特异性结合红霉素的新型单克隆抗体及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种特异性结合红霉素的新型单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.红霉素（erythromycin，又叫红霉素碱、红丝霉素、阿达霉素，cas号：114-07-8），分子式为c
37h67
no
13
，属于大环内酯类抗生素。红霉素在临床主要应用于链球菌引起的扁桃体炎、猩红热、白喉及淋病、李斯特菌病、肺炎链球菌下呼吸道感染。红霉素是我国一种常用的兽药，在畜禽上主要用于抗细菌及支原体的感染，其在动物体内代谢时间较长，过量使用会导致动物体内的药物残留。人在使用红霉素后，能引起胃肠道反应和过敏反应，严重将引起肝脏损伤，对人类的健康造成严重威胁。
3.目前世界各国规定大环内酯类抗生素在动物性食品中的允许残留最大值为40-1500 μg/kg。我国《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》 gb31650-2019规定了红霉素a在鸡和火鸡的肌肉、脂肪、肝、肾的最大残留量为100 μg/kg，在鸡蛋的最大残留量为50 μg/kg，在动物源性奶的最大残留量为40 μg/kg。
4.目前红霉素检测多采用高效液相色谱法（hplc）、液相色谱与质谱联用法（lcms）、气质联用法（gc-ms）等。仪器法进行定量分析具有较低的检测限，但是仪器操作复杂，费用昂贵，无法达到现场规模快速检测的要求。免疫分析方法具有成本低、效率高、灵敏度高、对技术人员相对要求低等优点，适用于大量样品的快速检测。


技术实现要素：

5.为此，本发明提供特异性结合红霉素的新型单克隆抗体及其应用。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明实施例提供特异性结合红霉素的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区，包括seq id no:1所示的重链cdr1；seq id no:2所示的重链cdr2；和seq id no:3所示的重链cdr3；所述轻链可变区，包括seq id no:4所示的轻链cdr1；seq id no:5所示的轻链cdr2；和seq id no:6所示的轻链cdr3。
7.本发明的另一方面还提供编码所述的单克隆抗体的基因。
8.包含上述所述编码所述单克隆抗体的基因的表达载体，也属于本发明的保护范围。
9.本发明又一方面还提供包含上述所述表达载体的转化体。
10.本发明还提供一种红霉素检测试剂盒，其包含上述所述的单克隆抗体。
11.本发明的一个实施例中，所述试剂盒为胶体金检测试剂盒，所述胶体金检测试剂盒的结合物释放垫上喷涂有胶体金标记所述的单克隆抗体。
12.本发明具有如下优点：本发明提供一种对红霉素具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体，为间接竞争 elisa 试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。
13.试验证明：本发明的红霉素单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高等特点，可作为酶联免疫检测和胶体金免疫检测的原料。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
15.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
16.图1为本发明实施例提供的红霉素单克隆抗体轻链基因序列同源性比对图；图2为本发明实施例提供的红霉素单克隆抗体重链基因序列同源性比对图；图3为本发明实施例提供的红霉素单克隆抗体轻链氨基酸序列同源性比对图；图4为本发明实施例提供的红霉素单克隆抗体重链氨基酸序列同源性比对图；图5为本发明实施例提供的采用间接竞争elisa方法检测红霉素单克隆抗体灵敏度和特异性的rida soft四参数法r2曲线图；图6为本发明实施例提供的采用间接竞争elisa方法检测红霉素单克隆抗体灵敏度和特异性的rida soft四参数法ic
50
曲线图；图7为本发明实施例提供的检测红霉素试纸条的结构示意图；图中：100-样品吸收垫；200-结合物释放垫；300-硝酸纤维素膜；310-检测线；320-质控线；400-吸水垫；500-底板。
具体实施方式
17.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.实施例1本实施例提供一种红霉素单克隆抗体的制备方法，其包括以下步骤：1、初次免疫将红霉素人工抗原（红霉素人工抗原购自深圳市安提生物科技有限公司）采用弗氏完全佐剂进行乳化（1:1），皮下注射6周龄的balb/c小鼠，免疫剂量为500 μg/只；从首次免疫开始，每4周加强免疫一次，共加强免疫2次，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法与剂量同首次免疫；第2次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达
到1:10000以上时，进行1次冲击免疫，即腹腔注射免疫原溶液0.5ml，三天后取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆，得到并建立稳定分泌红霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
19.2、红霉素单克隆抗体的制备细胞复苏：取出红霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将balb/c小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.8 ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞8
×
105个/只，10天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到红霉素单克隆抗体。
20.实施例21、红霉素单克隆抗体的灵敏度和特异性的检测，采用间接竞争elisa方法检测单克隆灵敏度及特异性，结果见下表1所示。以红霉素各浓度(0，0.15，0.45，1.35，4.05，12.15 ng/ml)横坐标，以红霉素各浓度对应的od值为纵坐标，使用rida soft四参数法绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（ic
50
）。结果表明，曲线r2=0.9997，ic
50
=0.468ng/ml，如图5和图6所示。
21.表1 使用igg亚类检测试剂盒（美国 sigma公司）检测红霉素单克隆抗体的亚类，结果显示红霉素单克隆抗体为igm（κ）。
22.2、红霉素单克隆抗体轻链和重链可变区基因克隆（1）杂交瘤细胞培养及总rna提取用rpmi 1640完全培养基在37℃、5%二氧化碳培养杂交瘤细胞1
×
107。培养细胞总rna提取试剂盒试剂盒（购自天根）提取细胞总rna。
23.（2）cdna第一链的合成takara翻转录试剂盒（日本）合成cdna。
24.（3）基因扩增设计lambda链，kappa链，heavy链下游引物及上游通用引物。
25.引物：f:aagcagtggtatcaacgcagar
κ
:aacattgatgtctttggggtagaarλ
:aatcgtacacaccagtgtgtgggrh:agggatccagagttccaggt以cdna第一链为模板进行pcr，反应体系50 μl。
26.菌落pcr反应体系：模板 3μl，dntps 1μl，上下游引物（10um）各2.5μl，5
×
pcr buffer 10μl，ddh2o 30.5μl，taq酶（5u/μl） 0.5μl。
27.菌落pcr反应条件为：98℃ 30s；98℃ 15s，64℃-58℃ 30s，每次下降0.5℃，直到58℃，循环10次；72℃ 30s；98℃ 15s，56℃ 30s，72℃30s，循环15次；72℃ 7min。
28.（4）pcr扩增产物的克隆和筛选pcr产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用pcr产物回收试剂盒（北京天根）回收抗体kappa链，lambda链和heavy链片段，用plb零背景快速克隆试剂盒（北京天根）将该片段插入plb载体中，转化至dh5α感受态细胞（氨苄抗性）中，筛选重组阳性克隆测序。pcr产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果显示lambda链未见条带，heavy链的核苷酸序列如seq id no:7所示，和kappa链的核苷酸序列如seq id no:8所示。
29.其中，特异性结合红霉素的单克隆抗体，重链可变区cdr1的氨基酸序列如seq id no:1所示；重链cdr2氨基酸序列如seq id no:2所示；重链cdr3氨基酸序列如seq id no:3所示。
30.轻链可变区，轻链可变区cdr1氨基酸序列如seq id no:4所示；轻链可变区cdr2氨基酸序列如seq id no:5所示；和轻链可变区cdr3的氨基酸序列seq id no:6所示。
31.（5）可变区氨基酸序列及同源性分析在ncbi数据库中进行比对分析，分析结果表明单克隆抗体轻链可变区基因序列与小鼠免疫球蛋白kappa链可变区mrna（sequence id:af466699.1）同源性最高，同源性为462/473，同源性百分比为98%，如图1所示。
32.单克隆抗体重链可变区基因序列与小鼠免疫球蛋白重链可变区mrna（sequence id:kp814002.1）同源性最高，同源性为285/294，同源性百分比为97%，如图2所示。
33.单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列与小鼠igm（κ）（sequence id:aag12167.1）同源性最高，同源性为151/157，同源性百分比为96%，如图3所示。
34.单克隆抗体重链可变区氨基酸序列与小鼠mcg114300（sequence id:edl18329.1）同源性最高，同源性为106/117，同源性百分比为91%，如图4所示。
35.编码单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列如seq id no:7所示，编码单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:8所示。
36.单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析结果表明，未发现与本发明相同的序列。此结果与使用igg亚类检测试剂盒（美国 sigma公司）鉴定红霉素单克隆抗体为igm（κ）相一致。
37.将重链可变区和轻链可变区序列，在https://www.novopro.cn/tools/cdr.html分析，得出其cdr区。
38.抗体重链cdr区；抗体重链cdr1的氨基酸序列如seq id no:1所示: iywie；抗体重链cdr2的氨基酸序列如seq id no:2所示: ellpgsgnahynekftd；抗体重链cdr3的氨基酸序列如seq id no:3所示：sgittdrewyfgv。
39.抗体轻链cdr1的氨基酸序列如seq id no:4所示；kasqnvgsnva；抗体轻链cdr2的
氨基酸序列如seq id no:5所示: sasyrys；抗体轻链cdr3的氨基酸序列如seq id no:6所示；qqynsfplt。
40.实施例3本实施例提供红霉素胶体金检测试剂盒，如图7所示，该红霉素胶体金检测试剂盒包括检测试纸条，该检测试纸条是由底板500、样品吸收垫100、结合物释放垫200、硝酸纤维素膜300、吸水垫400、卡壳组成；其中， 样品吸收垫100、结合物释放垫200、硝酸纤维素膜300、吸水垫400依次按顺序粘贴在ps底板500上；结合物释放垫200从起始端有1/4区域被样品吸收垫100覆盖，结合物释放垫200的末端与硝酸纤维素膜300的始端连接，硝酸纤维素膜300的末端与吸水垫400的始端相连，样品吸收垫100的始端与ps底板500的始端对齐，吸水垫400的末端与ps底板500的末端对齐。
41.硝酸纤维素膜300上有检测线310和质控线320，检测线t和质控线c均呈与试纸条的长相垂直的条状带；检测线310位于靠近结合物释放垫200的末端的一侧；质控线320位于远离结合物释放垫200的末端的一侧。将试纸条用机器切成4.05 mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，2～30℃条件下可保存12个月。
42.该红霉素胶体金检测试纸条的制备方法主要包括以下步骤：1)制备具有红霉素人工抗原的检测线和包被有羊抗鼠抗体的质控线的硝酸纤维素膜；2)制备喷涂有胶体金标记的红霉素单克隆抗体的结合物释放垫；3)将样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在底板上。
43.4）装入卡壳中。
44.试纸卡检测限的界定：使用完全不含有红霉素的羊奶为阴性样本，配制待测样本1（红霉素4 ppb），待测样本2（红霉素2 ppb），待测样本3（红霉素0 ppb）。用微量移液器吸取100
ꢀµ
l待测样本溶液于卡壳孔中，室温反应10分钟后即可判读结果，不超过20分钟。
45.结果判定：阴性(－)：c线和t线均显色，t线显色远比c线强，表示样本中不含红霉素或远低于检出限。
46.阳性(＋)：c线显色；t线显色与c线相同、t线显色比c线弱或者t线不显色，均表示样本红霉素浓度等于或高于检出限。
47.无效：未出现c线，表明不正确的操作过程或试纸卡已变质失效。
48.结果显示：待测样本1（红霉素4ppb）为阳性，待测样本2（红霉素2ppb）为阴性，待测样本3（红霉素0 ppb）为阴性。此结果表明试纸卡检测限为4 ppb。
49.本试纸卡的灵敏度优于cn103777015a报道的10 μg/l 。
50.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。