一种生物絮凝剂及其制备方法与在蓝藻治理中的应用

1.本发明涉及微生物学、生物工程发酵技术和环境领域，具体是涉及一种生物絮凝剂及其制备方法与在蓝藻治理中的应用。


背景技术：

2.蓝藻又称蓝绿藻，是一种最原始、最古老的藻类植物。其分布十分广泛，遍及世界各地。在一些营养丰富的水体中，有些蓝藻常于夏季大量繁殖，并在水面形成一层蓝绿色而有腥臭味的浮沫，称为“水华”。大规模的蓝藻暴发，不仅会引起水质恶化，严重时耗尽水中氧气而造成鱼类死亡，还会改变湖泊的群落结构，降低生物多样性。
3.藻类水华的暴发与水体富营养化是密不可分的。目前，全球范围内大约有60％的湖泊处于不同程度富营养化状态，在我国，2018年监测的不同地区107个淡水湖泊中，富营养、中营养和贫营养湖泊的比例分别为29％、61.7％和0.3％。因此蓝藻治理变得刻不容缓。蓝藻分布在水中，需要将其絮凝成团，才能更好地进行打捞。专利《混合絮凝剂及用其治理蓝藻水华的方法》公开了一种混合絮凝剂及用其治理蓝藻水华的方法，该混合絮凝剂由三级海泡石绒、滑石和硅藻土混合而成，混合絮凝剂成本低廉、絮凝效果良好，但是该成分中的滑石使用过多，对环境具有一定的危害。
4.专利《一种利用微生物絮凝剂和水解盐治理蓝藻的方法》公开了一种利用微生物絮凝剂与水解盐治理蓝藻的方法。该方法是把胶质芽孢杆菌制得的微生物絮凝剂和水解盐加入到蓝藻爆发水体中，微生物絮凝剂和水解盐协同作用絮凝蓝藻并使蓝藻絮凝体漂浮在液面，絮凝效果良好，但是其中使用到的金属离子对环境并不友好。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提出一种生物絮凝剂及其制备方法，使用阳离子羟乙基纤维素和胞外多糖制作絮凝剂，两者皆具有天然、无毒、可降解的性质，对环境友好。
6.本发明的另一目的在于提出上述一种生物絮凝剂在蓝藻治理中的应用，能够将分散的蓝藻絮凝起来，并且能够在抑制蓝藻活性的同时破坏蓝藻的细胞，不释放蓝藻毒素，净化水体。
7.本发明从土壤中筛选得到一株生产胞外多糖的农杆菌属，其分类学命名为农杆菌属lhzjx.a07(agrobacterium sp.lhzjx.a07)，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：62125，保藏日期为2022年3月17日。保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，邮政编号510070。
8.本发明提出了利用筛选到的农杆菌属发酵出胞外多糖制备所述生物絮凝剂。
9.本发明的目的通过以下技术方案实现。
10.一种生物絮凝剂，包括阳离子羟乙基纤维素以及胞外多糖。所述胞外多糖由分类学命名为农杆菌属lhzjx.a07(agrobacterium sp.lhzjx.a07)发酵产生，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:62125，保藏日期为2022年3月17日。
11.一种生物絮凝剂的制备方法，包括如下步骤：
12.(1)从土壤中分离筛选出一株农杆菌属，经纯化后接入斜面培养基中保存；在无菌的条件下，用无菌水将斜面的菌苔清洗下来，取菌液接种于种子培养基中；30～40℃、125～150r/min培养12～24h；
13.(2)将步骤(1)中培养的种子液接种至发酵培养基中培养，接种量为3％～6％，30～40℃、120～150r/min培养1～5d；
14.(3)将步骤(2)中的发酵液1
×
104～1.6
×
104r/min高速离心，收集上清液即为胞外多糖粗液；
15.(4)对步骤(3)得到的胞外多糖粗液进行浓缩、纯化、干燥后得到胞外多糖；
16.(5)首先将10～30g羟乙基纤维素分散在100ml异丙醇和水的混合液中，搅拌均匀，再加入3～8ml 25wt％naoh溶液，最后加入3～10ml 65wt％3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液，在60℃～70℃下反应2h～8h；反应结束后，用丙酮(分析纯)进行提纯后洗涤、冷冻干燥，过60～100目筛即得阳离子羟乙基纤维素；
17.(6)取步骤(5)制备的阳离子羟乙基纤维素，搅拌均匀后，再加入步骤(4)制备的农杆菌属胞外多糖，搅拌均匀后静置得到所述生物絮凝剂。
18.进一步地，步骤(1)所述种子培养基配方为：蔗糖(4～6g/l)、na2hpo4(1～4g/l)、mgso4·
7h2o(0.2～1g/l)、caco3(0.05～0.15g/l)、fecl3(0.001～0.01g/l)，ph＝6.5～7.5。
19.进一步地，步骤(2)所述发酵培养基配方为：kh2po4(0.1～0.5g/l)、mgso4·
7h2o(0.1～0.5g/l)、caco3(2～5g/l)、caso4(0.05～0.2g/l)、nacl(0.1～0.5g/l)、甘露醇(8～10g/l)、ph＝6.8～7.0。
20.优选的，步骤(1)所述种子培养基配方为：蔗糖(5g/l)、na2hpo4(2g/l)、mgso4·
7h2o(0.5g/l)、caco3(0.1g/l)、fecl3(0.005g/l)，ph＝7.0。
21.优选的，步骤(2)所述发酵培养基配方为：kh2po4(0.2g/l)、mgso4·
7h2o(0.2g/l)、caco3(5g/l)、caso4(0.1g/l)、nacl(0.2g/l)、甘露醇(10g/l)，ph＝6.8。
22.优选的，步骤(2)所述接种量为4％，震荡培养时间为5d。
23.优选的，步骤(3)所述高速离心转速为1.2
×
104r/min，离心时间为10min。
24.进一步地，步骤(4)所述对胞外多糖粗液进行浓缩、纯化、干燥得到胞外多糖，具体包括如下步骤：
25.(a)将胞外多糖粗液用透析袋浓缩后得到胞外多糖浓缩液，所用透析袋的截留量为3～8kda，透析时间为48～72h；将胞外多糖浓缩液加入乙醇(乙醇的质量分数为95％～100％，胞外多糖浓缩液与乙醇的体积比为1:2～1:6)，使用磁力搅拌器匀速搅拌5～10min后，静置12～24h，1
×
104～1.6
×
104r/min离心，弃上清液，收集沉淀；
26.(b)向步骤(a)中收集到的沉淀中加入步骤(a)胞外多糖浓缩液1/3体积的纯水，37～45℃水浴溶解20～60min，离心收集上清液；
27.(c)将步骤(b)收集的上清液加入乙醇(乙醇的质量分数为95％～100％，上清液与乙醇的体积比为1:2～1:6)，使用磁力搅拌器匀速搅拌5～10min后，静置12～24h，1
×
104～1.6
×
104r/min离心，弃上清液，收集沉淀、0～4℃下冷冻干燥、过60～100目筛即获得农杆菌属胞外多糖。
28.优选的，步骤(a)和步骤(c)所述乙醇为95％乙醇；步骤(a)所述胞外多糖浓缩液与乙醇的体积比为1:3；步骤(c)所述上清液与乙醇的体积比为1:3。
29.优选的，步骤(c)所述过筛目数为80目。
30.本发明的生物絮凝剂配方为：包括上述方法制备的阳离子羟乙基纤维素0.20g/l～1g/l，以及农杆菌属胞外多糖20mg/l～400mg/l。
31.进一步地，所述生物絮凝剂的最佳配方为：阳离子羟乙基纤维素的含量为20mg/l、农杆菌属胞外多糖的含量为177mg/l。
32.本发明提供一种上述方法制备得到的生物絮凝剂在蓝藻治理中的应用。
33.与现有技术相比，本发明的有益效果表现在：
34.(1)本发明使用自发酵的胞外多糖、自制备的阳离子羟乙基纤维素即可制备出生物絮凝剂，所得生物絮凝剂能够使分散在水体中的蓝藻絮凝成团，同时具有抑制蓝藻生长的作用并且悬浮的蓝藻不会释放毒素。
35.(2)本发明利用胞外多糖和阳离子羟乙基纤维素制作蓝藻絮凝剂，两者皆为天然的、低毒的、可降解的多糖，对水环境没有危害。
36.(3)将本发明的生物絮凝剂用于蓝藻治理，蓝藻的絮凝率高达99.8％；同时，对铜绿微囊藻的叶绿素清除率达73％。
附图说明
37.图1为本发明从土壤中筛选出的农杆菌属菌株的革兰氏染色显微照片；
38.图2为本发明从土壤中筛选出的农杆菌属菌株的16s rdna序列构建所得的系统进化树图；
39.图3为实施例1所得的农杆菌属胞外多糖gpc图；
40.图4为实施例2所得的农杆菌属胞外多糖gpc图；
41.图5为实施例3所得的农杆菌属胞外多糖gpc图；
42.图6为农杆菌属胞外多糖和阳离子羟乙基纤维素的安全性评价结果；
43.图7为阳离子羟乙基纤维素对铜绿微囊藻的叶绿素清除率结果；
44.图8为阳离子羟乙基纤维素浓度为250mg/l时，不同含量农杆菌属胞外多糖对蓝藻絮凝率结果；
45.图9为农杆菌属胞外多糖浓度为177mg/l时，不同含量阳离子羟乙基纤维素对蓝藻絮凝率结果。
具体实施方式
46.以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。
47.1.菌株的分离与筛选：
48.(1)菌体富集：取1g华南理工大学土壤加入营养肉汤培养基中(装液量：70ml培养基/300ml三角瓶)，在80℃条件下水浴加热20min，摇床震荡培养24h(30℃，150r/min)。
49.(2)初筛：取步骤(1)中的富集液1ml加入9ml无菌水中获得10-1
样品稀释液，如此方法依次得到10-1
、10-2
、10-3
、
…
、10-9
、10-10
不同梯度稀释液。各梯度稀释液分别取0.1ml涂布
于硅酸盐平板中，在37℃的恒温条件下培养24h。
50.(3)纯化：挑选粘稠透明的菌株至对应平板，进行稀释涂布后获得单个菌落；将平板中的单个菌落接入斜面培养基中保存。
51.(4)复筛：将分离纯化得到的菌株接种到硅酸盐液体培养基中(装液量：70ml培养基/300ml三角瓶)，在37℃的恒温条件下，摇床震荡培养基发酵72h。当培养基黏度升高后，采用乙醇沉淀法测定胞外多糖的含量。
52.乙醇沉淀法具体实施方法如下：取步骤(3)中黏度升高的发酵液，1.2
×
103r/min离心10min，取上清液加入95％乙醇(v:v＝1:3)，使用振荡器混合均匀后，发酵液-乙醇混合
53.1.2
×
103r/min离心10min，收集沉淀，加入热水溶解后离心，取上清液进行二次乙醇沉淀，离心收集沉淀，烘干研磨过80目筛。
54.2.菌株的鉴别与鉴定：
55.(1)革兰氏染色
56.制片：取5ml生理盐水注入农杆菌属斜面试管中，轻晃均匀，取菌液滴一滴在载玻片上，将载玻片标本面朝上，用酒精灯远火慢慢烘干；将载玻片涂标本的背面以钟摆速度通过酒精灯火焰温度最高处3次，将细菌固定在载玻片上。
57.染色：(初染)在已固定的细菌涂片上滴加结晶紫染液数滴室温作用1分钟后，用细流水轻轻冲洗；(媒染)滴加媒染剂碘液数滴，室温作用1分钟，用细流水冲洗；(脱色)滴加95％酒精数滴，轻轻摇动载玻片几秒钟，使之均匀脱色，然后斜持载玻片，使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精无色或稍显淡紫色为止(约需30秒)，立即用细流水将酒精冲掉；(复染)滴加沙黄染液复染室温作用1分钟后，用细流水轻轻冲洗。
58.镜检：标本染色后，晾干。用显微镜观察，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。本发明的菌种革兰氏染色后为紫色(如图1所示)，为革兰氏阳性菌，呈杆状。
59.(2)16s rdna基因测序
60.利用细菌基因组dna提取试剂盒提取复筛获得菌株的dna，以上游引物27f和下游引物1492r pcr扩增16s rrna。将扩增后产物胶回收纯化，送至广州艾基生物技术有限公司进行基因测序。
61.测序结果表明，该菌株的16s rrna基因的长度为1341bp，将测序结果与ncbi数据库进行比对，即可获知与该细菌的16s rdna序列同源性最高的已知序列。根据16s rdna序列相似度分析的结果构建该菌株的系统进化树图(如图2所示)，通过比对可知，与agrobacterium sp.的相似性最高，匹配度达到95.78％。因此，可以认定本发明分离筛选的是农杆菌属，具体命名为农杆菌属lhzjx.a07(agrobacterium sp.lhzjx.a07)。该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：62125，保藏日期为2022年3月17日。
62.实施例1
63.一、农杆菌属胞外多糖的制备：
64.(1)种子培养基制备：配制蔗糖(5g/l)、na2hpo4(2g/l)、mgso4·
7h2o(0.5g/l)、caco3(0.1g/l)、fecl3(0.005g/l)，ph 7.0。
65.发酵培养基制备：配制发酵培养基，kh2po4(0.2g/l)、mgso4·
7h2o(0.2g/l)、caco3(5g/l)、caso4(0.1g/l)、nacl(0.2g/l)、甘露醇(10g/l)，ph＝6.8。分装至3个300ml的三角
瓶，装液量为25％。121℃灭菌20min。
66.(2)菌体活化：农杆菌属斜面从4℃冷藏柜中取出，置于28℃培养箱活化2h。
67.(3)液体发酵：取2支步骤(2)中的菌种斜面，在无菌的条件下，每支斜面用5ml无菌水将斜面的菌苔清洗下来，取菌液接种于步骤(1)制备的种子培养基中，135r/min、37℃震荡培养2d后得到种子液；取种子液以4％的接种量接种于步骤(1)制备的发酵培养基中，130r/min、37℃震荡培养3d。
68.(4)提取农杆菌属胞外多糖：将步骤(3)中的发酵液1
×
104r/min高速离心10min，收集上清液即为胞外多糖粗液；a)将胞外多糖粗液用透析袋浓缩后得到胞外多糖浓缩液；将胞外多糖浓缩液加入乙醇(v:v＝1:3)，使用磁力搅拌器匀速搅拌8min后，静置15h，1
×
104r/min离心，弃上清液，收集沉淀；b)向步骤a)中收集到的沉淀中加入步骤a)胞外多糖浓缩液1/3体积的纯水，37℃水浴溶解30min，离心收集上清液；c)将步骤b)收集的上清液加入乙醇(v:v＝1:3)，使用磁力搅拌器匀速搅拌8min后，静置15h，1
×
104r/min离心，弃上清液，收集沉淀即为农杆菌属胞外多糖。
69.二、阳离子羟乙基纤维素制备：
70.(1)将10g羟乙基纤维素分散在装有100ml异丙醇和水的混合液(v:v＝95:5)的三口烧瓶中，搅拌均匀，再加入3ml 25wt％naoh溶液和8ml 65wt％3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液，在65℃下反应2h。
71.(2)反应结束后，用丙酮(分析纯)对步骤(1)制备好的阳离子羟乙基纤维素进行提纯、洗涤、冷冻干燥、研磨过80目筛。
72.三、取制备好的阳离子羟乙基纤维素，搅拌均匀后，再加入制备好的农杆菌属胞外多糖，搅拌均匀后静置得到所述生物絮凝剂。
73.对本实施例获得的胞外多糖进行gpc液相凝胶色谱检测(如图3所示)，主要有两段波峰，其中波峰1平均分子量为246562(为主波峰)，波峰2平均分子量为580。
74.实施例2
75.一、农杆菌属胞外多糖的制备：
76.(1)种子培养基制备：蔗糖(4g/l)、na2hpo4(1g/l)、mgso4·
7h2o(0.2g/l)、caco3(0.05g/l)、fecl3(0.001g/l)，ph＝6.5。
77.(1)发酵培养基制备：配制发酵培养基，kh2po4(0.1g/l)、mgso4·
7h2o(0.1g/l)、caco3(2g/l)、caso4(0.05g/l)、nacl(0.1g/l)、甘露醇(8g/l)，ph＝6.9。分装至3个300ml的三角瓶，装液量为25％。121℃灭菌20min。
78.(2)菌体活化：农杆菌属斜面从4℃冷藏柜中取出，置于28℃培养箱活化2h。
79.(3)液体发酵：取2支步骤(2)中的菌种斜面，在无菌的条件下，每支斜面用5ml无菌水将斜面的菌苔清洗下来，取菌液接种于步骤(1)制备的种子培养基中，125r/min、37℃震荡培养2d后得到种子液；取种子液以3％的接种量接种于步骤(1)制备的发酵培养基中，120r/min、30℃震荡培养5d。
80.(4)提取农杆菌属胞外多糖：将步骤(3)中的发酵液1.2
×
104r/min高速离心15min，收集上清液即为胞外多糖粗液；a)将胞外多糖粗液用透析袋浓缩后得到胞外多糖浓缩液；将胞外多糖浓缩液加入乙醇(v:v＝1:6)，使用磁力搅拌器匀速搅拌10min后，静置24h，1.2
×
104r/min离心，弃上清液，收集沉淀；b)向步骤a)中收集到的沉淀中加入步骤a)
胞外多糖浓缩液1/3体积的纯水，40℃水浴溶解20min，离心收集上清液；c)将步骤b)收集的上清液加入乙醇(v:v＝1:6)，使用磁力搅拌器匀速搅拌10min后，静置24h，1.2
×
104r/min离心，弃上清液，收集沉淀即为农杆菌属胞外多糖。
81.二、阳离子羟乙基纤维素制备：
82.(1)将20g羟乙基纤维素分散在装有100ml异丙醇和水的混合液(v:v＝95:5)的三口烧瓶中，搅拌均匀，再加入8ml 25wt％naoh溶液和3ml 65wt％3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液，在60℃下反应6h。
83.(2)反应结束后，用丙酮(分析纯)对步骤(1)制备好的阳离子羟乙基纤维素进行提纯、洗涤、冷冻干燥、研磨过60目筛。
84.三、取制备好的阳离子羟乙基纤维素，搅拌均匀后，再加入制备好的农杆菌属胞外多糖，搅拌均匀后静置得到所述生物絮凝剂。
85.对本实施例获得的胞外多糖进行gpc液相凝胶色谱检测(如图4所示)，拟合处理后主要有一段波峰，波峰平均分子量为2682798。
86.实施例3
87.一、农杆菌属胞外多糖的制备：
88.(1)种子培养基制备：蔗糖(6g/l)、na2hpo4(4g/l)、mgso4·
7h2o(1g/l)、caco3(0.15g/l)、fecl3(0.01g/l)，ph＝7.5。
89.(1)发酵培养基制备：配制发酵培养基，kh2po4(0.5g/l)、mgso4·
7h2o(0.5g/l)、caco3(3g/l)、caso4(0.2g/l)、nacl(0.5g/l)、甘露醇(8g/l)，ph＝6.8。分装至3个300ml的三角瓶，装液量为25％。121℃灭菌20min。
90.(2)菌体活化：农杆菌属斜面从4℃冷藏柜中取出，置于28℃培养箱活化2h。
91.(3)液体发酵：取2支步骤(2)中的菌种斜面，在无菌的条件下，每支斜面用5ml无菌水将斜面的菌苔清洗下来，取菌液接种于步骤(1)制备的种子培养基中，150r/min、37℃震荡培养2d后得到种子液；取种子液以6％的接种量接种于步骤(1)制备的发酵培养基中，150r/min、40℃震荡培养1d。
92.(4)提取农杆菌属胞外多糖：将步骤(3)中的发酵液1.6
×
104r/min高速离心8min，收集上清液即为胞外多糖粗液；a)将胞外多糖粗液用透析袋浓缩后得到胞外多糖浓缩液；将胞外多糖浓缩液加入乙醇(v:v＝1:2)，使用磁力搅拌器匀速搅拌5min后，静置12h，1.6
×
104r/min离心，弃上清液，收集沉淀；b)向步骤a)中收集到的沉淀中加入步骤a)胞外多糖浓缩液1/3体积的纯水，45℃水浴溶解60min，离心收集上清液；c)将步骤b)收集的上清液加入乙醇(v:v＝1:2)，使用磁力搅拌器匀速搅拌5min后，静置12h，1.6
×
104r/min离心，弃上清液，收集沉淀即为农杆菌属胞外多糖。
93.二、阳离子羟乙基纤维素制备：
94.(1)将30g羟乙基纤维素分散在装有100ml异丙醇和水的混合液(v:v＝95:5)的三口烧瓶中，搅拌均匀，再加入5ml 25wt％naoh溶液和65wt％10ml 3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵溶液，在70℃下反应8h。
95.(2)反应结束后，用丙酮(分析纯)对步骤(1)制备好的阳离子羟乙基纤维素进行提纯、洗涤、冷冻干燥、研磨过100目筛。
96.三、取制备好的阳离子羟乙基纤维素，搅拌均匀后，再加入制备好的农杆菌属胞外
多糖，搅拌均匀后静置得到所述生物絮凝剂。
97.对本实施例获得的胞外多糖进行gpc液相凝胶色谱检测(如图5所示)，拟合处理后主要有一段波峰，波峰平均分子量为79226。
98.阳离子羟乙基纤维素和农杆菌属胞外多糖的安全性评价
99.取实施例1-3制备的农杆菌属胞外多糖和阳离子羟乙基纤维素进行吸光度测试。通过测定乙酰胆碱酯酶(ache)活性的降低来评价农杆菌属胞外多糖和阳离子羟乙基纤维素的毒性。将3ml阳离子羟乙基纤维素(0.5g/l～10g/l)、农杆菌属胞外多糖(0.1g/l～1g/l)溶于磷酸盐缓冲液，0.1ml 5,5'-二硫代-2-硝基苯甲酸(dtnb)-磷酸乙醇试剂和0.1ml胆碱酯酶移入比色管。孵育10min后，加入0.1ml碘化乙酰硫胆碱开始反应。测定了412nm处吸光度的变化率(cr)。ache的相对活性(ra)计算公式如下：
[0100][0101]
式中，ra
ache
为乙酰胆碱酯酶相对活性；cr
us
为未加阳离子羟乙基纤维素和农杆菌菌属多糖时，乙酰胆碱酯酶在412nm的吸光度变化率；cr
ts
为加入阳离子羟乙基纤维素和农杆菌菌属多糖时，乙酰胆碱酯酶在412nm的吸光度变化率。
[0102]
采用以上方法分别对实施例1-3制备的农杆菌属胞外多糖和阳离子羟乙基纤维素进行检测，如图6所示，结果表明：农杆菌属胞外多糖浓度为0.1g/l～1g/l，乙酰胆酯碱酯酶的相对活性没有下降；阳离子羟乙基纤维素浓度为10g/l时，乙酰胆碱酯酶的相对活性为80.6％。一般来说，一种物质的含量水平导致50％的乙酰胆碱酯酶活性丧失，被认为是有毒的。显然，本发明制备的农杆菌属胞外多糖和阳离子羟乙基纤维素在使用浓度内对乙酰胆碱酯酶无明显毒性。
[0103]
应用例1
[0104]
阳离子羟乙基纤维素对蓝藻的抑制作用
[0105]
(1)配制od
600
＝0.1的微囊藻液，取18个75ml的透气瓶，每个透气瓶分装30ml藻液，每三个透气瓶作为一组，编号为7-0，7-0，7-0，7-1，7-1，7-1，
……
，7-6，7-6，7-6。装有藻液的透气瓶中阳离子羟乙基纤维素浓度为0ppm、8ppm、10ppm、13ppm、20ppm、40ppm，每组三个平行。
[0106]
(2)将步骤(1)中的透气瓶在25℃恒温和适度光照下培养72h。
[0107]
(3)测试步骤(2)透气瓶中蓝藻的叶绿素含量：1)加入适量的0.1mm锆珠和0.5mm的锆珠至2ml冻存管中；2)取3ml藻液真空抽滤得到藻泥，放入有锆珠的冻存管中，再加入1.5ml的90％丙酮；3)将冻存管在细胞破碎机中按照破碎10s、停10s的操作程序循环破碎5次即可；4)取出，4℃冷藏2h后，离心取上清液测试其在630nm、647nm、664nm、750nm处波长，最后按照如下计算公式计算叶绿素含量和叶绿素清除率。
[0108][0109][0110]
式中，a
664
为664nm处吸光度，a
750
为750nm处吸光度，a
647
为647nm处吸光度，a
630
为630nm处吸光度。chla1为添加阳离子羟乙基纤维素前藻液叶绿素含量，chla2为添加阳离子
羟乙基纤维素72h后藻液叶绿素含量。
[0111]
结果如图7所示，结果表明，阳离子羟乙基纤维浓度为40ppm时，铜绿微囊藻的叶绿素清除率达73％，说明阳离子羟乙基纤维素对蓝藻具有抑制作用。
[0112]
应用例2
[0113]
生物絮凝剂对蓝藻的絮凝作用
[0114]
(1)取od
600
＝0.1的微囊藻液600ml，分装50ml至100ml烧杯中，磁力搅拌均匀。
[0115]
(2)取50ml处于对数期的微囊藻液，置于100ml小烧杯中，并加入一定浓度的阳离子羟乙基纤维素、农杆菌属胞外多糖，在磁力搅拌器上搅拌1min后静置1min，待静置结束后用移液枪从溶液底部同一位置吸取3ml藻液，测定叶绿素含量(测试方式同应用例1)，以藻液叶绿素含量的损失率计算添加生物絮凝剂后蓝藻的絮凝率。阳离子羟乙基纤维素设置11个浓度梯度分别10mg/l、20mg/l、25mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、250mg/l、300mg/l、400mg/l、500mg/l、600mg/l；农杆菌属胞外多糖设置7个浓度梯度分别为23.6mg/l、59mg/l、118g/l、177mg/l、236mg/l、295mg/l、354mg/l；
[0116]
(3)絮凝率按照以下方式计算：
[0117][0118]
式中，chla3为絮凝前藻液叶绿素含量，chla4为絮凝后藻液叶绿素含量。
[0119]
结果如下表1，综合考虑成本与安全性，当阳离子羟乙基纤维素浓度为20mg/l，农杆菌属胞外多糖为236mg/l时，絮凝率98.2％；当阳离子羟乙基纤维素浓度为20mg/l，农杆菌属胞外多糖为177mg/l时，絮凝率99.8％，后者效果更好。
[0120]
表1
[0121]
[0122][0123]
图8为阳离子羟乙基纤维素含量为250g/l，不同含量农杆菌属胞外多糖对蓝藻絮凝率结果。农杆菌属胞外多糖浓度在23.6mg/l～236mg/l时，蓝藻絮凝率从53.0％提高到98.2％；农杆菌属多糖浓度在236mg/l～354mg/l时，蓝藻絮凝率从98.2％下降到15.2％。图9为农杆菌属胞外多糖含量为177mg/l，不同阳离子羟乙基纤维素含量对蓝藻絮凝率结果。阳离子羟乙基纤维素浓度在10mg/l～20mg/l时，蓝藻絮凝率从35.2％提高到99.8％；阳离子羟乙基纤维素浓度在20mg/l～600mg/l时，蓝藻絮凝率从99.8％下降到42.6％。说明了当蓝藻藻液中阳离子羟乙基纤维素或农杆菌属胞外多糖含量过高(或过低)时，都会使蓝藻藻液中的电荷中和不完全，最终导致絮凝率下降。
[0124]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。