
经测量，根癌农杆菌处理后，马铃薯块茎损伤表皮spp的生成速度较无菌水处理的对照快，细胞层厚度从愈伤后第9d即表现出统计学意义的显著差异。
[0056]
五、马铃薯损伤块茎表面周皮中聚酯软木脂spa的染色观察及细胞层厚度的测定：
[0057]
分别取愈伤3d、5d、9d、12d的马铃薯块茎，用不锈钢刀片垂直于伤口表面将伤口组织切成薄片(长宽各为1cm左右，厚0.2～0.3mm)。首先用无菌水冲洗6～8遍洗去淀粉，先用0.05％甲苯胺蓝染色45min后洗去染料，再用无菌水冲洗2～3遍，75％乙醇冲洗2～3遍，再用95％乙醇冲洗1～2遍，脱去染料。随后用1％中性红进行复染，最后用无菌水和75％乙醇洗去染料，spa就可被染色，在荧光显微镜下观察拍照。采用is capture图像软件进行spa细胞层厚度的测量。
[0058]
经测量，根癌农杆菌处理后，马铃薯块茎损伤表皮spa的生成速度较无菌水处理的对照快，细胞层厚度从愈伤后第3d即表现出统计学意义的显著差异。
[0059]
由spp和spa的积累情况可得出结论，根癌农杆菌处理后，马铃薯块茎表面周皮生成速度可加快3～5天，促进了马铃薯块茎的愈伤。
[0060]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。