一种利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法和应用与流程

1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法和应用。


背景技术：

2.羟基四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-5-羟基-4-嘧啶羧酸)是四氢嘧啶的衍生物，是一种极性、易溶、生理ph范围内不带电荷的小分子有机物，是嗜盐微生物为抵抗高盐环境代谢产生的一种相容性溶质。研究发现，羟基四氢嘧啶同样具有四氢嘧啶渗透调节功能，在高温、干燥、高渗、冷冻等不良环境中保护和稳定核酸、细胞膜、蛋白质等物质的功能，并且因为其吸水保水能力更强，对核酸、细胞膜、蛋白等的保护作用要优于四氢嘧啶和其他相容性溶质。目前羟基四氢嘧啶已经广泛应用于在化妆品、医药、基因工程等领域。
3.在化妆品领域，基于羟基四氢嘧啶的渗透保护功能，可以作为保湿剂添加在化妆品中，既能防止皮肤干燥和衰老，又能减少紫外线对皮肤的伤害；在医药领域，羟基四氢嘧啶不仅可以加入药物中用于神经系统疾病的治疗，还可以作为化疗过程中健康细胞的保护剂；在基因工程技术领域的应用，羟基四氢嘧啶可以提高双链dna的解链温度，因此可以作为聚合酶链式反应的增强剂。
4.由于嗜盐微生物中具有羟基四氢嘧啶的合成途径，常规多利用嗜盐微生物发酵生产羟基四氢嘧啶。其不足在于培养过程中需要高浓度的nacl来刺激菌体积累更多的产物，高浓度nacl对发酵设备腐蚀严重，且发酵废液对环境造成较大压力；其发酵工艺需要多次更换发酵液，容易导致污染且耗费人力物力；且积累羟基四氢嘧啶同时会积累四氢嘧啶，后期难于分离；目前报道的羟基四氢嘧啶生产方法均产量低，达不到羟基四氢嘧啶的工业生产要求。


技术实现要素：

5.针对现有嗜盐微生物发酵羟基四氢嘧啶时所需的高浓度nacl对发酵设备腐蚀严重及羟基四氢嘧啶产量低的技术问题，本发明提供一种利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法和应用。
6.第一方面，本发明提供一种利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法，所述基因工程菌由重组载体pbad-ectd导入出发菌株构建得到，所述出发菌株带有
△
arabad阿拉伯糖代谢缺陷性状。
7.进一步的，所述重组载体pbad-ectd是基因ectd经同源重组连入载体pbad-hisa后得到的，基因ectd为四氢嘧啶羟化酶基因，构建由四氢嘧啶到羟基四氢嘧啶合成通路。
8.进一步的，载体pbad-hisa的核苷酸序列如seq id no.1所示；
9.基因ectd的核苷酸序列如seq id no.2所示；
10.四氢嘧啶羟化酶ectd的氨基酸序列如seq id no.3所示。
11.进一步的，所述出发菌株可选择大肠杆菌bw25113，基因型为(rrnb3
△
lacz4787hsdr514
△
(arabad)567
△
(rhabad)568rph-1)。
12.第二方面，本发明提供一种采用上述构建方法得到的基因工程菌，所述基因工程菌为大肠埃希氏菌(escherichia coli)frd-ect-1，已于2022年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.24235。
13.第三方面，本发明提供一种上述构建方法得到的基因工程菌在利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶上的应用。
14.进一步的，所述基因工程菌利用四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶的方法包括如下步骤：
15.(1)菌株活化：在超净工作台用接种环蘸取菌液，在固体斜面活化培养基中划线，放置于34-37℃培养箱中培养12-16小时；
16.所述固体斜面活化培养基成分为：酵母粉2.5-10g/l，蛋白胨5-15g/l，氯化钠5-15g/l，琼脂粉15-20g/l，其余为去离子水，调节ph值为7.2；
17.(2)一级种子培养：在超净工作台用接种环刮取一环菌体，接种到装有30ml种子培养基的500ml三角瓶中，用八层纱布封口，在34-37℃，200-250r/min的条件下振荡培养过夜；
18.所述种子培养基成分为：酵母粉9-15g/l，蛋白胨18-30g/l，甘油3-5g/l，磷酸二氢钾1.5-5g/l，磷酸氢二钾10-20g/l，其余为去离子水，调节ph值为7.2；
19.(3)二级种子培养：按1％接种量转移一级种子到装有100ml种子培养基的1000ml三角瓶中，用八层纱布封口，在34-37℃，200-250r/min的条件下振荡培养5-8小时，od600生长至1.8-2.0；
20.(4)发酵：将二级种子液按8％-15％接种量接种到新鲜的发酵培养基中，开始发酵，发酵过程中控制ph值在6.5-7.5，温度控制在37-24℃，将溶氧维持在20％-40％；当培养基中的碳源消耗完，溶氧开始上升时，流补50％(m/v)的葡萄糖溶液，控制糖浓度在0.1-5g/l，当od值达到10-15，降低培养温度至24-32℃，加入l-阿拉伯糖，继续发酵，发酵周期为12-16小时；
21.所述发酵培养基成分为：酵母粉2.5-10g/l，蛋白胨5-15g/l，硫酸铵4-10g/l，甘油0-10g/l，蔗糖0-10g/l，葡萄糖0-10g/l，磷酸二氢钾1.5-5g/l，磷酸氢二钾10-20g/l，硫酸镁0.5-2g/l，硫酸亚铁10-200mg/l，硫酸锰10-200mg/l，消泡剂0.1-1g/l，其余为去离子水，调节ph值为7.2；
22.(5)转化：发酵液4℃，3000-4000rcf离心收集菌体，加入反应液中，反应过程中控制ph值在6.5-7.5，温度控制在30-45℃，将溶氧维持在15％-25％；当反应液中的甘油消耗完后，流补50％(m/v)的甘油溶液，控制甘油浓度在0.1-5g/l；
23.所述反应液成分为：四氢嘧啶10-100g/l，甘油5g/l，ph7.0的pbs缓冲液0.01m，od600值为20；
24.所述0.01m pbs缓冲液(ph7.0)由氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制而成，具体为，1l所述0.01m pbs缓冲液(ph7.0)由8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钠溶于800ml蒸馏水中，用2m氢氧化钠或2m盐酸调节ph值为7.2，最后加
蒸馏水定容至1l制得。
25.进一步的，步骤(4)加入的l-阿拉伯糖的终浓度为2g/l。
26.进一步的，步骤(5)还包括每隔4小时取样测定反应液中四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的含量，检测方法为：
27.反应液经12000rpm离心5min后取上清，去离子水稀释后使用高效液相色谱法测定，选用zorbax sb-c18色谱柱，流动相为2％乙腈溶液，柱温为35℃，流速为1ml/min，进样量为10μl，紫外检测波长为210nm，保留时间为10min，并配置一系列浓度梯度的四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的混合溶液作为标准样品，绘制标准曲线，各梯度混合溶液中四氢嘧啶的浓度和羟基四氢嘧啶的浓度相同，依次为0.01g/l、0.03g/l、0.05g/l、0.07g/l、0.1g/l。
28.进一步的，步骤(5)反应24小时后停止反应，并计算羟基四氢嘧啶转化率，
29.转化率＝羟基四氢嘧啶(摩尔浓度)/[四氢嘧啶(摩尔浓度)+羟基四氢嘧啶(摩尔浓度)]*100％，
[0030]
四氢嘧啶(摩尔浓度)＝四氢嘧啶含量(g/l)/142.16(g/mol)，
[0031]
羟基四氢嘧啶(摩尔浓度)＝羟基四氢嘧啶含量(g/l)/158.16(g/mol)。
[0032]
本发明的有益效果在于：
[0033]
本发明采用带有
△
arabad阿拉伯糖代谢缺陷性状的出发菌株，利用阿拉伯糖启动子表达四氢嘧啶羟化酶ectd，发酵收集菌体，实现由四氢嘧啶到羟基四氢嘧啶的高效转化，四氢嘧啶残留量少，转化体系简单，有利于后期分离纯化生产高纯度羟基四氢嘧啶，具有重要的工业应用价值。
附图说明
[0034]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0035]
图1是实施例1中pbad-hisa线性化片段和ectd dna片段的电泳图。
[0036]
图2是实施例1中重组载体pbad-ectd的质粒图谱。
[0037]
图3是实施例2中阴性对照和大肠埃希氏菌frd-ect-1的蛋白电泳图。
[0038]
图4是实施例3中四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶含量为0.03g/l时的高效液相色谱检测图。
[0039]
图5是实施例7反应过程中不同时间下的反应液组成和转化率曲线图。
具体实施方式
[0040]
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
[0041]
下列实施例所使用的大肠杆菌bw25113是带有
△
arabad阿拉伯糖代谢缺陷性状的大肠杆菌，其基因型为(rrnb3
△
lacz4787hsdr514
△
(arabad)567
△
(rhabad)568rph-1)，购
自武汉淼灵生物科技有限公司。
[0042]
下列实施例所使用的伸长盐单胞菌(halomonas elongate)为cgmcc no.1.6329，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0043]
下列实施例所使用的ph7.0的pbs缓冲液pbs缓冲液由氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制而成，具体为，1l所述ph7.0的pbs缓冲液由8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钠溶于800ml蒸馏水中，用2m氢氧化钠或2m盐酸调节ph值为7.2，最后加蒸馏水定容至1l即得。
[0044]
实施例1大肠埃希氏菌frd-ect-1的构建
[0045]
s1重组载体pbad-ectd的构建
[0046]
①
pcr扩增四氢嘧啶羟化酶ectd的编码序列
[0047]
采用pcr技术以伸长盐单胞菌cgmcc no.1.6329为模板，根据ectd基因序列设计一对引物(ectd-f，ectd-r)，扩增获取ectd片段。
[0048]
其中，基因ectd、引物ectd-f的核苷酸序列和引物ectd-r的核苷酸序列分别如seq i d no.2、seq id no.4、seq id no.5所示。
[0049]
②
载体pbad-hisa线性化
[0050]
用bamhⅰ酶切pbad/hisa质粒，获得线性化pbad/hisa片段，电泳图如图1，其中泳道1为pbad-hisa线性化片段(核苷酸序列如seq id no.1所示)，泳道m为dna maker 5000，泳道3为ectd dna片段。
[0051]
③
重组、转化、筛选和序列验证
[0052]
用同源重组试剂盒将上述ectd片段和pbad-hisa片段连接，用热击转化法转化至大肠杆菌dh5α感受态，用含有氨苄青霉素(100μg/ml)的lb培养基进行筛选培养，挑取单菌落，并进行扩大培养，提取质粒，测序验证，构建完成的质粒图谱如图2。
[0053]
s2重组表达菌株的构建
[0054]
用氯化钙法将重组载体pbad-ectd转化至大肠杆菌bw25113(rrnb3
△
lacz4787hsdr514
△
(arabad)567
△
(rhabad)568rph-1)，用含有氨苄青霉素(100μg/ml)的lb培养基进行筛选培养，挑取单菌落，获得大肠埃希氏菌frd-ect-1。
[0055]
该大肠埃希氏菌frd-ect-1已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.24235，保藏时间为2022年1月4日。
[0056]
实施例2基因工程菌frd-ect-1中ectd基因的表达
[0057]
挑取frd-ect-1单菌落接入3ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的lb液体培养基中，于37℃，250rpm培养16小时。取1ml转移至100ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的新鲜lb液体培养基中，37℃，250rpm培养2小时至发酵液od600值达到0.6，向发酵体系中加入l-阿拉伯糖(终浓度为1g/l)，28℃条件下继续培养8小时。同时以含有空载体的大肠杆菌bw25113-pbad设为阴性对照。
[0058]
发酵完毕后，4℃，10000rcf离心收集菌体；用预冷的ph7.0的pbs缓冲液清洗2次，用发酵液十分之一体积的预冷的ph7.0的pbs缓冲液重悬菌体，冰上超声破碎，12000rcf离心10min。收集上清液，即为含有目的蛋白的粗酶液，sds-page检测蛋白表达情况。
[0059]
检测结果如图3，泳道1为含有空载体大肠杆菌bw-pbad阴性对照的检测结果，泳道
2为大肠埃希氏菌frd-ect-1的检测结果，泳道m为预染蛋白marker 2216。
[0060]
实施例3大肠埃希氏菌frd-ect-1的应用
[0061]
使用大肠埃希氏菌frd-ect-1以四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶，具体方法如下：
[0062]
(1)菌株活化：在超净工作台用接种环蘸取菌液，在固体斜面活化培养基中划线，放置于37℃培养箱中培养16小时；
[0063]
固体斜面活化培养基成分为：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉15g/l，其余为去离子水，用2m氢氧化钠或2m盐酸调节ph值为7.2；
[0064]
(2)一级种子培养：在超净工作台用接种环刮取一环菌体，接种到装有30ml种子培养基的500ml三角瓶中，用八层纱布封口，在37℃，250r/min的条件下振荡培养过夜；
[0065]
种子培养基成分为：酵母粉12g/l，蛋白胨24g/l，甘油4g/l，磷酸二氢钾2.31g/l，磷酸氢二钾12.54g/l，其余为去离子水，用2m氢氧化钠或2m盐酸调节ph值为7.2；
[0066]
(3)二级种子培养：按1％接种量转移一级种子到装有100ml种子培养基的1000ml三角瓶中，用八层纱布封口，在37℃，250r/min的条件下振荡培养6小时，od600生长至1.8；
[0067]
种子培养基配方同步骤(2)；
[0068]
(4)发酵：将二级种子液按10％接种量接种到新鲜的发酵培养基中，开始发酵，发酵过程中用氨水控制ph值在7.0，温度控制在37℃，通过调节转速和通气将溶氧维持在30％；当培养基中的碳源消耗完，溶氧开始上升时，流补50％(m/v)的葡萄糖溶液，控制糖浓度在0.1-5g/l，4小时od600达到10，降温至30℃，加入l-阿拉伯糖(终浓度2g/l)，继续培养8小时；
[0069]
所述发酵培养基成分为：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，硫酸铵5g/l，甘油4g/l，磷酸二氢钾2.31g/l，磷酸氢二钾12.54g/l，硫酸镁1g/l，硫酸亚铁100mg/l，硫酸锰100mg/l，消泡剂0.3g/l，其余为去离子水，用2m氢氧化钠或2m盐酸调节ph值为7.2；
[0070]
(5)转化：发酵液4℃，4000rcf离心收集菌体，加入反应液中，反应液成分为四氢嘧啶20g/l，甘油5g/l，ph7.0的pbs缓冲液0.01m，od600值为20，反应过程中用氨水控制ph值在7.0，温度控制在30℃，通过调节转速和通气将溶氧维持在20％；当反应液中的甘油消耗完后流补50％(m/v)的甘油溶液，控制甘油浓度在0.1-5g/l；
[0071]
每隔4小时取样测定反应液中四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的含量，检测方法为：反应液经12000rpm离心5min后取上清，去离子水稀释后使用高效液相色谱法测定，选用zorbax sb-c18色谱柱，流动相为2％乙腈溶液，柱温为35℃，流速为1ml/min，进样量为10μl，紫外检测波长为210nm，保留时间为10min；并配置一系列浓度梯度的四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的混合溶液作为标准样品，绘制标准曲线，各梯度混合溶液中四氢嘧啶的浓度和羟基四氢嘧啶的浓度相同，依次为0.01g/l、0.03g/l、0.05g/l、0.07g/l、0.1g/l。
[0072]
四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶含量均为0.03g/l时的高效液相色谱检测结果如图4所示，其中羟基四氢嘧啶的出峰时间为2.374min，四氢嘧啶的出峰时间为2.649min。
[0073]
24小时后停止反应，实施例3反应液中羟基四氢嘧啶含量为16.5g/l，四氢嘧啶含量为5.20g/l，计算得出转化率为74％。
[0074]
实施例4
[0075]
使用大肠埃希氏菌frd-ect-1以四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶，与实施例3的区别仅在于步骤(4)参数的不同，具体如下：
[0076]
实施例4步骤(4)降温至26℃，加入l-阿拉伯糖(终浓度2g/l)，继续培养8小时。
[0077]
24小时后停止反应，实施例4反应液中羟基四氢嘧啶含量为22.3g/l，四氢嘧啶含量为0g/l，计算得出转化率为100％。
[0078]
实施例5
[0079]
使用大肠埃希氏菌frd-ect-1以四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶，与实施例3的区别仅在于步骤(4)、步骤(5)参数的不同，具体如下：
[0080]
实施例5步骤(4)降温至26℃，加入l-阿拉伯糖(终浓度2g/l)，继续培养8小时；
[0081]
实施例5步骤(5)，反应液中四氢嘧啶浓度为30g/l，反应过程中温度控制在37℃。
[0082]
24小时后停止反应，实施例5反应液中羟基四氢嘧啶含量为33.4g/l，四氢嘧啶含量为0g/l，计算得出转化率为100％。
[0083]
实施例6
[0084]
使用大肠埃希氏菌frd-ect-1以四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶，与实施例3的区别仅在于步骤(4)、步骤(5)参数的不同，具体如下：
[0085]
实施例6步骤(4)降温至26℃，加入l-阿拉伯糖(终浓度2g/l)，继续培养8小时；
[0086]
实施例6步骤(5)，反应液中四氢嘧啶浓度为40g/l，反应过程中温度控制在37℃。
[0087]
24小时后停止反应，实施例6反应液中羟基四氢嘧啶含量为40.7g/l，四氢嘧啶含量为3.4g/l，计算得出转化率为91.5％。
[0088]
实施例7
[0089]
使用大肠埃希氏菌frd-ect-1以四氢嘧啶生产羟基四氢嘧啶，与实施例3的区别仅在于步骤(4)、步骤(5)参数的不同，具体如下：
[0090]
实施例7步骤(4)降温至26℃，加入l-阿拉伯糖(终浓度2g/l)，继续培养8小时；
[0091]
实施例7步骤(5)，反应液中四氢嘧啶浓度为40g/l，反应过程中温度控制在40℃。
[0092]
实施例7反应过程中不同时间下的反应液组成如图5所示，24小时停止反应后，实施例7反应液中羟基四氢嘧啶含量为44.5g/l，四氢嘧啶含量为0g/l，计算得出转化率为100％。
[0093]
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。