一种用于大肠杆菌DH5α感受态细胞的冻干保护剂及其使用方法与应用

一种用于大肠杆菌dh5
α
感受态细胞的冻干保护剂及其使用方法与应用
技术领域
1.本发明涉及菌株的冻存和质粒转化技术领域，特别是涉及一种用于大肠杆菌dh5α感受态细胞的冻干保护剂及其使用方法与应用。


背景技术：

2.将外源质粒dna转化至菌株细胞以期获得克隆载体或表达产物的操作是基因工程常规的实验技术手段。这种分子克隆的技术在基础研究、生产研发等领域有着广泛的应用。然而，这一技术至19世纪70年代以来，其方法本身基本没有较大的改进，作为一种常规的分子生物学的技术手段一直沿用至今。其基本的实验流程包括了菌株感受态细胞的制备、感受态细胞的保藏、质粒转化及其鉴定等实验步骤。由于其技术原理清晰、实验操作成熟，也催生了一大批的生物试剂公司从事常见菌株的感受态细胞生产工作，并向市场推出了可直接用于转化的感受态细胞冻存产品。这些感受态细胞的生产企业中不乏国内外的知名生物企业，例如：全式金、康为世纪、takara、thermo fisher等。这些超低温冷冻的感受态菌株一定程度上缩短了常规分子克隆的实验流程，是科研院所日常消耗量最大的生物试剂之一。
3.然而，目前市场上商品化的感受态细胞并不能完全解决在分子克隆实验中的痛点。一方面，液态冻存的感受态细胞保存时间较短，一般保藏时间在1个月左右，长期保存其转化效率会急剧下降。另一方面，液态冻存的感受态细胞保存条件较为严苛，需要保存在-80℃的超低温冰箱中，且整个运输的过程中需要包裹在干冰中，这无形之中增加了商品化感受态细胞的使用成本。大肠杆菌dh5α在分子克隆领域应用广泛，适用于常规的抗性标记载体的抗生素筛选，也可用于lacz标记载体的蓝白斑筛选，是大多数克隆质粒最常选择的宿主菌株。因此，研发一种能够适应较宽温度范围、保藏周期长、转化效率高的大肠杆菌dh5α感受态菌株保藏及转化方法成对于简化分子克隆实验流程意义重大。


技术实现要素：

4.为了解决上述现有技术中的不足，本发明的目的提供一种可以高效保藏大肠杆菌dh5α细胞的冻干保护剂配，同时提供了一种直接利用冻干的大肠杆菌dh5α细胞快速高效转化外源质粒的实验方法。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：
6.提供了一种用于大肠杆菌dh5α感受态细胞的冻干保护剂，其由聚乙二醇4000(peg4000)、脱脂奶粉、二甲基亚砜(dmso)及水组成，每100ml冻干保护剂中各物质的含量为：聚乙二醇4000 0.5～4g，脱脂奶粉10～25g，二甲基亚砜2～8ml，其余体积为水。
7.具体的，所述脱脂奶粉为自行配置，将鲜牛奶脱去脂肪再干燥而成，辐照灭菌制得，其纯度≥99.0％。
8.进一步的，每100ml冻干保护剂中各物质的含量为：聚乙二醇4000 2g，脱脂奶粉20g，二甲基亚砜4ml，其余体积为水。
9.具体的，配制时，所述peg4000及dmso组分在121℃下灭菌15min，所述脱脂奶粉水浴加热灭菌15min。
10.一种用于大肠杆菌dh5α感受态细胞的冻干保护剂的使用方法，包括以下步骤：
11.s1：挑取单克隆菌落接种于超氧化物歧化酶培养基中，进行菌株活化培养，将培养好的菌液进行第一次离心分离，得到菌体沉淀，轻柔冲洗菌体后二次离心分离，得到菌体沉淀；
12.s2：用大肠杆菌dh5α感受态细胞的冻干保护剂轻柔悬浮沉淀，并将悬浮后的菌体分装后冷冻，然后放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到冻干的大肠杆菌dh5α活性细胞，其中：冻干保护剂体积＝超氧化物歧化酶培养基体积/100。
13.进一步的，向冻干的大肠杆菌dh5α活性细胞中加入预冷后的复溶剂，冰浴10min，得到大肠杆菌dh5α感受态细胞，加入质粒10～100ng，置于冰20min，间隔5min轻轻混匀一次，42℃热激50～55s后冰浴5min，最后，加入sob培养基在37℃以150r/min恢复培养30min，其中，复溶剂体积＝冻干保护剂体积。
14.进一步的，步骤s1中，培养条件为25℃，150rpm/min，当od＝0.6时停止培养；第一次离心在4℃下以5000rpm离心10min；第二次离心以5000rpm离心10min；
15.步骤s2中，所述冷冻为-80℃冻存10～12h，干燥为冷冻干燥机中冷冻干燥4～6h。
16.进一步的，冲洗使用磷酸缓冲盐溶液(pbs缓冲溶液)冲洗。
17.进一步的，所述复溶剂中含0.05mol/l氯化钙和0.05mol/l氯化镁。
18.进一步的，所述质粒为puc18。
19.一种用于大肠杆菌dh5α感受态细胞的冻干保护剂在质粒转化中的应用。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
21.本发明首先通过系统的实验优化得到了一种可以高效保藏大肠杆菌的冻干保护剂，在此基础上，利用活性较高的冻干菌株直接制备感受态细胞，该方法极大地缩短了分子克隆的实验流程，且得到的冻干活性菌株适温性较广，可保存在-20℃至-80℃的温度环境中，有效降低了感受态细胞的运输和保藏成本。
附图说明
22.通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
23.图1为平板菌落计数结果柱状图；
24.图2为平板转化效果单克隆照片；
25.图3为平板中的单克隆菌落pcr结果；
26.图4为大肠杆菌dh5α感受态细胞老化速率对比柱状图。
具体实施方式
27.下面结合附图和实施例对本技术作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
28.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相
互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本技术。
29.实施例一
30.一种适用于大肠杆菌dh5α高活性菌株的冻干保护剂配方及其使用方法
31.1、大肠杆菌dh5α冻干保护剂的配置
32.本发明采用的冻干保护剂包括peg4000、dmso、脱脂奶粉。peg4000具有较高的纯度，其纯度≥99.0％；脱脂奶粉将鲜牛奶脱去脂肪再干燥而成，辐照灭菌制得，其纯度≥99.0％。为了优化不同组分配比对菌株冻存效果的影响，我们采用正交试验寻找出了最佳的保护剂配方。其中，在进行冻干保护剂的配置之前，需对各组分进行灭菌处理，peg4000和dmso组分在121℃灭菌15min，脱脂奶粉组分只能水浴加热灭菌15min。每100ml冻干保护剂中，正交试验组及组分配比见表1。
33.表1大肠杆菌dh5α冻干保护剂配比组分正交表
[0034][0035][0036]
2、活化后冻干大肠杆菌dh5α菌株
[0037]
挑取单克隆菌落接种于sod培养基中，进行菌株活化培养，培养条件为25℃，
150rpm/min，当od＝0.6时停止培养。将培养好的菌液分装至离心管，放入离心机中4℃5000rpm离心10min。弃上清液，用1mol/l的pbs缓冲溶液轻柔冲洗菌体，并重复冲洗一次。5000rpm离心10min获得菌体沉淀。
[0038]
用1ml的dh5α冻干保护剂轻柔悬浮沉淀。将悬浮后的菌体分装在1.5ml的ep管中，每管100μl。将分装后的菌液放置于-80℃冰箱冻存10～12h。最后，将样品放入冷冻干燥机中冷冻干燥4～6h，得到冻干的大肠杆菌dh5α活性细胞。
[0039]
3、外源质粒的快速转化
[0040]
向冻干的大肠杆菌dh5α中加入预冷后的复溶剂100μl，其中，复溶剂含0.05mol/l cacl2和0.05mol/l mgcl2，冰上静置10min，使冻干样品恢复液态。往样品中加入puc18质粒100ng进行转化，置于冰上20min，并每隔5min用枪头轻轻混匀一次，使质粒与菌体充分接触，提高转化效率。42℃热激50-55s，然后冰上冰浴5min，最后向ep管中加入500μl的sob培养基置摇床，以37℃，150rpm/min活化培养30min。
[0041]
4、转化后的培养及检测
[0042]
将步骤3中的菌体离心收集(8000rpm，1min)，用100μl sod培养基悬浮沉淀，然后将液体涂布在氨苄抗性筛选的lb平板上，放入培养箱中培养8～10h。最后，通过计数平板中单克隆的个数检测外源质粒的转化效果。
[0043]
平板菌落计数结果柱状图见图1，平板转化效果单克隆照片见图2。实验结果显示：每100ml冻干保护剂中，各组分配比为peg4000 2g，脱脂奶粉20g，dmso 4ml时对菌体活性保藏效果最好。
[0044]
通过菌落pcr的方式检测单克隆的阳性率。菌落pcr引物为fw：5
’‑
agagcagattgtactgagag-3’，rv：5
’‑
tcgtatgttgtgtggaattg-3’。
[0045]
结果显示，如图3所示，平板中的单克隆的阳性率为100％。
[0046]
5、冻干大肠杆菌dh5α的老化检测
[0047]
利用最优保护剂(peg4000 2g，脱脂奶粉20g，dmso 4ml)作为试验组制备冻干大肠杆菌dh5α，同时利用传统方法制备大肠杆菌dh5α感受态细胞作为对照组。将上述感受态细胞同时放置于-20℃条件下，每隔1天取样一次，连续取样5次。通过puc18质粒转化实验检测大肠杆菌dh5α细胞的转化活性。如图4所示，结果显示，相较于传统方法获得的大肠杆菌dh5α感受态细胞，本方法获取的冻干大肠杆菌dh5α细胞即便在-20℃的温度环境中仍然可以保持相对较高的转化活性。
[0048]
从以上实验结果表明，本发明的保护剂配方能最大限度的保存大肠杆菌dh5α的生物学活性，可直接用于感受态细胞的制备，并具有较高的转化活性和阳性率，大大缩短了分子克隆的实验流程。同时，本专利方法获得的冻干活性细胞可短暂保存于-20℃中，极大缩减了感受态细胞的运输成本。
[0049]
本领域技术人员应当理解，本技术中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本技术中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。