一种检测多种牛乳腺炎病原的引物对和探针组合及其应用

1.本发明属于病原检测领域，涉及一种用于检测牛乳腺炎病原的引物对和探针组合，本发明还涉及所述引物对和探针组合的应用以及一种非诊断目的检测多种牛乳腺炎病原的taqman实时荧光定量pcr方法。


背景技术：

2.牛乳腺炎是制约全球奶牛养殖业发展的最重要疾病之一，不仅造成巨大经济损失，包括牛奶产量减少、牛奶质量下降以及额外的治疗和处理成本，治疗时抗生素滥用及多耐药菌产生严重威胁公共卫生安全威胁。在全球范围内，奶牛临床型乳腺炎发病率约为30％，亚临床型乳腺炎患病率为15％-75％(molineri et al.,prev vet med,2021,188:105261)。引起牛乳腺炎的病原菌种类较多，在我国，金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌，它们引起了绝大多数的牛乳腺炎(song x et al.,veterinary microbiology,2020,247:108757；liu y et al.,prev vet med,2020,182:105106)。准确鉴定牛乳腺炎病原菌，有利于早期发现与及时治疗。
3.目前国内奶牛乳腺炎发病率高，且缺乏准确高效诊断方法。常用的微生物培养法被认为是“金标准”，但是存在耗时长(5-7天)、准确度低及对操作人员要求高的缺点；血清学检测方法如elisa、免疫胶体金技术等则存在诊断“窗口期”，动物机体产生相应的检测靶标需要一定周期；普通pcr应用最为广泛，但扩增后需要电泳及测序才能得到结果。
4.由于在奶牛乳腺炎诊断领域缺乏单管多重病原一次性检测方法，而荧光定量pcr已广泛用于动物病原检测，基于该技术可实现多病原、结果可视化检测。因此本研究将检测临床需要与方法结合，建立一种可以检测牛乳腺炎七种主要病原的taqman荧光定量pcr方法，填补实验室奶牛乳腺炎病原检测以及临床应用的空白，具有较大的经济效益与社会效益。


技术实现要素：

5.本发明为解决目前牛乳腺炎病原检测操作复杂的难题，提供了一种检测多种牛乳腺炎病原的引物对和探针组合，本发明提供的引物对和探针组合能够对临床奶样或其它样本中的金黄色葡萄球菌、链球菌(无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌)、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌同时进行检测，不仅能提高检测效率，而且还具有较高的灵敏度和特异性。
6.本发明提供的引物对和探针组合分别针对金黄色葡萄球菌rpob基因、链球菌tuf基因、牛支原体oppd/f基因、产色葡萄球菌soda基因、大肠杆菌79号基因进行设计，其中，
7.针对金黄色葡萄球菌rpob基因的引物对序列如seq id no:1-2所示，探针序列如seq id no:3所示；
8.针对链球菌tuf基因的引物对序列如seq id no:4-5所示，探针序列如seq id no:6所示；
9.针对牛支原体oppd/f基因的引物对序列如seq id no:7-8所示，探针序列如seq id no:9所示；
10.针对产色葡萄球菌soda基因的引物对序列如seq id no:10-11所示，探针序列如seq id no:12所示；
11.针对大肠杆菌79号基因的引物对序列如seq id no:13-14所示，探针序列如seq id no:15所示。
12.其中，所述探针的5
′
端标记报告基团，3
′
端标记猝灭基团。
13.优选地，用于检测金黄色葡萄球菌的探针5
′
端标记的报告基团是fam，3
′
端标记的猝灭基团是bhq1；用于检测链球菌的探针5
′
端标记的报告基团是vic，3
′
端标记的猝灭基团是bhq1；用于检测牛支原体的探针5
′
端标记的报告基团是cy5，3
′
端标记的猝灭基团是bhq2；用于检测产色葡萄球菌的探针5
′
端标记的报告基团是texas red，3
′
端标记的猝灭基团是bhq2；用于检测大肠杆菌的探针5
′
端标记的报告基团是cy5.5，3
′
端标记的猝灭基团是bhq3。
14.本发明的另一目的是提供所述的引物对和探针组合在检测多种牛乳腺炎病原中的应用，所述多种牛乳腺炎病原是金黄色葡萄球菌、链球菌、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌。该应用不仅能对牛乳腺炎进行疾病诊断，而且也能用于非诊断目的的牛乳腺炎病原实验室筛查、鉴定，以及食品安全检查等。
15.其中，所述链球菌是无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌。
16.本发明的第三个目的是提供一种检测多种牛乳腺炎病原的试剂盒，该试剂盒包含以上所述的引物对和探针组合。
17.本发明的第四个目的是提供一种非诊断目的检测多种牛乳腺炎病原的taqman实时荧光定量pcr方法，该方法包括以检测样品为模板，加入反应液、超纯水和以上所述的引物对和探针组合并进行pcr扩增的步骤。
18.优选地，所述pcr扩增体系为：2
×
probe pcr master mix 10μl；金黄色葡萄球菌上下游引物终浓度均为450nmol/l、探针终浓度为175nmol/l；链球菌上下游引物终浓度均为450nmol/l、探针终浓度为125nmol/l；牛支原体上下游引物终浓度均为400nmol/l、探针终浓度为175nmol/l；产色葡萄球菌上下游引物终浓度均为400nmol/l、探针终浓度为125nmol/l；大肠杆菌上下游引物终浓度均为400nnol/l、探针终浓度为200nmol/l；模板5μl，ddh2o补足至20μl。
19.优选地，所述pcr扩增程序为，37℃污染消化2min；95℃预变性30s，1个循环；95℃10s，56.7℃退火30s，40个循环。
20.本发明的有益效果是：
21.(1)便利性。本发明可单管一次性对牛乳腺炎7种病原进行检测，不需要分别设计引物进行pcr扩增，而且根据反应后的ct值即可实现病原的定性和定量，不需要再对扩增产物进行电泳检测，因此大幅提高了检测效率。
22.(2)灵敏度。本发明建立的方法对重组质粒的检测灵敏度分别为金黄色葡萄球菌101copies/μl，链球菌101copies/μl，牛支原体102copies/μl，产色葡萄球菌101copies/μl，大肠杆菌101copies/μl。通过与普通pcr方法比较，本发明建立的方法检测灵敏度更高。
23.(3)特异性。本发明建立的方法进行qpcr扩增时，金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停
乳链球菌、乳房链球菌、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌都能得到特异性荧光曲线，而表皮葡萄球菌、无乳支原体、肺炎克雷伯菌、地衣芽孢杆菌、化脓隐秘杆菌、弯曲芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、格氏乳球菌的阳性核酸不能产生扩增曲线，与其他细菌没有交叉反应性。
附图说明
24.图1是本发明建立的方法对金黄色葡萄球菌的敏感性。
25.图2是本发明建立的方法对链球菌的敏感性。
26.图3是本发明建立的方法对牛支原体的敏感性。
27.图4是本发明建立的方法对产色葡萄球菌的敏感性。
28.图5是本发明建立的方法对大肠杆菌的敏感性。
29.图6是普通pcr方法对五种牛乳腺炎病原检测的敏感性，图中，a为金黄色葡萄球菌，b为链球菌，c为牛支原体，d为产色葡萄球菌，e为大肠杆菌，m为分子量大小，1-7分别为1
×
105copies/μl-1
×
100copies/μl共6个梯度和空白对照。
30.图7是本发明的检测特异性。
具体实施方式
31.下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
32.实施例1引物序列和优化
33.根据ncbi公布的金黄色葡萄球菌的rpob基因(yp_499096.2)，无乳链球菌的tuf基因(nz_ap018400.1)，牛支原体的oppd/f基因(af130119.1)，产色葡萄球菌的soda基因(aj343945.1)和大肠杆菌的79号基因序列(nz_jadevb010000078.1)设计引物和探针。为了提高基于rpob基因设计探针的特异性，将上游探针第4个碱基改为兼并碱基y；为了实现对无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌三种主要链球菌的检测，对三种链球菌的tuf基因序列进行测定，根据测序序列优化探针和引物，将上游探针第14、16和20个碱基分别改为兼并碱基r、y和w，下游引物第15个碱基改为r。所涉及引物和探针序列见表1，目的片段序列见表2。引物和探针由北京擎科生物科技有限公司合成，使用ddh2o稀释至浓度为10μmol/l，4℃保存备用。
34.表1引物和探针序列
35.[0036][0037]
表2目的片段序列
[0038][0039]
实施例2检测条件的优化
[0040]
以浓度为1
×
106copies/μl的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌重组质粒作为模板,采用20μl反应体系，2
×
probe pcr master mix 10μl，将上、下游引物和探针引物终浓度在100nmol/l～500nmol/l之间调整，模板5μl(5种重组质粒各1μl)，ddh2o补足至20μl。反应程序为：37℃污染消化2min；95℃预变性30s，1个循环；95℃10s，50℃-65℃退火30s，40个循环。根据荧光定量pcr扩增曲线和ct值确定最佳引物探针浓度和退火温度。
[0041]
优化后的反应条件为：2
×
probe pcr master mix 10μl，金黄色葡萄球菌上下游引物终浓度均为450nmol/l；链球菌上下游引物终浓度均为450nmol/l；牛支原体上下游引物终浓度均为400nmol/l；产色葡萄球菌上下游引物终浓度均为400nmol/l；大肠杆菌上下游引物终浓度均为400nnol/l。金黄色葡萄球菌探针终浓度为175nmol/l；链球菌探针终浓度为125nmol/l；牛支原体探针终浓度为175nmol/l；产色葡萄球菌探针终浓度为125nmol/l；大肠杆菌探针终浓度为200nmol/l；模板5μl，ddh2o补足至20μl，反应程序为：37℃污染消化2min；95℃预变性30s，1个循环；95℃10s，56.7℃退火30s，40个循环。
[0042]
实施例3检测方法的标准曲线、灵敏性、特异性、重复性
[0043]
(1)标准曲线：以1
×
108copies/μl-1
×
104copies/μl 5个梯度浓度的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、牛支原体、产色葡萄球菌和大肠杆菌重组质粒作模板(在同一体系中加入相同浓度的5种重组质粒各1μl，共5μl)，按照已优化好的五重taqman实时荧光定量pcr反应条件进行扩增，建立标准曲线。
[0044]
本方法以质粒拷贝数的lg(x)值为横坐标，ct值为纵坐标建立标准曲线，金黄色葡萄球菌标准曲线：y＝-3.358x+40.003，r2＝0.998，扩增效率e＝98.5％；链球菌属标准曲线：y＝-3.309x+41.426，r2＝0.998，扩增效率e＝100.6％；产色葡萄球菌标准曲线y＝-3.410x+40.713，r2＝0.998，扩增效率e＝96.5％；牛支原体标准曲线为：y＝-3.322x+42.031，r2＝0.998，扩增效率e＝100％；大肠杆菌标准曲线为：y＝-3.473x+41.651，r2＝0.998，扩增效率e＝94％。
[0045]
(2)灵敏性：将本发明建立的方法与普通pcr方法进行灵敏性比较，比较方法如下：以1
×
105copies/μl-1
×
100copies/μl共6个梯度的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、牛支原体、产色葡萄球菌和大肠杆菌重组质粒作模板，双蒸水为阴性对照模板，按照已优化好的五重taqman实时荧光定量pcr反应条件进行扩增，并与使用本方法中的引物进行普通pcr扩增结果进行对比。
[0046]
本发明具有较高的灵敏性，能够检测的最低拷贝数为金黄色葡萄球菌101copies/μl、链球菌101copies/μl、牛支原体102copies/μl、产色葡萄球菌101copies/μl、大肠杆菌101copies/μl，敏感性试验结果见图1-5。而普通pcr方法能够检测的最低拷贝数为金黄色葡萄球菌103copies/μl、链球菌104copies/μl、牛支原体103copies/μl、产色葡萄球菌103copies/μl、大肠杆菌103copies/μl，敏感性试验结果见图6。
[0047]
(3)特异性：当反应体系中加入金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌基因组dna作为模板，采用本技术建立的方法进行实时荧光定量pcr扩增时，结果得到特异性荧光曲线。表皮葡萄球菌、无乳支原体、肺炎克雷伯菌、地衣芽孢杆菌、化脓隐秘杆菌、弯曲芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、格氏乳球菌的阳性核酸的扩增结果显示，这8种细菌的dna、阴性对照以及空白对照均不能产生扩增曲线，呈现阴性结果，见图7，表明本技术建立的实时荧光定量pcr法具有良好的特异性。图7中，1为金黄色葡萄球菌；2-1为无乳链球菌；2-2为停乳链球菌；2-3为乳房链球菌；3为牛支原体；4为产色葡萄球菌；5为大肠杆菌；6为表皮葡萄球菌；7为无乳支原体；8为肺炎克雷伯菌；9为地衣芽孢杆菌；10为化脓隐秘杆菌；11为弯曲芽孢杆菌；12为蜡样芽孢杆菌；13为格氏乳球菌；14为空白对照。
[0048]
(4)重复性：分别以浓度为1
×
108copies/μl-1
×
105copies/μl的金黄色葡萄球菌、
无乳链球菌、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌重组质粒作为模板，分为4个样本同时检测。在第4天、第8天重复检测保存于-20℃的模板，通过计算ct值的平均值
±
标准偏差(mean
±
sd)和变异系数(cv)验证本技术方法的组内重复性和组间重复性，重复性试验结果表明本方法的组内和组间变异系数均小于3％，详细数据如表3所示。
[0049]
表3重复性试验
[0050][0051][0052]
实施例4牛乳腺炎病原的临床检测
[0053]
从奶牛养殖场收集临床样本，收集方法如下：1.标记采样用离心管，包括日期、牛号、乳区及编号；2.对奶牛乳区进行清洁并挤出前三把奶；3.对乳头进行消毒，使用清洁纸巾吸干乳头；4.用酒精棉球擦拭乳头，待干后采集奶样。将采集到的40份临床奶样使用本方
法检测，具体操作如下：将装有奶样的离心管上下颠倒混匀，取5μl奶样直接加入配好的反应体系中，放入cfx 96荧光定量pcr仪，扩增结束后根据扩增曲线和ct值判定奶样中细菌种类。同时使用细菌分离鉴定法检测，将收集的临床样本取100μl分别以原液、稀释10倍、100倍、1000倍涂于脑心浸液固体培养基，置入37℃，5％co2培养箱内，培养24h，根据每个平板上菌落形态、大小，挑取单菌落进行纯化，两次纯化后挑取单菌落进行革兰氏染色，确定形态、大小全部一致后，转接液体培养基培养8h-12h，待培养基浑浊后提取细菌dna，随后进行细菌16s rdna扩增及测序鉴定，使用blast数据库进行序列比对鉴定细菌种类。将本方法的检测结果与细菌分离鉴定法进行对比，结果显示符合率100％，证明本方法可适用于临床检测。详细结果如表4所示。
[0054]
表4对临床样本的检测结果
[0055]
[0056][0057]
注：本检测方法判定标准为：ct值＜35判定为阳性，35＜ct值＜40判定为可疑，ct值≥40则为阴性。
[0058]
综上，本技术建立的实时荧光定量pcr检测方法灵敏度高、特异性好，与其他细菌无交叉反应；适用于实验室对牛乳腺炎七种主要病原的的常规检测，可为金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、牛支原体、产色葡萄球菌、大肠杆菌感染引起各种疾病的快速诊断提供必要的技术支撑。