OsbHLH189基因在改良水稻粒型中的应用

osbhlh189基因在改良水稻粒型中的应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，更具体地说，涉及osbhlh189基因在改良水稻粒型中的应用。


背景技术：

2.水稻的粒型性状包括粒长、粒宽、粒厚、长宽比等，与水稻的产量和品质均密切相关。随着人们生活水平的提高，对稻米品质的要求也日益增高。细长型的稻米通常具有更好的外观品质，因而更受消费者的欢迎。因此，粒型性状已成为水稻高产优质育种的重要靶标性状。研究水稻粒型调控的分子机制，对于通过分子育种改良水稻的产量和品质具有重要意义。
3.近年来，研究人员利用正向和反向遗传学方法，克隆了多个参与水稻粒型调控的关键基因，如粒长控制基因gs3、gl2/gs2、gl7/gw7/slg7、glw7、 tgw3、gs9、gl6、gl10、osak3、粒宽控制基因gw2、gw5/gse5、gs5、 gw6、gw8、tgw2等。对这些基因进行的功能研究和调控通路分析表明，植物激素、g蛋白、mapk等信号通路以及泛素-蛋白酶体通路参与水稻粒型的调控。gs9是一个控制水稻粒型的数量性状基因座，编码一个转录激活蛋白。该基因突变导致籽粒变得细长，而其过表达使籽粒变得短圆。通过分子标记辅助选择将gs9的无效等位基因导入高产主栽品种武运粳8和武运粳27，或者利用crispr/cas9技术在高产品种盐稻8号中敲除gs9，均使籽粒变得细长，显著改善了外观品质。gl7/gw7/slg7编码拟南芥longifolia蛋白的同源蛋白。 gl7/gw7/slg7表达量的增加导致籽粒变得细长。
4.碱性螺旋-环-螺旋(bhlh)转录因子家族是真核生物最大的转录因子家族之一，参与植物的生长发育、胁迫应答等多个生物学过程的调控。目前，已在水稻基因组中鉴定出183个bhlh基因，其中多个基因参与水稻籽粒粒型的调控。过表达osbhlh107和osbhlh102显著增加水稻籽粒的粒长和粒重 (xiaoming yang，yulong ren，yue cai，mei niu，zhiming feng，ruonan jing，changling mou，xi liu，lianjie xiao，xin zhang，fuqing wu，xiuping guo，lingjiang，jianmin wan.overexpression of osbhlh107，a member of the basichelix-loop-helix transcription factor family，enhances grain size in rice(oryza satival.).rice，2018，11：41)。osbhlh079和osbu1(osbhlh172)通过参与油菜素甾醇(br)信号转导，调控水稻叶夹角和籽粒大小。osbul1(osbhlh170) 是一个非典型的hlh蛋白，通过与osbc1(osbhlh081)形成复合体，共同调控水稻叶夹角和籽粒大小。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种 osbhlh189基因在改良水稻粒型中的应用。
6.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
7.osbhlh189基因在改良水稻粒型中的应用，包括以下步骤：
8.1)osbhlh189基因过表达载体的构建
9.以野生型粳稻品种中花11cdna为模板，设计一对引物，扩增osbhlh189 基因，引物序列如下：
10.osbhlh189oe-f：
[0011]5′‑
actagggtctcgcaccatggcgcacgacgggttcctcgg-3
′
，
[0012]
osbhlh189oe-r：
[0013]5′‑
actagggtctctaccgtcatgtattgcccctgaacccca-3
′
，
[0014]
在引物两端分别引入了限制性内切酶bsa i的识别位点；pcr扩增产物用胶回收试剂盒(takara，805a)纯化，并利用bsa i酶切后，连接入带有潮霉素抗性基因的pegoepubi-h载体的zmubi启动子下游，构建pegoepubi-h
‑ꢀ
osbhlh189过表达转基因载体；重组质粒采用热击转化法转化大肠杆菌dh5a，转化物在含卡那霉素的lb平板上筛选，挑选阳性克隆，提取质粒后测序验证正确，获得osbhlh189过表达载体；其中，osbhlh189基因编码序列如seq idno.2所示(水稻中osbhlh189基因序列如seq id no.1所示)； pegoepubi-h-osbhlh189过表达转基因载体序列如seq id no.6所示。
[0015]
2)osbhlh189过表达转基因植株的获得
[0016]
将测序正确的osbhlh189过表达载体通过电击法转入农杆菌菌株eha105 中；将粳稻品种中花11未成熟种子带壳灭菌，在超净工作台上分离出未成熟胚，接种在诱导愈伤培养基上；暗培养6d后挑选生长旺盛，颜色浅黄的胚性愈伤组织，作为转化的受体；将带有osbhlh189过表达重组质粒的农杆菌eha105 菌株培养至对数生长期，离心收集菌体，并用加入乙酰丁香酮的aam培养基重悬后倒入愈伤组织进行侵染；侵染结束后的愈伤组织在共培养基上培养3d，然后在含有50mg l-1
潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织，经两代筛选以后，将抗性愈伤组织进行预分化处理和分化再生；再生小苗转入1/2ms培养基上生根壮苗；小苗经练苗处理后移入大田种植。
[0017]
所述的osbhlh189基因在改良水稻粒型中的应用中，所述osbhlh189基因的蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
[0018]
用于荧光定量pcr检测osbhlh189基因的特异性引物osbhlh189-f和 osbhlh189-r，引物序列如下：
[0019]
osbhlh189-f：5
′‑
caagcaccaaacacttagaaacg-3
′
[0020]
osbhlh189-r：5
′‑
gtattgcccctgaaccccat-3
′
。
[0021]
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体(如pbi121、pbin19、pcambia2301、pcambia3301、 pcambia1301-ubin、pcambia1300等)和可用于植物微弹轰击的载体等。
[0022]
使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子、组成型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒 (camv)35s启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)、胁迫诱导型启动子rd29a 等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。
[0023]
本发明的有益效果为：
[0024]
与现有技术相比，本发明通过在粳稻中过量表达osbhlh189基因，显著增加了水稻籽粒的粒长、降低了粒宽，使稻米变得细长，具有更好的外观品质，且不影响水稻的产量。因而，该基因是水稻粒型性状的一个新的调控因子，在改良水稻粒型、提升外观品质上具有潜
在的工业应用价值，产生更高的经济效益。
附图说明
[0025]
图1为osbhlh189基因在野生型中花11和过表达转基因植株(ox)中的相对表达情况，数值为三个生物学重复的平均值；
[0026]
图2为野生型中花11和过表达转基因植株(ox)株高，数值为10个单株的平均值；
[0027]
图3为野生型中花11和过表达转基因植株(ox)籽粒和糙米的表型，比例尺＝5mm。
具体实施方式
[0028]
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0029]
以下实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规操作方法。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0030]
实施例1：osbhlh189过表达转基因株系的获得及表型分析
[0031]
1)osbhlh189过表达载体的构建
[0032]
采用rnasimple总rna提取试剂盒(tiangen，dp419)提取粳稻品种中花11叶片总rna，利用primescript1ststrandcdnasynthesiskit(takara，6110a)试剂盒方法反转录成cdna。反转录步骤如下：取rna样品3μg，分别加入50μmoll-1
oligodtprimer1μl和10mmoll-1
dntpmixture1μl，用rnasefreedh2o补足体积10μl，65℃保温5min后，冰上迅速冷却；变性后的反应液分别加入5
×
primescriptbuffer4μl，40uμl-1
rnaseinhibitor0.5μl，200uμl-1
primescriptrtase1μl，用rnasefreedh2o补足体积20μl，缓慢混匀；按下列条件进行反转录反应：42℃60min，70℃15min，冰上放置。以cdna为模板，设计一对引物，利用kodfx(toyobo，kfx-101)扩增osbhlh189基因编码区片段，引物序列如下：
[0033]
osbhlh189oe-f：
[0034]5′‑
actagggtctcgcaccatggcgcacgacgggttcctcgg-3
′
，
[0035]
osbhlh189oe-r：
[0036]5′‑
actagggtctctaccgtcatgtattgcccctgaacccca-3
′
，
[0037]
pcr反应体系：2xpcrbufferforkodfx25μl，2mmoll-1
dntpmixture10μl，10μmoll-1
osbhlh189oe-f、osbhlh189oe-r引物各1.5μl，cdna模板2μl，1uμl-1
kodfx1μl，用灭菌去离子水补足体积50μl。
[0038]
pcr反应条件：94℃变性2min；然后98℃变性10s，68℃延伸2min，扩增35个循环；最后在68℃下延伸5min。
[0039]
在引物两端分别引入了限制性内切酶bsai的识别位点。pcr扩增产物用胶回收试剂盒(takara，805a)纯化，并利用bsai酶切后，连入用相同限制性酶切割的pegoepubi-h载体。连接反应是利用t4dnaligase(takara，2011a)进行。反应体系和条件为：10
×
t4dnaligasebuffer2.5μl，酶切回收后的基因片段300ng，载体dna片段100ng，350uμl-1
t4dnaligase1μl，用灭菌蒸馏水补足体积25μl，16℃过夜连接。重组质粒采用热击转化法转化大肠杆菌dh5a。具体步骤为：将dh5α感受态细胞放置于冰上融化；将连接产物10μl、感受
态细胞50μl置于1.5ml灭菌管中，轻轻混匀后于冰上放置30min；将上述混合物于42℃水浴锅中热击45s，立即放回冰上，静置2min；在超净工作台上加lb液体培养基800μl，37℃振荡培养1h；吸取上述转化物涂布在含卡那霉素的lb平板上过夜筛选。挑选阳性克隆，提取质粒后测序，获得osbhlh189过表达载体。所述pegoepubi-h-osbhlh189过表达转基因载体序列如seqidno.6所示。
[0040]
2)osbhlh189过表达转基因植株的获得和表型分析
[0041]
将测序正确的osbhlh189过表达载体通过电击法转入农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)菌株eha105中，利用农杆菌介导法转化粳稻品种中花11。转化的具体方法是将粳稻品种中花11未成熟种子带壳灭菌，在超净工作台上分离出未成熟胚，尖头朝下接种在诱导愈伤培养基n6d2上；暗培养6d后挑选生长旺盛，颜色浅黄的胚性愈伤组织，作为转化的受体；将带有osbhlh189过表达重组质粒的农杆菌eha105菌株培养至对数生长期，离心收集菌体，并用aam培养基重悬；倒入愈伤组织浸泡15-20min，并不时摇动；侵染结束后的愈伤组织在n6d2c培养基上于28℃暗培养3d，然后分别在ccd2s1和ccd2s2选择培养基上进行两代筛选；将抗性愈伤组织转入cca培养基上于24-26℃暗培养条件下进行预分化处理10d；经预分化处理的愈伤组织转入msr培养基在25℃光培养下分化再生；再生小苗转入1/2ms培养基上生根壮苗；小苗在阴凉处用凉开水练苗3d后移入大田种植，按常规方法进行管理和收获。
[0042]
采用rnasimple总rna提取试剂盒(tiangen，dp419)分别提取野生型中花11和osbhlh189过表达转基因植株叶片总rna，利用primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser(takara，047a)试剂盒所述方法反转录成cdna，以osbhlh189基因编码区特异性引物osbhlh189-f和osbhlh189-r进行荧光定量pcr，以水稻actin1基因作为内参。引物序列如下：
[0043]
osbhlh189-f：5
′‑
caagcaccaaacacttagaaacg-3
′
[0044]
osbhlh189-r：5
′‑
gtattgcccctgaaccccat-3
′
[0045]
actin1-f：5
′‑
cttggcatctctcagcacatt-3
′
[0046]
actin1-r：5
′‑
ttggcttagcattcttgggt-3
′
[0047]
pcr反应利用tbgreenpremixextaqii(takara，820a)在cfxconnect荧光定量pcr仪(bio-rad)上进行。pcr体系为：tbgreenpremixextaqii12.5μl，10μmoll-1
上下游引物各1μl，cdna模板2μl，灭菌蒸馏水8.5μl，总体积25μl。
[0048]
pcr反应条件为：95℃30s预变性；95℃5s变性，60℃34s延伸，40个循环。
[0049]
荧光定量pcr结果表明，过表达植株osbhlh189基因的表达量被显著上调(图1)。田间种植的过表达植株株高与野生型无显著差异(图2)。然而，过表达植株籽粒粒长显著大于野生型、而粒宽小于野生型(表1和图3)。其中，过表达植株籽粒粒长比野生型增加了7.4％～8.6％，粒宽下降了3.2％～4.7％，长宽比增加了11.0％～14.2％。其中，ox2植株籽粒的长宽比达2.50，达到了长粒粳稻的标准(黄海祥，钱前.水稻粒形遗传与长粒型优质粳稻育种进展.中国水稻科学，2017，31(6)：665-672)。但籽粒千粒重及单株产量与野生型并无显著差异(表1)。因此，该基因在通过基因工程技术改良水稻籽粒的粒型中具有潜在的应用价值，能产生更高的经济效益。
[0050]
表1野生型中花11和osbhlh189过表达转基因植株(ox)种子对比
[0051]
材料粒长(mm)粒宽(mm)长宽比千粒重(g)单株产量(g)中花117.41
±
0.173.39
±
0.102.19
±
0.0726.66
±
0.6830.13
±
5.21ox17.96
±
0.23
***
3.28
±
0.09
***
2.43
±
0.09
***
26.36
±
0.7829.32
±
3.53ox28.05
±
0.21
***
3.23
±
0.10
***
2.50
±
0.08
***
26.96
±
0.7431.25
±
5.88
[0052]
注：粒长、粒宽和长宽比为50粒种子的平均值，千粒重和单株产量为10 个单株的平均值。
***
：p＜0.001。