一种微流控DNA提取装置

一种微流控dna提取装置
技术领域
1.本发明属于微流控技术领域，更具体地，涉及一种离心式微流控dna提取装置。


背景技术：

2.传统的dna提取方法需要多次震荡、离心、转移等，操作复杂费、周期长、成本高而且集成化程度低。实现高通量、集成化和自动化的dna提取流程具有重要的实用意义。微流控装置具有体积小、样本和试剂消耗少、分析成本低、分析速度快、易于实现操作流程集成化和自动化等优势，为实现dna高效快速提取和分析开辟了新途径。基于微流控装置进行dna的提取技术已有了一定程度的发展，但目前的微流控芯片仍存在难以处理复杂的样品(如组织)、自动化和集成化程度较低等问题。


技术实现要素：

3.针对现有的微流控dna提取装置的缺点和不足，本发明提供了一种集成化和自动化的微流控dna提取装置，同时制造工艺简单，制造成本可以得到有效的控制。
4.本发明采用的技术方案如下：
5.一种微流控dna提取装置，包括多级联式的提取系统和收集单元，前一级提取系统的输出端通过虹吸通道连接后一级提取系统的输入端，最后一级提取系统的输出端连接收集单元；
6.每一级提取系统由预处理单元、反应单元和分离提纯单元依次连接构成；所述的预处理单元用于对自身存储的试剂或者用于对自身存储的试剂和来自上一级的产物进行预混合处理，得到混合液；所述的反应单元用于对来自预处理单元的混合液进行充分混合和反应，得到反应液；所述的分离提纯单元用于对来自反应单元的反应液进行分离提纯，得到分层产物；收集单元用于对最后一级提取系统得到的分层产物中的目标物质进行收集处理；
7.每一级提取系统和收集单元布置在盘形离心板上，各级提取系统与盘形离心板旋转中心的距离依次减小，且收集单元与盘形离心板旋转中心的距离最小，使各级提取系统实现功能时所需的最低离心旋转速度依次增大。
8.作为本发明的优选，所述的预处理单元包括存储腔室、缓冲腔室、第一毛细阀、虹吸通道和变截面通道；所述的存储腔室连通缓冲腔室的入口，在离心力的作用下，存储腔室内的试剂能够进入缓冲腔室内；所述的缓冲腔室的出口连接第一毛细阀的一端，第一毛细阀的另一端通过虹吸通道连接变截面通道的小截面端口，虹吸通道用来将通过第一毛细阀的液体转移到变截面通道，变截面通道有防止液体倒吸的作用；所述的变截面通道的大截面端口作为预处理单元的出口；所述的第一毛细阀在高于或等于离心转速阈值条件下开启，低于离心转速阈值条件下关闭。
9.作为本发明的优选，所述的反应单元为呈锯齿状弯折的混合通道，沿盘形离心板的径向布置。
10.作为本发明的优选，所述的混合通道外壁上设有向内凹的四边形结构和半圆形结构，在混合通道内依次形成交替布置的四边形挡板和半圆形阻块；所述的四边形挡板朝着液体流向方向倾斜。
11.作为本发明的优选，所述的分离提纯单元包括两个相连的第一分离腔和第二分离腔，以及连接第一分离腔底部的第二毛细阀；所述的第一分离腔的入口通过虹吸通道连接反应单元的出口，第二分离腔的顶部与第一分离腔的顶部接通，在离心力的作用下，来自反应单元的反应液中的液体从第一分离腔流入第二分离腔内，分离提纯后的分层产物从第一分离腔的底部进入第二毛细阀内；所述的第二毛细阀通过虹吸通道连接下一级提取系统的预处理单元的入口或者连接收集单元的入口，第二分离腔的底部封闭；所述的第二毛细阀在高于或等于离心转速阈值条件下开启，低于离心转速阈值条件下关闭。
12.作为本发明的优选，所述的第一分离腔和第二毛细阀沿盘形离心板的径向布置，且第二毛细阀位于远离盘形离心板中心的方向。
13.作为本发明的优选，所述的收集单元包括依次连接并沿盘形离心板的径向布置的存储腔室、缓冲腔室、混合通道和收集腔室；所述的存储腔室用于存储dna洗涤液，缓冲腔室上设有用于连接最后一级提取系统的接口；由最后一级提取系统得到的分层产物与dna洗涤液在缓冲腔室内初步混合，并在混合通道中充分混合，由收集腔室对目标物质进行收集处。
14.作为本发明的优选，所述的提取系统为3-5级，每一级提取系统中的预处理单元距离盘形离心板中心最近，分离提纯单元距离盘形离心板中心最远。
15.作为本发明的优选，多级联式的提取系统和收集单元的工作时序设计为：多级联式的提取系统按照连接顺序依次启动工作；
16.转速为0时，装置不工作；随着转速提升至第一级提取系统工作所需的最低转速时，第一级提取系统开始工作，流体在第一级提取系统完成分离提纯后，流体全部进入第二级提取系统，再提高转速至第二级提取系统工作所需的最低转速，第二级提取系统开始工作；同理，直至最后一级提取系统工作完毕，提高转速至收集单元开始工作，完成提取物的收集，装置工作完毕。
17.作为本发明的优选，各级提取系统的工作时序设计为：
18.1)提升转速至使预处理单元的存储腔室打开所需的最低转速，流体通过存储腔室进入缓冲腔室中；
19.2)提升转速至使预处理单元的第一毛细阀打开所需的最低转速，第一毛细阀打开，流体通过第一毛细阀后转速降低至0，流体通过虹吸通道进入变截面通道；
20.3)提升转速，在离心力作用下，流体从变截面通道进入反应单元中进行充分的混合反应；然后转速再降低至0，流体通过虹吸通道进入分离提纯单元中；
21.4)再次提升转速并保持一定时间，不同溶液因受到的离心力不同而分层，从而实现分离提纯；
22.5)提升转速至使分离提纯单元的第二毛细阀打开所需的最低转速，分离提纯得到的分层产物通过第二毛细阀进入虹吸通道，然后降低转速至0，分层产物通过虹吸通道进入下一级提取系统或进入收集单元。
23.本发明提供的为一种离心式微流控dna提取装置，内部流体的混合和分离是由离
心驱动实现的，因此该装置外部依靠离心机控制工作，包括流体在收集单元以及各级提取系统中的预处理单元、反应单元、分离提纯单元中的流动均由离心力驱动实现。
24.本发明采用的毛细阀可在微流控提取装置转速达到一定值时使液体通过，而装置离心转速小于该值时，液体不能通过毛细阀，所以毛细阀的打开关闭依靠离心力的驱动。而且当毛细阀尺寸信息和溶液参数确定时，毛细阀打开阀门时的离心转速也是确定的。此外，毛细阀也有一定的缓冲作用，避免来自存储腔室的试剂和来自上一级的反应液因时间上的先后顺序而不能混合和反应
25.本发明在反应单元的混合通道内设置周期性阻块和倾斜挡板，促使流体在微流道产生较大的径向分速度，从而有效拉伸流体的接触面，产生横向流动和旋涡区，诱发产生混沌对流，从而显著提高混合通道的混合性能。而且混合通道在装置中沿径向分布，流体在混合通道中的流动依靠离心力的驱动。
26.总体来说，通过上述本发明所构思的技术方案和现有技术相比，具有以下有益效果：
27.(1)本发明的微流控dna提取装置采用多级级联式结构，整合了混合、转移和分离提纯等功能，能够满足一般的生物流程，且在结构上保证了过程的正向进行，具有高度集成化的特点；且本发明的微流控dna提取装置属于离心式微流控装置，其工作依赖于旋转离心，操作简单易行，全过程自动化。
28.(2)本发明的微流控dna提取装置在在混合通道内设置周期性的挡板和阻块，使原本平行的流体层发生拉伸、重组等现象，即使在层流条件下，流体也能在微流道内产生扩散特性接近于湍流的流动状态，从而促使流体在混合通道中产生较大的径向分速度，进而有效拉伸流体的接触面，产生横向流动和旋涡区，诱发产生混沌对流，从而显著提高混合通道的混合性能。
29.(3)本发明的微流控dna提取装置在一个装置的盘形离心板上可以设置多套关于装置中心对称的提取系统(例如附图1为提供两套的示意图)，且功能一致，提高了资源利用率和工作效率；而且装置作为微流控芯片，设计了防倒吸结构，保证过程的可靠性。
30.(4)本发明的微流控dna提取装置结构简单，可批量加工制造。
附图说明
31.图1是本发明实施例提供的微流控dna提取装置的结构示意图；
32.图2是本发明提供的预处理单元示意图；
33.图3是本发明提供的反应单元示意图；
34.图4是本发明提供的分离提纯单元示意图；
35.图5是本发明提供的收集单元示意图；
36.图6是混合通道的混合效果-半圆形阻块半径曲线仿真结果；
37.图7是混合通道的混合效果-四边形挡板宽度曲线仿真结果；
38.图8是毛细阀打开时的临界压力理论值-毛细阀宽度曲线仿真结果；
39.图9是本发明实施例提供的微流控dna提取装置的工作时的旋转时序图；
40.图10是梯形通道斜边最大斜率与接触角之间的关系曲线图；
41.附图标记说明：
42.1为存储腔室，2为缓冲腔室，3为第一毛细阀，4为变截面通道，5为提纯分离单元，501为第一分离腔，502为第二分离腔，503为第二毛细阀，6为虹吸通道，7为混合通道，8为收集腔室，9为半圆形阻块，10为四边形挡板。
具体实施方式
43.为了更加清楚的表达本发明的目的、技术方案和优点，下面结合附图进一步解释。应当理解，此处的原理用以解释本发明，但并不限定于本发明。
44.本发明的微流控dna提取装置，包括预处理单元、反应单元、提纯分离单元和收集单元。其中，预处理单元、反应单元和提纯分离单元组成各级系统，本装置为五级系统级联，特别的，最后一级系统由收集单元组成，第一级至第四级系统中的任一级由预处理单元、反应单元和提纯分离单元依次连接构成，前一级系统输出的反应液混入下一级系统的预处理单元中继续处理。
45.其中，预处理单元是对来自存储腔室1的试剂和来自上一级的反应液或存储腔室的试剂在缓冲腔室2中进行混合预处理，并将处理后得到的混合液依次通过第一毛细阀3、虹吸通道6和变截面通道4输送至反应单元；反应单元通过混合通道使混合液进行充分的混合和反应，并将得到的反应液通过虹吸通道输送至分离提纯单元；分离提纯单元对反应单元得到的反应液进行分离提纯，不同溶液因受到的离心力不同而分层，从而进行分离提纯；收集单元对通过分离提纯单元得到的目标物质进行收集处理操作。
46.具体地，如图1和2所示，本发明实例中，预处理单元包括：
47.存储腔室1，用于预先存储反应所需试剂或溶液；缓冲腔室2，用于对来自存储腔室1的试剂和来自上一级的反应液进行预先混合；第一毛细阀3，控制混合溶液进入下一级系统的流体阀门装置；虹吸通道6，转移液体的作用；变截面通道4，用于防止液体倒吸。
48.如图1和3所示，所述反应单元包括：
49.混合通道7，在混合通道内设置周期性的挡板和阻块，使原本平行的流体层发生拉伸、重组等现象，即使在层流条件下，流体也能在微流道内产生扩散特性接近于湍流的流动状态，从而促使流体在混合通道中产生较大的径向分速度，进而有效拉伸流体的接触面，产生横向流动和旋涡区，诱发产生混沌对流，从而显著提高混合通道的混合性能。
50.如图1和4所示，提纯分离单元5包括：
51.两个相连的第一分离腔501和第二分离腔502，以及连接第一分离腔底部的第二毛细阀503；本发明提供的微流控dna提取装置工作方式为离心旋转，在离心力作用下，来自反应单元的反应液中的液体从第一分离腔501流入第二分离腔502内，不同成分的溶液或物质会产生分层现象而分离，分离提纯后的分层产物从第一分离腔501的底部进入第二毛细阀503内，所述的第二毛细阀503在高于或等于离心转速阈值条件下开启，低于离心转速阈值条件下关闭，进而选取所需物质或溶液，达到分离提纯作用。
52.如图1和5所示，收集单元包括：
53.收集腔室8，作用是收集目标物质。
54.本发明提出的变截面通道能够使液体在没有离心力作用下顺利地流入下一个大腔室，即取消阀门效果，而且能防止液体倒吸。在有限元软件multiphysics comsol软件中进行流体仿真，得出在满足能够消除阀门作用的条件下，梯形通道斜边最大斜率与接触角
之间的关系曲线图，如图10所示。
55.在本发明的一项具体实施中，混合通道用于液体的充分混合。图3是本发明提供的反应单元示意图，即为混合通道示意图，包括在混合通道上交替设置的半圆形阻块9和四边形挡板10。
56.为了验证该混合通道的混合效果，在有限元软件multiphysics comsol软件中对一种典型的装置设计进行流体仿真。在四边形挡板宽度为75μm时，不同半圆形阻块半径下混合通道的的混合效果图，如图6所示；在半圆形阻块半径0.1mm时，不同四边形挡板厚度下混合通道的混合效果图，如图7所示。用相对浓度方差值来衡量混合效果，值为1表示完全未混合，为0表示完全混合。
57.为了验证毛细阀的阀门效果，在有限元软件multiphysics comsol软件中对一种典型的装置设计进行流体仿真，得到毛细阀高度为100μm时，打开阀门时的理论临界压力值和仿真值-毛细阀宽度值关系曲线如图8所示。
58.其中理论临界压力值的计算如公式1所示：
[0059][0060]
其中ps是临界压力，γ是表面张力系数，d是截面宽度，h是截面高度，θ是接触角。
[0061]
在本发明的一项具体实施中，上述微流控dna提取装置的结构设计过程包括：
[0062]
(1)器件的组合方式：存储腔室、缓冲腔室、第一毛细阀、虹吸通道和变截面通道依次连接组成预处理单元；混合通道组成反应单元；第一分离腔、第二分离腔、第二毛细阀组成分离提纯单元；混合通道和收集腔室等相连接组成收集单元。预处理单元、反应单元和分离提纯单元依次连接组成一级系统，用于实现一步典型的生物反应或生物过程，而且各结构(如流道、毛细阀和混合通道等)沿径向分布，这样可以最大程度上利用离心力的驱动作用。
[0063]
dna提取过程通常涉及多步生物反应，所以需要多级系统来实现dna的提取。利用虹吸通道连接各级系统，将沿径向离中心远端的上一级系统的流体转移到沿径向离中心近端的下一级系统，同时充分利用装置的空间。本实施例中提供的一种微流控dna提取装置的结构是五级系统级联(将收集单位视为第五级系统)，各系统通过虹吸通道相连接，且各系统离装置中心距离依次变近。
[0064]
(2)装置的功能实现：一般的生物反应或生物过程包含混合处理、提纯分离等操作，且要求反应正向不可逆。本发明提供的一种微流控dna提取装置的结构设计方法在结构设计上与工艺要求相对应：预处理单元对应预处理功能，反应单元对应混合处理功能，分离提纯单元对应分离提纯功能，收集单元对应收集功能。而且装置的结构设计过程中：一方面用虹吸通道将各器件和各级系统连接相通，使生物过程正向进行，符合一般生物流程要求；另一方面，在单元结构和各级系统间使用变截面通道相连接，保证流体不回流，不倒吸，而且使各单元结构和各系统的功能不相互干扰。
[0065]
(3)装置的时序设计方法：本发明的微流控dna提取装置属于离心式微流控装置，装置中的各核心器件如毛细阀、混合通道、分离结构等，其工作依靠离心旋转。
[0066]
本发明提供的一种微流控dna提取装置的结构设计方法，在空间分布上，各级系统与装置中心的距离依次减小，并结合器件尺寸，使各级系统实现功能时所需的最低离心旋
转速度依次增大。从而能保证微流控dna提取装置在离心旋转时，各级系统随着转速的提高依次触发其功能，各级系统在工作时，其下一级系统不能开始工作。
[0067]
本发明提供的一种微流控dna提取装置的工作时的时序过程为：转速为0时，各级系统均不工作；随着转速提升至第一级系统工作所需的最低转速，第一级系统开始工作，同时第二、三、四、五级系统不工作；流体在第一级系统完成分离提纯后，流体全部进入第二级系统，再提高转速至第二级系统工作所需的最低转速，第二级系统开始工作，同时第三、四、五级系统不工作；流体在第二级系统完成分离提纯后，流体全部进入第三级系统，再提高转速至第三级系统工作所需的最低转速，第三级系统开始工作，同时第四、五级系统不工作；流体在第三级系统完成分离提纯后，流体全部进入第四级系统，再提高转速至第四级系统工作所需的最低转速，第四级系统开始工作，同时第五级系统不工作；流体在第四级系统完成分离提纯后，流体全部进入第四级系统，再提高转速至第五级系统工作所需的最低转速，第五级系统开始工作；流体在第五集系统中完成收集，装置工作完毕。
[0068]
其中，各级系统工作时的时序过程为：提升转速至使存储腔室1打开所需的最低转速，流体通过存储腔室1进入缓冲腔室2中，之后再提升转速至使第一毛细阀3打开所需的最低转速，第一毛细阀3打开，流体通过第一毛细阀3，然后转速降低至0，流体通过虹吸通道6和变截面通道4，然后提升转速，在离心力作用下，流体进入混合通道7中进行充分的混合反应。然后转速再降低至0，流体通过虹吸通道进入提纯分离单元5中，然后再次提升转速至保持在一定值进行分离提取。一定时间后，分离提纯结束，提升转速至使第二毛细阀503打开所需的最低转速，流体通过第二毛细阀503进入虹吸通道，然后降低转速至0，流体通过虹吸通道进入下一级系统。
[0069]
如图9所示，给出了微流控dna提取装置五级系统的工作参数。在本发明的一项具体实施中，利用所述微流控dna提取装置中的后四级系统实现dna提取的方法包括下述步骤：
[0070]
(1)单细胞制备：装置转速置零，在第二级系统的存储腔室1中加入适量胰蛋白酶液和细胞组织液，相应地，在之后的三、四、五级系统的存储腔室1中分别加入适量细胞裂解液、dna沉淀液、dna洗涤液。
[0071]
转速增加至1200rpm，胰蛋白酶液和细胞组织液共同通过存储腔室进入缓冲腔室2中，之后再随着转速提升至1280rpm，第一毛细阀3打开，胰蛋白酶液和细胞组织液的混合液通过第一毛细阀3，然后转速降低至0，混合液通过虹吸通道6和变截面通道4，然后提升转速至800rpm，在离心力作用下，混合液进入混合通道7中进行充分的混合反应。然后转速再降低至0，混合液通过虹吸通道进入提纯分离单元5中，然后再次提升转速至800rpm进行分离提取。一定时间后，分离提纯结束，提升转速至1000rpm，第二毛细阀503打开，其沉淀部分即单细胞液进入虹吸通道，然后降低转速至0，单细胞液通过虹吸通道进入下一级系统。
[0072]
(2)细胞裂解：步骤(1)得到的单细胞液进入下一级系统，然后提升转速至1400rpm，细胞裂解液通过存储腔室1与细胞裂解液共同进入缓冲腔室2中，之后再随着转速提升至1550rpm，第一毛细阀3打开，单细胞液和细胞裂解液的混合液通过第一毛细阀3，然后转速降低至0，混合液通过虹吸通道6和变截面通道4，然后提升转速至800rpm，在离心力作用下，混合液进入混合通道7中进行充分的混合反应。然后转速再降低至0，混合液通过虹吸通道进入提纯分离单元5中，然后再次提升转速至800rpm进行分离提取。一定时间后，分
离提纯结束，提升转速至1100rpm，第二毛细阀503打开，其沉淀部分即细胞裂解物液进入虹吸通道，然后降低转速至0，细胞裂解物液通过虹吸通道进入下一级系统。
[0073]
(3)提取dna：步骤(2)得到的细胞裂解物液进入下一级系统，然后提升转速至1690rpm，dna沉淀液通过存储腔室1与细胞裂解物液共同进入缓冲腔室2中，之后再随着转速提升至1800rpm，第一毛细阀3打开，dna沉淀液和细胞裂解物液的混合液通过第一毛细阀3，然后转速降低至0，混合液通过虹吸通道6和变截面通道4，然后提升转速至800rpm，在离心力作用下，混合液进入混合通道7中进行充分的混合反应。然后转速再降低至0，混合液通过虹吸通道进入提纯分离单元5中，然后再次提升转速至800rpm进行分离提取。一定时间后，分离提纯结束，提升转速至1100rpm，第二毛细阀503打开，其沉淀部分即dna沉淀物液进入虹吸通道，然后降低转速至0，dna沉淀物液通过虹吸通道进入下一级系统。
[0074]
(4)dna收集：步骤(3)得到的dna沉淀物液进入下一级，然后提高转速至2500rpm，该级的存储腔室1中的dna洗涤液进入缓冲腔室2洗涤dna沉淀物液，最终dna进入收集腔室8中，降低转速至0，完成整个dna提取流程。
[0075]
在本发明的一项具体实施中，还可以在第二级系统之前增加一步预处理的过程，可根据实际需求设计。图9中也给出了执行第一级系统的控制参数及流程：
[0076]
转速增加至950rpm，存储腔室1打开，流体进入缓冲腔室2中，之后再随着转速提升至1050rpm，第一毛细阀3打开，流体通过第一毛细阀3，然后转速降低至0，流体通过虹吸通道6和变截面通道4，然后提升转速至800rpm，在离心力作用下，流体进入混合通道7中进行充分的混合反应。然后转速再降低至0，混合液通过虹吸通道进入提纯分离单元5中，然后再次提升转速至800rpm进行分离提取。一定时间后，分离提纯结束，提升转速至1000rpm，第二毛细阀503打开，其沉淀部分的分层产物进入虹吸通道，然后降低转速至0，分层产物通过虹吸通道进入下一级系统。
[0077]
本领域的技术人员应理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。