一种复合发酵菌剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及发酵技术领域领域，具体涉及一种复合发酵菌剂及其制备方法。


背景技术：

2.在农业生产和人们日常生活中，每年都要产生大量的植物秸秆和餐厨垃圾等各种有机物垃圾，目前的处理方法是将植物秸秆点火烧掉或将餐厨垃圾直接倒掉，不仅破坏生态环境，造成环境污染，同时也浪费了宝贵的资源。有机物腐熟剂能使农林废弃物和餐厨垃圾等有机废弃物快速腐熟，使有机废弃物中所含的有机质及磷、钾等元素成为植物生长所需的营养，提高土壤有机质，减少化肥使用量，改善作物品质。
3.利用微生物的广泛适应性和多功能性来转化腐熟农林废弃物、餐厨垃圾已经日益重要，具有广阔的应用前景。目前，有机废弃物的快速腐熟返田已成为国内外废弃物肥料化利用的热点，而研制开发高效的有机废弃物快速腐熟菌剂是其高效利用的关键。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明提供一种复合发酵菌剂及其制备方法。
5.本发明的目的采用以下技术方案来实现：
6.一种复合发酵菌剂的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)单菌种培养
8.将枯草芽孢杆菌、乳酸菌、放线菌、苏云金杆菌、荧光假单胞菌和酵母菌分别进行发酵培养，发酵完成后每种菌株的发酵液中有效活菌数均应大于2.0
×
109cfu/ml；
9.(2)复合培养
10.将分别发酵培养得到的枯草芽孢杆菌、乳酸菌、放线菌、苏云金杆菌、荧光假单胞菌和酵母菌按比混合并进行复合培养；
11.(3)负载
12.在复合培养得到的复合菌液中加入负载载体进行菌体负载，冻干后制得所述复合发酵菌剂。
13.优选的，复合培养步骤中，按有效活菌数计，所述枯草芽孢杆菌、乳酸菌、放线菌、苏云金杆菌、荧光假单胞菌和酵母菌的混合比例为(3-4)：(5-7)：(5-10)：(2-3)：(4-6)：10。
14.优选的，所述负载载体的制备方法包括以下步骤：
15.s1、前处理
16.将废弃灭活的酵母菌以饱和盐水漂洗，漂洗完成后加入热的碱性溶液并保温搅拌1-30min，分离所述酵母菌，以清水漂洗至中性，将漂洗后的酵母菌按1-3g/100ml的料液比再次分散在去离子水中，加入酸溶液调节ph至1-2，得到悬液，在搅拌条件下滴加正硅酸乙酯，滴加完成后在30-40℃下保温搅拌反应0.5-1h，分离所述酵母菌并依次以无水乙醇和去离子水洗涤，得到前处理的酵母菌；
17.其中，所述悬液与所述正硅酸乙酯的混合体积比为(30-40)：1；
18.s2、中层制备
19.将所述前处理的酵母菌依次分散在碳酸钠溶液、氯化钙溶液和磷酸钾溶液中，分别搅拌反应1-2h，分离所述酵母菌并干燥，得到二次改性的酵母菌；
20.其中，所述酵母菌的分散料液比为1-2g/100ml，所述碳酸钠溶液、氯化钙溶液和磷酸钾溶液的浓度分别为0.5-1mol/l、2-3mol/l、2-3mol/l；
21.s3、外层制备
22.称取peo-ppo-peo三嵌段共聚物并溶解在无水乙醇中，分别加入氨水和正硅酸乙酯，充分混合后加入所述二次改性的酵母菌并分散，得到分散液，将所述分散液在50-60℃下保温搅拌反应1-2h，分离不溶物并分别以无水乙醇和水洗涤，干燥制得前体材料；
23.其中，所述peo-ppo-peo三嵌段共聚物的溶解浓度在30-40mg/ml，所述无水乙醇与所述氨水、所述正硅酸乙酯的混和体积比为100：(6-7)：(18-20)；所述氨水的质量浓度在1-3％；
24.s4、热处理
25.在惰性气体保护下，将所述前体材料进行低温碳化，低温碳化完成后依次以酸溶液和去离子水洗涤，干燥，所述低温碳化的温度为300-400℃，碳化升温速率为5-10℃/min，低温碳化时间为2-5h；
26.s5、二次热处理
27.在惰性气体保护下，将低温碳化的干燥产物进行高温碳化，所述高温碳化的温度为600-1200℃，碳化升温速率为5-10℃/min，高温碳化时间为2-4h。
28.优选的，按重量份数计，所述枯草芽孢杆菌的培养基组成为：黄豆粉8-16份、玉米粉4-8份、葡萄糖5-12份、鱼粉2-8份、蛋白胨2-6份、碳酸钙4-8份、氯化钙0.1-1份、磷酸二氢钾0.2-0.8份、磷酸氢二钾0.2-0.8份、氢氧化钠0.1-0.3份、硫酸锰0.1-0.5份，氯化钠2-5份、吐温1-2份，去离子水溶解稀释。
29.优选的，按重量份数计，所述乳酸菌的培养基组成为：葡萄糖25-50份、酵母浸粉10-45份、碳酸钙3-10份、可溶性淀粉10-50份、硫酸镁0.1-0.5份、醋酸钠0.1-0.3份、柠檬酸铵0.1-0.3份、磷酸氢二钾0.2-0.8份、硫酸锰0.1-0.5份、吐温1-2份，去离子水溶解稀释。
30.优选的，按重量份数计，所述放线菌的培养基组成为：酵母膏30-100份、蛋白胨10-70份、蔗糖40-120份、氯化钙0.5-2份、硫酸锌0.05-0.4份、硫酸铜0.001-0.03份、硫酸亚铁0.001-0.03份，去离子水溶解稀释。
31.优选的，按重量份数计，所述苏云金杆菌的培养基组成为：葡萄糖4-8份、酵母粉2-4份、可溶性淀粉2-6份、蛋白胨1-4份、硫酸镁0.005-0.02份、硫酸锰0.005-0.01份、磷酸二氢钾0.1-0.3份、氯化钠0.3-0.8份，去离子水溶解稀释。
32.优选的，按重量份数计，所述荧光假单胞菌的培养基组成为：蔗糖30-50份、酵母膏4-8份、硫酸铵4-6份、磷酸氢二钾0.3-0.7份、硫酸镁0.05-0.1份、硫酸亚铁0.0005-0.001份、氯化钙0.01-0.03份、氯化钠0.1-0.3份，去离子水溶解稀释。
33.本发明的另一目的在于提供一种复合发酵菌剂，所述复合发酵菌剂由前述制备方法制备得到。
34.本发明的有益效果为：
35.(1)本发明公开了一种包括枯草芽孢杆菌、乳酸菌、放线菌、苏云金杆菌、荧光假单
胞菌和酵母菌的复合发酵菌剂，通过复合多种具有适应性协同作用和良好耐温性的菌种进行发酵，各菌种齐全、配比合理，加入堆肥物料后可快速形成优势菌群并大量生长繁殖，产生多种生物活性酶参与腐熟分解过程，促进菌剂的发酵效率，提高成品品质。
36.(2)复合菌剂在保存过程中易受环境条件影响其发酵活性，其稳定性不高，难以长期有效保存，甚至发生灭活失效；本发明通过载体负载，对复合发酵菌种起到良好的稳定作用，进一步的，本发明以废弃酵母为原料，通过正硅酸乙酯在酵母表面进行硅化处理以形成一层二氧化硅层再依次形成钙化层，然后再通过二次硅化生成外层二氧化硅层，最后通过热处理和溶剂处理进行碳化并去除层间模板，得到由生物炭和二氧化硅组成的c-si-si多壳层负载载体，一方面，相比常规多孔载体，以酵母菌为生物质原料的碳化产物与二氧化硅的组合具有更高的生物亲和性，多壳层载体结构为菌种担载提供了更多的负载点，提高了载体的单位负载量，同时也为所述复合菌种提供隔离缓冲作用，不仅提高其环境稳定性，同时为复合菌种的起始增殖提供良好的增殖环境，避免直接接种复合菌种适应期过长的问题，促进菌种的快速生长繁殖，进一步提高菌剂的发酵效率。
具体实施方式
37.结合以下实施例对本发明作进一步描述。
38.实施例1
39.一种复合发酵菌剂，其制备方法包括以下步骤：
40.(1)单菌种培养
41.将枯草芽孢杆菌、乳酸菌、放线菌、苏云金杆菌、荧光假单胞菌和酵母菌分别进行发酵培养，发酵完成后每种菌株的发酵液中有效活菌数均应大于2.0
×
109cfu/ml；
42.按重量份数计，所述枯草芽孢杆菌的培养基组成为：黄豆粉8-16份、玉米粉4-8份、葡萄糖5-12份、鱼粉2-8份、蛋白胨2-6份、碳酸钙4-8份、氯化钙0.1-1份、磷酸二氢钾0.2-0.8份、磷酸氢二钾0.2-0.8份、氢氧化钠0.1-0.3份、硫酸锰0.1-0.5份，氯化钠2-5份、吐温1-2份，去离子水溶解稀释；
43.按重量份数计，所述乳酸菌的培养基组成为：葡萄糖25-50份、酵母浸粉10-45份、碳酸钙3-10份、可溶性淀粉10-50份、硫酸镁0.1-0.5份、醋酸钠0.1-0.3份、柠檬酸铵0.1-0.3份、磷酸氢二钾0.2-0.8份、硫酸锰0.1-0.5份、吐温1-2份，去离子水溶解稀释；
44.按重量份数计，所述放线菌的培养基组成为：酵母膏30-100份、蛋白胨10-70份、蔗糖40-120份、氯化钙0.5-2份、硫酸锌0.05-0.4份、硫酸铜0.001-0.03份、硫酸亚铁0.001-0.03份，去离子水溶解稀释；
45.按重量份数计，所述苏云金杆菌的培养基组成为：葡萄糖4-8份、酵母粉2-4份、可溶性淀粉2-6份、蛋白胨1-4份、硫酸镁0.005-0.02份、硫酸锰0.005-0.01份、磷酸二氢钾0.1-0.3份、氯化钠0.3-0.8份，去离子水溶解稀释；
46.按重量份数计，所述荧光假单胞菌的培养基组成为：蔗糖30-50份、酵母膏4-8份、硫酸铵4-6份、磷酸氢二钾0.3-0.7份、硫酸镁0.05-0.1份、硫酸亚铁0.0005-0.001份、氯化钙0.01-0.03份、氯化钠0.1-0.3份，去离子水溶解稀释；
47.(2)复合培养
48.将分别发酵培养得到的枯草芽孢杆菌、乳酸菌、放线菌、苏云金杆菌、荧光假单胞
菌和酵母菌按比混合并进行复合培养；冻干后制得所述复合发酵菌剂；
49.按有效活菌数计，所述枯草芽孢杆菌、乳酸菌、放线菌、苏云金杆菌、荧光假单胞菌和酵母菌的混合比例为3.5：5.8：7：2.4：5.6：10。
50.实施例2
51.一种复合发酵菌剂，其制备方法包括以下步骤：
52.(1)单菌种培养
53.将枯草芽孢杆菌、乳酸菌、放线菌、苏云金杆菌、荧光假单胞菌和酵母菌分别进行发酵培养，发酵完成后每种菌株的发酵液中有效活菌数均应大于2.0
×
109cfu/ml；发酵培养基同实施例1；
54.(2)复合培养
55.将分别发酵培养得到的枯草芽孢杆菌、乳酸菌、放线菌、苏云金杆菌、荧光假单胞菌和酵母菌按比混合并进行复合培养；
56.按有效活菌数计，所述枯草芽孢杆菌、乳酸菌、放线菌、苏云金杆菌、荧光假单胞菌和酵母菌的混合比例为3.5：5.8：7：2.4：5.6：10；
57.(3)负载
58.在复合培养得到的复合菌液中加入负载载体进行菌体负载，冻干制得所述复合发酵菌剂；
59.所述负载载体的制备方法包括以下步骤：
60.s1、前处理
61.将废弃灭活的酵母菌以饱和盐水漂洗，漂洗完成后加入热的碱性溶液并保温搅拌10min，分离所述酵母菌，以清水漂洗至中性，将漂洗后的酵母菌按2g/100ml的料液比再次分散在去离子水中，加入酸溶液调节ph至1-2，得到悬液，在搅拌条件下滴加正硅酸乙酯，滴加完成后在30-40℃下保温搅拌反应0.5-1h，分离所述酵母菌并依次以无水乙醇和去离子水洗涤，得到前处理的酵母菌；
62.其中，所述悬液与所述正硅酸乙酯的混合体积比为35：1；
63.s2、中层制备
64.将所述前处理的酵母菌依次分散在碳酸钠溶液、氯化钙溶液和磷酸钾溶液中，分别搅拌反应1-2h，分离所述酵母菌并干燥，得到二次改性的酵母菌；
65.其中，所述酵母菌的分散料液比为2g/100ml，所述碳酸钠溶液、氯化钙溶液和磷酸钾溶液的浓度分别为0.6mol/l、2mol/l、2mol/l；
66.s3、外层制备
67.称取peo-ppo-peo三嵌段共聚物并溶解在无水乙醇中，分别加入氨水和正硅酸乙酯，充分混合后加入所述二次改性的酵母菌并分散，得到分散液，将所述分散液在50-60℃下保温搅拌反应1-2h，分离不溶物并分别以无水乙醇和水洗涤，干燥制得前体材料；
68.其中，所述peo-ppo-peo三嵌段共聚物的溶解浓度在40mg/ml，所述无水乙醇与所述氨水、所述正硅酸乙酯的混和体积比为100：7：20；所述氨水的质量浓度在2％；
69.s4、热处理
70.在惰性气体保护下，将所述前体材料进行低温碳化，低温碳化完成后依次以酸溶液和去离子水洗涤，干燥，所述低温碳化的温度为350℃，碳化升温速率为5-10℃/min，低温
碳化时间为4h；
71.s5、二次热处理
72.在惰性气体保护下，将低温碳化的干燥产物进行高温碳化，所述高温碳化的温度为900℃，碳化升温速率为5-10℃/min，高温碳化时间为2h。
73.实施例3
74.一种复合发酵菌剂，其制备方法同实施例2，区别在于，所述负载载体为轻质碳酸钙。
75.实施例4
76.一种复合发酵菌剂，其制备方法同实施例2，区别在于，所述负载载体为聚氨酯海绵。
77.实验例
78.1、对实施例2-4所述复合发酵菌剂的负载量和稳定性进行测定，以载体负载前后的质量增加百分比作为负载量，以不同放置时间的活菌负载数量表征稳定性，测定结果如下：
[0079][0080]
2、以商业化的em菌剂为对比，测定实施例1-4所述复合菌剂对农林废弃物的的腐熟时间，所述农林废弃物包括农林杂草、废弃火龙果、火龙果皮和火龙果枝条，所述复合发酵菌剂按相同活菌量加入，以发酵物料在降温阶段降至35℃时作为发酵终点，测定其发酵时间，测定结果如下：
[0081] 实施例1实施例2实施例3实施例4对比例发酵时间/d2520232232
[0082]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。