植物乳杆菌HOM3201菌株及其活菌制剂、制备方法和用途与流程

植物乳杆菌hom3201菌株及其活菌制剂、制备方法和用途
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)hom3201菌株、包含其的活菌制剂及其制备方法和用途。


背景技术：

2.世界卫生组织(who)将益生菌定义为足量食用会对宿主有益的活性微生物。只有经科学研究证明对健康有益的菌株才可以被称为“益生菌”。益生菌的核心特征是足够数量、活菌状态和有益健康功能。植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)是一类普遍存在的益生菌，常分离于酸菜、泡菜等发酵食品及人体中。植物乳杆菌在改善肠道屏障、糖尿病、高血压、肥胖、抗感染、精神疾病等方面具有有益功能。
3.2型糖尿病的发病率逐年升高，中国位于世界前列。2型糖尿病的病因和发病机制极为复杂，目前认为主要是由遗传和环境因素引起外周组织胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷，导致机体的胰岛素相对或绝对不足，使葡萄糖摄取利用减少，从而引发高血糖，导致糖尿病。
4.目前针对益生菌调节血糖水平的研究并不完善和系统。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术问题，提供一种植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)hom3201菌株、包含其活菌制剂、制备方法和用途。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.一方面，本发明提供了一种植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)hom3201菌株，所述植物乳杆菌hom3201菌株的保藏编号为cgmcc no.22700。
8.优选地，所述植物乳杆菌hom3201菌株包含由seq id no:1表示的16srdna序列。
9.另一方面，本发明提供一种活菌制剂，其包含根据如上所述的植物乳杆菌hom3201菌株。
10.优选地，所述活菌制剂包含高达4.0-8.0
×
10
11
cfu/g的活菌。
11.优选地，所述活菌制剂还包含辅料。
12.再一方面，本发明提供一种食品或保健品，其包含如上所述的活菌制剂。
13.又一方面，本发明提供了如上所述的植物乳杆菌hom3201菌株在制备用于辅助降低血糖的药物中的用途。
14.所述植物乳杆菌hom3201菌株用于降低胰岛素抵抗糖代谢紊乱/脂代谢紊乱模型大鼠空腹血糖水平、增加机体对葡萄糖的耐受性和降低胰岛素抵抗指数。
15.优选地，所述植物乳杆菌hom3201菌株用于治疗糖尿病。
16.再又一个方面，本发明提供一种制备如上所述的活菌制剂的方法，包括以下步骤：将权利要求1所述的植物乳杆菌hom3201菌株在优化的液体培养基内扩大培养；收集菌体；加入保护剂重悬，真空冷冻干燥，经过粉碎，得到活性菌剂。
17.本发明具有以下优点：
18.(1)本发明的植物乳杆菌hom3201可显著降低胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱模型大鼠空腹血糖水平，增加机体对葡萄糖的耐受能力，降低胰岛素抵抗指数。
19.(2)本发明的植物乳杆菌具有优秀的体外益生功能。该菌株在人工胃肠液耐受性、抑菌性、抗氧化活性等方面表现优异。
20.(3)本发明的活性菌剂生产工艺参数简单，周期短，活菌数高，稳定性好，长时间内发挥功效。
附图说明
21.图1示出了基于upgma方法构建的植物乳杆菌hom3201菌株的rapd聚类分析图。
22.图2示出了本发明的植物乳杆菌hom3201菌株对dpp-4和α-葡萄糖苷酶抑制率。
23.图3示出了本发明的植物乳杆菌hom3201菌株对胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱模型大鼠葡萄糖耐受性影响。
24.图4示出了本发明的过程流程图。
25.微生物保藏说明
26.本发明的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)hom3201菌株于2021年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号为cgmcc no.22700。
具体实施方式
27.本发明公开了菌株、特性及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
28.二肽基肽酶4抑制剂(即dpp-4抑制剂)是一类治疗2型糖尿病的新型药物，比如西格列汀、维格列汀等。dpp-4抑制剂可以抑制dpp-4的活力，从而刺激肠促胰岛素[高血糖素样肽-1(glp-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(gip)]的分泌。glp-1和gip可以抑制胰高血糖素的释放，增加胰岛素分泌，减少胃排空，降低血糖水平。
[0029]
α-葡萄糖苷酶抑制剂是用于2型糖尿病的口服降糖药，常用的主要是阿卡波糖、伏格列波糖。α-葡萄糖苷酶抑制剂的降糖机制是通过抑制肠黏膜上的α-葡萄糖苷酶，减缓淀粉分解为葡萄糖的速率，减少和延缓小肠对葡萄糖的吸收，从而降低血糖，对餐后高血糖的作用比较明显。α-葡萄糖苷酶抑制剂不刺激胰岛素的分泌，单独使用此类药物通常不会引发低血糖，因此可帮助减少血糖的波动。
[0030]
本发明的植物乳杆菌hom3201可显著降低胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱模型大鼠空腹血糖水平，增加机体对葡萄糖的耐受能力，降低胰岛素抵抗指数。其降糖机制为，植物乳杆菌hom3201生长代谢产生dpp-4抑制剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂。dpp-4抑制剂通过抑制dpp-4，刺激机体产生胰高血糖素样肽-1(glp-1)，促进胰岛素分泌；α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制α-葡萄糖苷酶，减缓淀粉转化为葡萄糖的速率，从而达到降糖目的。
[0031]
为使本发明要解决的技术问题、采用的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例对本发明进行详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0032]
需要说明的是，本发明中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0033]
本发明中所使用的试剂和材料，如无特别说明，均采用常规方法配制或者由商业途径获得。
[0034]
本发明中使用的泡菜：
[0035]
本发明中使用的用于分离植物乳杆菌hom3201菌株的泡菜样品来自四川省成都家庭自制手工泡菜。制作方法如下：将蔬菜(青萝卜、白萝卜、胡萝卜、卷心菜、豇豆、青辣椒等)洗净，切成小条并晾干；将泡菜坛子洗净，晾干后倒入少许高度白酒消毒，备用；将清水倒入无油的锅中，放入桂皮、香叶、花椒、八角、冰糖、老姜煮沸，彻底放凉后，倒入泡菜坛子中，并倒入野山椒汁、高粱酒和蔬菜。扣上盖后，往水槽内倒入清水把坛子封口。置阴凉通风处发酵10天，得到本发明中使用的泡菜。
[0036]
本发明中使用的植物乳杆菌商业菌株，是从含有所需菌株的商业产品中分离的，具体分离方法如实施例1中所述。
[0037]
实施例1植物乳杆菌hom3201菌株的分离及鉴定
[0038]
(1)植物乳杆菌菌株筛选培养基配方
[0039]
改良的mrs固体培养基：
[0040]
mrs培养基(oxoid，cm1163)，添加溴甲酚绿(上海生工)0.05g、双蒸水1l，充分搅拌均匀。调整ph至5.5，121℃灭菌20min，备用。
[0041]
(2)植物乳杆菌菌株的分离筛选
[0042]
a.hom植物乳杆菌菌株的分离筛选
[0043]
称取1g泡菜，用9ml 0.9％生理盐水制成泡菜汁。吸取1ml泡菜汁，利用10倍稀释法对样品稀释，稀释度为10-3-10-5
。稀释后的泡菜汁涂布于上述改良mrs平板中，35℃厌氧培养72h。挑选表面湿润光滑、边缘整齐、乳黄色或乳白色菌落且周边变黄的单菌落，划线培养及纯化。同时进行革兰氏染色、镜检观察菌落形态。转接单菌落至mrs液体培养基中进行纯培养，甘油保种，共分离出5株植物乳杆菌，将各菌株分别命名为hom3201、hom3202、hom3203、hom3204、hom3205。
[0044]
b.植物乳杆菌商业菌株的分离筛选
[0045]
本发明中使用的植物乳杆菌商业菌株分离于商业益生菌产品中，菌株及产品信息为：植物乳杆菌lp-115(分离自怡能300)、植物乳杆菌lp-onlly(分离自昂立儿童益生菌粉)、植物乳杆菌p-8(分离自益适优)、植物乳杆菌ccfm8661(分离自益生和美)和植物乳杆菌st-iii(分离自光明畅优发酵乳)。
[0046]
植物乳杆菌商业菌株的分离方法：称取1g含有植物乳杆菌的商业菌株菌粉或发酵乳，用9ml 0.9％生理盐水重悬。吸取1ml样品，利用10倍稀释法对样品稀释，选择2-3个合适梯度稀释液涂布于改良mrs平板中，35℃培养72h。挑选表面湿润光滑、边缘整齐、乳黄色或乳白色菌落且周边变黄的单菌落，划线培养及纯化。同时进行革兰氏染色、镜检观察菌落形态。转接单菌落至mrs液体培养基中进行纯培养，甘油保种。
[0047]
(3)hom植物乳杆菌菌株的鉴定
27f5
’‑
agtttgatcmtggctcag-3’71492r5
’‑
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’8[0056]
取10μl pcr扩增产物于2％琼脂糖凝胶电泳检测，随后在凝胶成像仪中进行成像。利用bionumerics version 6.6软件，基于upgma方法对rapd图谱进行聚类分析。结果如图1所示。
[0057]
一般认为，在系统发育树上相似度大于90％以上的菌株具有同株菌的可能性。本次实验的系统发育树结果显示，hom3201菌株与其他植物乳杆菌均不在一个分支上，相似度低于60％，具有显著性差异。因此，hom3201菌株与hom3202、hom3203、hom3204和hom3205菌株，以及商业菌株lp-115、lp-onlly、p-8、ccfm8661和st-iii菌株相比，具有基因型特异性和唯一性。
[0058]
实施例2胃肠道通过能力试验
[0059]
(1)菌株的分离及活化
[0060]
本实验选择三株商业菌株植物乳杆菌299v(分离自jarrow益生菌产品，分离方法同实施例1中的b.植物乳杆菌商业菌株的分离方法)，以及实施例1的从商业益生菌产品中分离的菌株植物乳杆菌lp-115和植物乳杆菌st-iii作为阳性对照。将各菌株分别接种于mrs液体培养基中，于37℃培养24h，活化两次，备用。
[0061]
(2)人工胃液的配制
[0062]
取稀盐酸16.4ml、胃蛋白酶10g，加水约800ml，摇匀后，调节ph为3.0，加水定容到1l，用0.22μm微孔滤膜过滤后待用。
[0063]
(3)人工肠液的配制
[0064]
取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml使溶解，用0.1mol/l氢氧化钠溶液调节ph值至6.8；另取胰酶10g，加水适量溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml，用0.22μm无菌滤膜在无菌环境下过滤，备用。
[0065]
(4)菌株在模拟人工胃肠液中存活能力评价
[0066]
各菌株的菌液各取1ml，离心后，收集菌体，加至10ml人工胃液中，混匀后立即计活菌数，记为t0,放置于37℃培养箱培养3h后计活菌数,记为t1。将样品离心，加入10ml人工肠液，混匀后于37℃培养箱培养3h进行活菌计数，记为t2。其存活率用以下公式计算：
[0067][0068][0069]
其中，t0为未处理前0h供试菌株的活菌数cfu/ml；t1为经人工胃液处理3h后供试菌株的活菌数；t2为经人工胃液3h及人工肠液处理3h后供试菌株的活菌数。
[0070]
表2.植物乳杆菌在模拟人工胃肠液中的存活率
[0071][0072]
*：与hom3201组比较有显著性差异(p《0.05)
[0073]
**：与hom3201组比较有显著性差异(p《0.01)
[0074]
从表2可以看出：植物乳杆菌hom3201菌株在经过3小时的模拟人工胃液处理后，存活率可达118.87％，菌株继续经3小时的模拟人工肠液处理后，其存活率仍可高达122.59％，说明植物乳杆菌hom3201菌株在胃肠道中具有较高的存活率。
[0075]
与市售植物乳杆菌299v、lp-115、st-iii菌株相比，植物乳杆菌hom3201耐受胃液的能力高于市售植物乳杆菌299v、lp-115、st-iii菌株，且具有显著或极显著性差异。
[0076]
实施例3抑制常见致病菌能力试验
[0077]
(1)致病菌活化
[0078]
本次试验选择五种致病菌：大肠杆菌(e.coli)atcc8739，鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)atcc14028，金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)atcc6538，铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)atcc9027，单增李斯特菌(listeria monocytogenes)atcc19111。这些致病菌株购买自atcc(美国模式培养物集存库，american type culture collection)。
[0079]
将致病菌株分别接种于营养琼脂培养基中，37℃，200rpm振荡培养12h。将指示菌用新鲜培养基调整到od＝0.1备用。
[0080]
(2)乳酸菌菌株活化
[0081]
本实验选择商业菌株植物乳杆菌299v(分离方法同实施例1和2)、lp-115(分离方法同实施例1)、st-iii菌株(分离方法同实施例1)及鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)lgg菌株作为对照菌株，其中lgg菌株分离于康萃乐菌粉产品，分离方法同实施例1。
[0082]
将各菌株分别接种到mrs液体培养基中，37℃静置培养24小时，活化两次后得菌株发酵液。11000rpm离心10min，取上清液做抑菌试验，mrs液体培养基作为阴性对照。注释：乳酸菌是大类总称，包括乳杆菌和双歧杆菌。
[0083]
(3)平板制备
[0084]
将已灭菌的营养琼脂培养倒入培养皿内，将100μl指示菌液加入到培养基中，混匀后，静置凝固。
[0085]
(4)抑菌实验
[0086]
用无菌镊子将牛津杯轻放于平板上，孔间保持一定距离。向孔中分别加入150μl发酵上清液，置于4℃冰箱中扩散12小时后，37℃培养箱中培养18小时，观察并测量抑菌圈直径。
[0087]
表3.植物乳杆菌hom3201菌株对致病菌的抑制效果
[0088][0089]
注：
“–”
无抑菌活性，＜11mm；“+”11mm≤抑菌圈＜16mm；“++”16mm≤抑菌圈＜23mm；“+++”≥23mm
[0090]
由表3可知，植物乳杆菌hom3201对5种致病菌均有抑制作用。与商业菌株植物乳杆菌299v、lp-115、st-iii菌株及鼠李糖乳杆菌lgg菌株相比，抑菌能力相当。
[0091]
实施例4抗生素敏感性试验
[0092]
药敏试验根据美国临床标准委员会(nccls)推荐的k-b琼脂法，方法如下：
[0093]
(1)选择商业菌株植物乳杆菌299v、lp-115、st-iii菌株(同实施例3)作为对照菌株。将菌株分别接种于mrs液体培养基，37℃培养24小时，连续活化3代。
[0094]
(2)取1ml菌液(1.5
×
108cfu/ml)，15ml mrs固体培养基置于灭菌培养皿中，混合均匀，待平板凝固后贴放标准抗生素药敏纸片，置37℃下培养24-48h后测量并记录抑菌圈直径。根据clsi判定标准判读，结果见表4。
[0095]
表4.乳酸菌菌株对9种抗生素敏感性测定结果
[0096][0097]
s(susceptible)表示敏感；i(intermediate)表示中等；r(resistance)表示耐药。
[0098]
由表4可见，hom3201菌株对万古霉素、庆大霉素、链霉素、卡那霉素、克林霉素表现出耐药性，对氯霉素、四环素、氨苄西林和红霉素是敏感的。与商业菌株植物乳杆菌299v、lp-115、st-iii菌株对比，hom3201未发现异常耐药性。
[0099]
实施例5抗氧化活性检测试验
[0100]
(1)植物乳杆菌菌株活化
[0101]
选择商业菌株植物乳杆菌lp-115、st-iii菌株(分离方法同实施例1)当作阳性对
照。将各菌株接种到mrs培养基中，37℃静置培养24小时，活化3代，离心后将菌株浓度调整到3
×
10
10
cfu/ml，待用。
[0102]
(2)抗氧化活性测定
[0103]
指标包含总抗氧化能力测定(t-aoc)、羟自由基清除测定(
·
oh)、dpph自由基清除测定。前两个指标利用南京建成公司购买的试剂盒，按操作说明书进行测定。dpph自由基清除试验采用比色法，其原理是自由基清除剂提供一个电子与dpph自由基的孤对电子配对，使自身紫色变为黄色，在517nm波长处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，即自由基清除剂的清除能力越强，吸光度越小。结果如表5所示。
[0104]
表5.植物乳杆菌菌株体外抗氧化活性测定
[0105][0106]
*：与hom3201组比较有显著性差异(p《0.05)
[0107]
**：与hom3201组比较有显著性差异(p《0.01)
[0108]
由表5可知，植物乳杆菌hom3201菌株在总抗氧化能力、羟自由基清除、dpph自由基清除方面表现突出。在t-aoc方面，与lp-115菌株相比，hom3201菌株表现优异，且具有极显著性差异；在羟自由基清除方面，三组间无明显差异；在dpph自由基清除方面，与lp-115菌株相比，hom3201菌株清除率较高，且具有显著性差异；与st-iii菌株相比，无明显差异。
[0109]
实施例6植物乳杆菌hom3201菌株活性菌粉的制备工艺
[0110]
(1)菌种的培养
[0111]
将植物乳杆菌hom3201菌株接种于mrs液体培养基中，37℃培养24小时，活化2代。接种于发酵培养基(如表6所示)中，37℃培养，活菌数可达2*10
10
cfu/ml以上。
[0112]
表6.发酵培养基配方
[0113][0114]
(2)冷冻冻干保护剂的制备
[0115]
使用无菌水与保护剂原料混合制备得到含有100g/l脱脂奶粉、50g/l海藻糖、3g/l维生素c、5g/l l-谷氨酸钠的保护剂。
[0116]
(3)冷冻干燥
[0117]
将植物乳杆菌hom3201菌株发酵菌液经离心收集菌泥，用0.9％无菌生理盐水洗涤菌泥，将菌泥与上述保护剂混合，使菌液浓度达到10
10
cfu/ml以上，于冻干机内进行冷冻干
燥，用精细研磨机将菌饼进行粉碎处理，获得所述冻干菌粉，冻干菌粉活菌数高于6.0
×
10
11
cfu/g。
[0118]
实施例7植物乳杆菌hom3201菌株体外降糖功效及机制探索
[0119]
(1)配置改良版mrs液体培养基
[0120]
mrs培养基(oxoid)，在成品培养基基础上添加0.05％l-半胱氨酸盐酸盐，搅拌均匀，121℃灭菌20min，备用。
[0121]
(2)菌种活化及样品处理
[0122]
选择商业菌株植物乳杆菌299v、lp-115、st-iii(分离方法同实施例1)，以及罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)adr1菌株作为阳性对照，adr-1菌株分离于醣美乐产品，分离方法同实施例1。
[0123]
将各菌株分别以1％的接种量接入新鲜的改良版mrs液体培养基中，37℃静置厌氧培养24h，活化3代。菌液经8000rpm离心10min，用磷酸盐缓冲溶液(pbs)洗涤三次。调整活菌数为4
×
10
10
cfu/ml，厌氧培养8h，经8000rpm离心10min，取上清液备用。
[0124]
(3)dpp-4抑制性和α-葡萄糖苷酶抑制性筛选
[0125]
采用dpp-4抑制剂筛选试剂盒(abnova#ka1311)和α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选试剂盒(biovision#k938)进行降糖功能的体外筛选。计算乳酸菌样品对以上两种酶的抑制率(结果见图2)。
[0126]
表7.各菌株对dpp-4的抑制率和α-葡萄糖苷酶的抑制率
[0127][0128]
*：与hom3201组比较有显著性差异(p《0.05)
[0129]
由表7可见，hom3201菌株对dpp-4和α-葡萄糖苷酶具有较高的抑制率。在dpp-4抑制率抑制测定中，hom3201菌株组均高于其他组，hom3201组与adr-1、299v菌株组相比，具有显著性差异(p《0.05)。在α-葡萄糖苷酶抑制测定中，hom3201菌株组低于adr-1组，但均高于其他组。已有临床文献研究表明，罗伊氏乳杆菌adr-1菌株具有降低血糖功效。综合所述，hom3201菌株可通过产生较高水平的dpp-4抑制剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂，达到降低血糖值的目的(图2)。
[0130]
实施例8植物乳杆菌hom3201菌株刺激nci-h716细胞分泌glp-1
[0131]
(1)nci-h716细胞的培养
[0132]
本实验选择nci-h716细胞(购自中国科学院细胞库)，nci-h716细胞生长在含有10％胎牛血清(hyclone)，1％双抗(青霉素和链霉素，hyclone)的rpmi-1640(gibco)培养基中，37℃，5％co2的培养箱中细胞悬浮生长。
[0133]
(2)乳酸菌菌株的培养
[0134]
选择三种商业菌株(罗伊氏乳杆菌adr-1、鼠李糖乳杆菌lgg和乳双歧杆菌(bifidobacterium lactis)cect8145)当作阳性对照。乳双歧杆菌cect8145菌株自adm公司赠送菌粉中分离而来。
[0135]
乳双歧杆菌cect8145分离方法：称取1g菌粉，用9ml 0.9％生理盐水重悬。吸取1ml样品，利用10倍稀释法对样品稀释，选择2-3个合适梯度稀释液涂布于tos(merck,1.00043.0500)平板中，37℃厌氧培养72h。挑选表面湿润光滑、边缘整齐、乳白色单菌落，划线培养及纯化。同时进行革兰氏染色、镜检观察菌落形态。转接单菌落至mrs+0.5％半胱氨酸盐酸盐(sigma,1161509)液体培养基中进行纯培养，甘油保种。
[0136]
将植物乳杆菌hom3201、罗伊氏乳杆菌adr-1、鼠李糖乳杆菌lgg分别接入mrs液体培养基中，37℃静置培养24h，活化3代；将乳双歧杆菌cect8145接入mrs+0.5％半胱氨酸盐酸盐液体培养基中，37℃静置厌氧培养24h，活化3代；各菌液经8000rpm离心10min，用krebs缓冲液(sigma)洗涤三次。调整活菌数为1
×
10
10
cfu/ml，备用。
[0137]
(3)glp-1内分泌实验
[0138]
将nci-h716细胞以1.5
×
106个/孔的密度种于包被有基质胶的24孔板(corning)中，加入内分泌分化培养基中，37℃，5％co2的培养箱培养2天，进行内分泌分化实验。内分泌分化培养基是含有10％胎牛血清，1％双抗的高糖的dmem(gibco)培养基。
[0139]
2天后，dmem培养基用krebs-ringer缓冲液代替，缓冲液中分别包含1
×
10
10
cfu/ml的益生菌菌株，培养2h后，8000rpm离心10min，收集上清。上清中加入50μg/ml的苯甲基磺酰氟(roche)和10μg/ml西格列汀(sigma)，然后采用elisa试剂盒(raybiotech)检测glp-1的浓度。
[0140]
表8.各菌株刺激nci-h716细胞分泌glp-1产量
[0141][0142]
*：与hom3201组比较有显著性差异(p《0.05)
[0143]
**：与hom3201组比较有显著性差异(p《0.01)
[0144]
三种商业菌株(罗伊氏乳杆菌adr-1、鼠李糖乳杆菌lgg和乳双歧杆菌cect8145)均有文献阐释具有降血糖的相关研究。
[0145]
由表8可见，hom3201菌株可刺激nci-h716细胞分泌高含量的glp-1，浓度达到1890.21
±
158.38pg/ml。与罗伊氏乳杆菌adr-1对比，hom3201菌株具有极显著性差异(p《0.01)；与鼠李糖乳杆菌lgg和乳双歧杆菌cect8145对比，hom3201菌株具有显著性差异(p《0.05)。结果表明，植物乳杆菌hom3201菌株具有降低血糖的功效，降糖机制可能是通过刺激肠道l细胞产生高含量的glp-1。
[0146]
实施例9植物乳杆菌hom3201菌株对由四氧嘧啶诱导的胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱模型大鼠血糖影响
[0147]
(1)选用北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：scxk-(京)2019-0008]繁
殖的140g-160g健康spf级sd雄性大鼠46只，实验动物饲养于北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心spf级动物室，实验动物使用许可证号：syxk(京)2017-0038。共分为两批进行实验。实验一批10只进行对正常大鼠空腹血糖影响实验；实验二批36只进行四氧嘧啶诱导胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱模型大鼠空腹血糖实验；糖耐量实验；血清甘油三酯、总胆固醇实验；血清胰岛素实验。其中高热能饲料配方：52.6％基础饲料、15％蔗糖、15％蛋黄粉、10％猪油、5％酪蛋白、1.2％胆固醇、0.2％胆酸钠、0.6％碳酸氢钙、0.4％石粉。
[0148]
(2)正常大鼠空腹血糖影响实验：普通饲料适应饲养3天，禁食4h，取血，静置10min后，3000r/min离心10min分离出血清，使用生化分析仪测定给葡萄糖前(即0h)血糖值，给2.5g/kg bw葡萄糖后0.5、2h血糖值，作为该批次动物基础值。设正常对照组(0cfu/只)和hom3201组(5*10
10
cfu/kg bw)；每组5只，试验结束，各组大鼠禁食4h，内眦静脉丛取血，使用生化分析仪检测空腹血糖值，同时测定初始和结束时大鼠体重。
[0149]
表9.植物乳杆菌hom3201菌株对正常大鼠体重影响
[0150][0151]
由表9可见，正常大鼠的实验前后体重在两组间比较，差异均无显著性(p》0.05)。
[0152]
表10.植物乳杆菌hom3201菌株对正常大鼠空腹血糖影响
[0153][0154]
由表10可见，实验前后血糖值在两组间差异均无显著性(p》0.05)。
[0155]
(3)四氧嘧啶诱导胰岛素抵抗糖\脂代谢紊乱模型大鼠空腹血糖实验：设立空白对照组、模型组和hom3201菌株组，每组12只老鼠，hom3201菌株组灌胃剂量为5*10
10
cfu/kg bw。采取灌胃法给予受试物0.5ml/只动物，空白对照组、模型对照组给予同体积生理盐水，每日灌胃一次。各组给予基础饲料饲养一周后，模型对照组和hom3201菌株组更换高热能饲料，各组继续喂养三周后，模型对照组和hom3201菌株组禁食24h，腹腔注射给予四氧嘧啶105mg/kg bw，注射量1ml/100g体重。注射后继续给予高热能饲料喂饲5天。试验结束，各组大鼠禁食4h，取血，检测空腹血糖、糖耐量、血清胰岛素、总胆固醇、甘油三酯水平。
[0156]
表11.大鼠体重测定
[0157][0158]
由表11可见，模型对照组与空白对照组相比，实验前后大鼠体重无明显差异。
[0159]
表12.大鼠糖脂代谢紊乱模型血糖及糖耐量
[0160][0161]
**：与空白对照组比较有极显著性差异(p《0.01)
[0162]
表13.大鼠糖脂代谢紊乱模型血脂及胰岛素抵抗指数
[0163][0164]
*：与空白对照组比较有显著性差异(p《0.05)
[0165]
由表12和表13可见，模型对照组与空白对照组比较，给葡萄糖后0h、0.5h血糖值均有非常显著性差异(p《0.01)，且模型对照组0.5h血糖值≥10mmol/l，表明模型糖代谢紊乱成立。模型对照组与空白对照组比较，血清总胆固醇升高有显著性差异(p《0.05)，判定脂代谢紊乱模型成立；模型对照组与空白对照组比较，胰岛素抵抗指数明显下降(p《0.05)，综合判定胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱模型成功。
[0166]
表14.hom3201菌株对模型大鼠体重的影响
[0167][0168]
表15.hom3201菌株对模型大鼠空腹血糖的影响
[0169][0170]
*：与模型对照组比较有显著性差异(p《0.05)
[0171]
表16.hom3201菌株对模型大鼠糖耐量的影响
[0172][0173]
*：与模型对照组比较有显著性差异(p《0.05)
[0174]
由表15和表16可见，在0h时，两组间血糖值具有显著性差异(p《0.05)，在0.5h时，hom3201组血糖有下降趋势，但无显著性差异(p＞0.05)。在2h时，两组间无明显差异。这说明，hom3201益生菌可显著性降低模型大鼠空腹血糖，降低0.5h时的餐后血糖值，提高血糖耐受性(图3)。
[0175]
表17.hom3201菌株对模型大鼠血清胆固醇及甘油三酯的影响
[0176][0177]
由表17可见，与模型对照组比较，hom3201菌株组中的血清胆固醇和甘油三酯差异均无显著性(p》0.05)。
[0178]
表18.hom3201对模型大鼠血清胰岛素抵抗指数的影响
[0179][0180]
由表18可见，与模型对照组比较，hom3201菌株组血清胰岛素抵抗指数有所下降，但差异无显著性(p》0.05)。
[0181]
图4示出了本发明的植物乳杆菌hom3201菌株的分离、筛选、制剂的制备、体外以及动物实验中降糖效果的过程流程图。
[0182]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
[0183]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此，在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的细节。