一种同时检测3种甘薯病毒的多重检测方法及试剂盒与流程

1.本发明涉及甘薯病毒检测技术领域，尤其是涉及一种同时检测3种甘薯病毒的多重检测方法及试剂盒。


背景技术：

2.公知的，甘薯是利用块根进行无性繁殖的植物，在栽培过程中极易受病毒的侵染，病毒侵染后对甘薯的产量和品质有很大影响；近年我国甘薯病毒发生率呈上升趋势，目前在广东、福建、江苏、四川、北京、山东等地均检测到有多种病毒的混合侵染现象，据报道中国每年因甘薯病毒造成的损失高达40亿元，甘薯病毒已经成为影响甘薯生产的重要限制因素之一；目前已经鉴定的甘薯病毒有甘薯羽状斑驳病毒（sweet potato feathery mottle virus，spfmv）、甘薯褪绿矮化病毒（sweet potato chlorotic stunt virus，spcsv）、甘薯潜隐病毒（sweet potato latent virus，splv）等；而经常出现的情况就是多种甘薯病毒的复合侵染，极大的影响了甘薯产量的提高，也直接制约了整个甘薯产业的整体发展；使用茎尖脱毒快繁法繁育甘薯试管苗，能最大程度减少初期甘薯病毒病的发生，诱导再生的“脱毒苗”需要经过严格的病毒检测，确认不带病毒后，才能后续供应给薯农种植，但脱毒的试管苗可能在田间种植阶段再次染上病毒病，检测甘薯病毒病的方法就显得尤为重要；但是目前进行病毒检测一个反应只能检测一种病毒，如果反应模板中含有两个以上的甘薯病毒，则需进行多次pcr，成本高且费时费力。


技术实现要素：

3.为了克服背景技术中不能同时检测两个以上的甘薯病毒的问题，本发明公开了一种同时检测3种甘薯病毒的多重检测方法及试剂盒。
4.为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种同时检测3种甘薯病毒的多重rt-pcr检测试剂盒，包括分别盛装有10
×
反应缓冲液1.5ml、taq酶（1u/μl）1.5ml、3种甘薯病毒的上游引物混合物sp-f(10μμ) 0.5 ml、3种甘薯病毒的下游引物混合物sp-r(10μμ) 0.5 ml和阳性标准品(15μg/ml)0.5 ml的离心管；3种甘薯病毒分别为甘薯褪绿矮化病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯潜隐病毒；3种甘薯病毒的上游引物和下游引物分别为：
①
甘薯褪绿矮化病毒 spcsv-f/r，上游引物spcsv-f为5'-cttacctcagaccagttagc-3'，下游引物spcsv-r为5'-cgttattgtagcctcaccag-3'；
②
甘薯羽状斑驳病毒 spfmv f/r，上游引物spfmv-f为5'-ggcagattatgacgcacttc-3'，下游引物spfmv-r为5'-gtgtgcctctccgtatcttc-3'；
③
甘薯潜隐病毒 splv f/r，上游引物splv-f为5'-ccaaggctacaaggagtcag-3'，
下游引物splv-r为5'-acatttccatccaaacccga-3'；所述阳性标准品为提取感染的甘薯病株rna，并分别进行反转录得cdna，利用3种甘薯病毒的cp基因全长引物分别进行pcr扩增，将扩增产物进行测序，得到的阳性样品的cp基因进行克隆载体的构建，并将所得3个重组载体质粒按1︰1︰1进行混合作为阳性标准品液。
5.优选的，所述10
×
反应缓冲液为tris-hcl 100mm、kcl 500mm和dntps 2.5mm。
6.优选的，所述试剂盒还包括阴性对照，该阴性对照为纯水或无病毒甘薯总rna。
7.一种同时检测3种甘薯病毒的多重检测方法，包括以下步骤：
①
用rna提取试剂盒(takara)提取待测样本总rna，并进行反转录得cdna；
②
pcr扩增；用权利要求1所述的3种甘薯病毒的上游引物和下游引物对待测样品cdna进行pcr扩增，其反应条件为94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，循环32次，最后72℃延伸5min；
③
取5μl步骤
②
的 pcr扩增产物在含5μg/ml嗅化乙啶(eb)的2%琼脂糖凝胶上电泳，恒压100v，20min后紫外透射反射仪上观察结果；
④
结果判定；当150bp处出现一条特异性核酸带，而阴性对照没有目的条带，说明样品中有甘薯褪绿矮化病毒（spcsv）侵染；当280bp处出现一条特异性核酸带，而阴性对照没有目的条带，说明样品中有甘薯羽状斑驳病毒（spfmv）侵染；当480bp处出现一条特异性核酸带，而阴性对照没有目的条带，说明样品中有甘薯潜隐病毒（splv）侵染。
8.由于采用如上所述的技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明公开的一种同时检测3种甘薯病毒的多重检测方法及试剂盒，可实现一次pcr反应同时检测3种甘薯病毒，减少操作次数，避免交叉污染，同时还减少试剂、引物、模板及耗材等的使用量，省时、省力、省成本；实验表明，该法能够快速、准确又简便和经济地从甘薯组织中同时检测这3种甘薯病毒，明确甘薯带毒情况，对尽早采取有效防治措施，控制病害在田间的发生、减少经济损失、抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义，同时为健康种苗的发展奠定重要的基础，为方便应用本发明，发明人还设计组装了相应试剂盒，以便在基层普及推广。
附图说明
9.图1为本发明检测甘薯褪绿矮化病毒（spcsv）cp基因的特异性扩增图；图2为本发明检测甘薯羽状斑驳病毒（spfmv）cp基因的特异性扩增图；图3为本发明检测甘薯潜隐病毒（splv）cp基因的特异性扩增图；图4为本发明检测甘薯羽状斑驳病毒（spfmv）、甘薯褪绿矮化病毒（spcsv）和甘薯潜隐病毒（splv）cp基因的特异性扩增图。
10.图1中m：dna marker
ꢀⅰ
。 marker；l：spcsv。
11.图2中m：dna marker
ꢀⅰ
。 marker；l：spfmv。
12.图3中m：dna marker
ꢀⅰ
。 marker；l：splv。
13.图4中m：dna marker
ꢀⅰ
。 marker；l：spcsv / spfmv /splv。
具体实施方式
14.通过下面的实施例可以详细的解释本发明，公开本发明的目的旨在保护本发明范围内的一切技术改进。
15.结合附图1～4，一种同时检测3种甘薯病毒的多重rt-pcr检测试剂盒，所述试剂盒包含6个1.5ml的离心管，分别装有2.5mm 的10
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反应缓冲液、1u/μl的 taq酶1.5ml、3种甘薯病毒的上游引物10μm、3种甘薯病毒的下游引物10μm、纯水1.5ml、15μg/ml的阳性标准品0.5ml；根据需要，所述10
×
反应缓冲液为tris-hcl 100mm、kcl 500mm和dntps；所述阳性标准品为利用所述3种甘薯病毒的cp基因全长引物分别进行pcr扩增，将扩增产物进行测序，得到的阳性样品的cp基因进行克隆载体的构建，并将所得三个重组载体质粒按1︰1︰1进行混合作为阳性标准品液；根据需要，所述试剂盒的阴性对照为纯水或无病毒甘薯总rna；3种甘薯病毒分别为甘薯褪绿矮化病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯潜隐病毒；3种甘薯病毒的上游引物和下游引物分别为：
①
甘薯褪绿矮化病毒 spcsv-f/r，上游引物spcsv-f为5'-cttacctcagaccagttagc-3'，下游引物spcsv-r为5'-cgttattgtagcctcaccag-3'；
②
甘薯羽状斑驳病毒 spfmv f/r，上游引物spfmv-f为5'-ggcagattatgacgcacttc-3'，下游引物spfmv-r为5'-gtgtgcctctccgtatcttc-3'；
③
甘薯潜隐病毒 splv f/r，上游引物splv-f为5'-ccaaggctacaaggagtcag-3'，下游引物splv-r为5'-acatttccatccaaacccga-3'；所述此试剂盒的三对引物是从genbank中获得甘薯羽状斑驳病毒（spfmv）、甘薯褪绿矮化病毒（spcsv）和甘薯潜隐病毒（splv）的基因序列，并以cp基因作为引物设计区，交由上海生工进行分别合成甘薯羽状斑驳病毒（spfmv）、甘薯褪绿矮化病毒（spcsv）和甘薯潜隐病毒（splv）的特异性引物；同时检测3种甘薯病毒的多重检测方法，包括以下步骤：
①
用rna提取试剂盒(takara)提取待测样本总rna，并进行反转录得cdna；
②
pcr扩增；用权利要求1所述的3种甘薯病毒的上游引物和下游引物对待测样品cdna进行pcr扩增，其反应体系包括2.5mm 的10
×
反应缓冲液、1u/μl的 taq酶1.5ml、3种甘薯病毒的上游引物10μm、3种甘薯病毒的下游引物10μm、纯水1.5，反应条件为94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，循环32次，最后72℃延伸5min；
③
取5μl步骤
②
的 pcr扩增产物在含5μg/ml嗅化乙啶(eb)的2%琼脂糖凝胶上电泳，恒压100v，20min后紫外透射反射仪上观察结果，将待测样品的产物与阳性标准品和阴性对照相比较，根据条带有无及条带大小判断待测样品是否含有这3种甘薯病毒；
④
结果判定；如图1所示，当150bp处出现一条特异性核酸带，说明样品中有甘薯褪绿矮化病毒（spcsv）侵染；如图2所示，当280bp处出现一条特异性核酸带，说明样品中有甘薯羽状斑驳病毒（spfmv）侵染；如图3所示，当480bp处出现一条特异性核酸带，说明样品中有甘薯潜隐病毒（splv）侵染；如图4所示，阴性对照扩增产物电泳后未见特异性核酸带；结果表明本发
明的多重检测方法能够有效检测出多种病毒复合感染的样品。
16.实施本发明所述的一种同时检测3种甘薯病毒的多重检测方法及试剂盒，可实现一次pcr反应同时检测3种甘薯病毒，减少操作次数，避免交叉污染，同时还减少试剂、引物、模板及耗材等的使用量，省时、省力、省成本。
17.本发明未详述部分为现有技术，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明；因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，旨在将落在等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。