基于双亲性聚碳酸酯电荷反转型纳米药物载体及其制备方法

1.本发明属于纳米药物载体技术领域，特别涉及一类基于双亲性聚碳酸酯电荷反转型纳米药物载体及其制备方法。


背景技术：

2.恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的重大疾病，我国恶性肿瘤死亡率属于世界较高水平，占居民全部死因的23.9％，且近十多年来，恶性肿瘤发病率保持每年3.9％的增幅，死亡率保持每年2.5％的增幅。因此，如何有效的控制、攻克恶性肿瘤已经成为一个亟需解决的重要公共健康问题。针对恶性肿瘤，临床上主要通过外科手术、放射治疗和化学治疗来延长患者生命，提高患者的生存率。在临床上，化疗作为一种不可缺少的癌症治疗的方法一直受到广泛的关注，其中联合化疗是恶性肿瘤治疗的新趋势。化疗是现阶段临床上用于恶性肿瘤治疗的主要手段之一，传统的化疗药物的应用通常因水溶性差、生物利用度低和毒副作用大而受到限制。
3.近年来，根据肿瘤微环境的特异性，越来越多的具有靶向性、缓释性特点的纳米载药系统被开发，这些纳米载药系统可以提高药物溶解度、调控化疗药物的体内过程、促进药物在肿瘤组织的分布与蓄积、改善药物的细胞摄取与释放行为、实现减毒增效，具有良好的临床开发价值。纳米载体的使用可以改善水溶性较差药物的递送效果，在保护药物活性的同时，延长药物的血液循环时间、控制药物的释放速度、降低药物的毒副作用，实现靶向药物递送、两种或两种以上药物的联合治疗协同递送等功能。然而，从静脉注射部位到肿瘤组织处药物作用部位存在多种物理、化学和生理障碍，只有约0.7％的注射剂量能有效地输送到肿瘤组织。这些障碍包括血液循环、肿瘤血管的游离、肿瘤内的积累、实体肿瘤的穿透、细胞内化和细胞内药物的释放等。由于载药纳米粒子在体内对肿瘤细胞的治疗效果通常由其颗粒大小、形状、配体修饰和zeta电位等表面性质决定。因此，巧妙地设计纳米药物载体的结构已成为提高给药效率的一种有效策略。目前，大多数纳米颗粒制剂都是基于增强保留和渗透性效应(epr)来促进药物在肿瘤组织中的沉积来实现给药。配体修饰的纳米载体通常会与血清蛋白或与正常组织产生免疫反应，导致非特异性的药物分布并加速肝脏和脾脏中网状内皮系统清除。虽然表面带正电的纳米颗粒容易在血液循环中被血清组分吸附并清除，但最近的报道表明，阳离子纳米颗粒可有效促进胞吞作用。现有技术中心存在化疗药物的应用水溶性差、生物利用度低和毒副作用大等问题，而受到很大的限制。


技术实现要素：

4.针对传统的化疗药物的应用通常因水溶性差、生物利用度低和毒副作用大而受到限制，本发明提供了一种基于双亲性聚碳酸酯电荷反转型纳米药物载体及其制备方法。
5.基于双亲性聚碳酸酯电荷反转型纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：首先以聚乙二醇单甲醚(mpeg
113
)为引发剂，1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(dbu)为催化剂，在一定条件下通过溶液聚合，制备出嵌段共聚物mpeg
113-b-pmbcn，然后以pd/c和pd(oh)2/c为还
原剂，通过加氢还原获得了含羧基嵌段共聚物mpeg
113-b-pmccn；其次将mpeg
113-b-pmccn与2-(六甲撑亚胺)乙醇在二环己基碳二亚胺(dcc)与4-二甲氨基吡啶(dmap)作用下制备出共聚物p1，然后将p1与n-羟基丁二酰亚胺在dcc作用下制备共聚物p2，再将p2与阿霉素(dox)在dmso(二甲基亚砜)中反应合成出电荷反转型纳米药物载体p3；最后采用溶剂交换法制备纳米药物载体粒子dox-m。
6.基于双亲性聚碳酸酯电荷反转型纳米药物载体，其分子设计：
[0007][0008]
其中n＝53,x+y＝53,x+y+z＝53。
[0009]
基于双亲性聚碳酸酯电荷反转型纳米药物载体的制备方法，按以下步骤进行：
[0010]
1.嵌段共聚物mpeg
113-b-pmbcn的合成
[0011]
1.1将mpeg
113
与bmc按照摩尔比为1:50～60的配比放入茄形瓶中；
[0012]
1.2向茄形瓶中添加30～60ml二氯甲烷，待药品完全溶解后加入与mpeg
113
等摩尔量的dbu；
[0013]
1.3对体系抽真空充氩气，确保在氩气氛围保护下，将反应装置转移至25
±
5℃油浴锅中磁力搅拌，20～24h后加入mpeg
113
摩尔量的1.2～1.5％的苯甲酸淬灭反应；
[0014]
1.4反应结束后将体系旋蒸浓缩，在甲醇中沉降析出聚合物，过滤出沉淀后，在20
±
5℃真空干燥20～24h后，得嵌段共聚物mpeg
113-b-pmbcn。
[0015]
2.含羧基嵌段共聚物mpeg
113-b-pmccn的合成
[0016]
2.1采用步骤1制备的mpeg
113-b-pmccn，在茄形瓶中用甲醇和四氢呋喃按体积比1:1的混合溶剂将mpeg
113-b-pmccn溶解，制成共聚物溶液；
[0017]
2.2向共聚物溶液中加入mpeg
113-b-pmccn总重量的5～8％的pd系催化剂，pd催化剂由pd/c和pd(oh)2/c按质量比1:1混合制成。体系抽真空通氢气，确保体系中空气全部被氢气取代，在氢气氛围下，25
±
5℃磁力搅拌反应30～48h；
[0018]
2.3减压抽滤除去pd系催化剂，滤液进一步旋转蒸发至干，然后25
±
5℃真空干燥20～24h，得含羧基嵌段共聚物mpeg
113-b-pmccn。
[0019]
3.嵌段共聚物p1的合成
[0020]
3.1将dcc和dmap溶于四氢呋喃中制成催化剂有机溶液，dmap为dcc总重量的10％；
[0021]
3.2采用步骤2制备的含羧基嵌段共聚物mpeg
113-b-pmccn，将其溶于四氢呋喃中制成共聚物有机溶液；
[0022]
3.3将步骤3.1制备的催化剂有机溶液滴加到步骤3.2制备的共聚物有机溶液中，滴加量按dcc与mpeg
113-b-pmccn的摩尔比为1:1.3～1.5，在氩气保护下于20
±
5℃搅拌40～60min，此时溶液变为乳白色；
[0023]
3.4将2-(六甲撑亚胺)乙醇溶于四氢呋喃中制成有机溶液，再缓慢滴加(20～25滴/分)到步骤3.3制备的溶液中，滴加结束后在25
±
5℃搅拌反应20～24h，然后加入去离子水1～2ml终止反应，继续搅拌0.5～1h；添加量按2-(六甲撑亚胺)乙醇的摩尔量为mpeg
113-b-pmccn的50～60％；
[0024]
3.5用砂芯漏斗减压抽滤除去反应生成的二环己基脲(dcu)，然后将滤液在-20℃冷冻后再次减压抽滤去除dcu，然后将溶液放入-20℃冰箱中冷冻后再次减压抽滤去除dcu。反复操作3～5次，完全除去dcu。把粗产物重新溶解在四氢呋喃中，向溶液中滴加去离子水并匀速缓慢搅拌，当加水体积到50wt％时，将聚合物溶液转移至mwco 3500da的透析袋中，20
±
5℃下用去离子水进行透析，每8～10h换一次水，40～48h后得到乳白色纳米粒子溶液，将其冻干得到白色粉末固体产物，记为p1。
[0025]
4.嵌段共聚物p2的合成
[0026]
4.1将摩尔比为1:1的dcc和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)溶解于干燥的四氢呋喃中；
[0027]
4.2将共聚物p1溶解于干燥的四氢呋喃中制成溶液；
[0028]
4.3将步骤4.1所配制的溶液缓慢滴加到步骤4.2所配制的溶液中，滴加完毕后氩气保护条件下，25
±
5℃磁力搅拌活化0.5～1h。dcc与nhs的总量与p1的摩尔比为1.0～1.2:1；
[0029]
4.4将己二胺溶解于二氯甲烷中制成溶液；
[0030]
4.5将步骤4.3活化后的共聚物p1溶液滴加到步骤4.4的溶液中，滴完后抽真空在氩气保护下，于25
±
5℃磁力搅拌反应20～24h后加去离子水1～2ml，在继续搅拌0.5～1h，用砂芯漏斗抽滤除去dcu，然后将滤液放入-20℃冰箱中冷冻后再次减压抽滤去除dcu，反复操作3～5次，旋转蒸干溶液，得淡黄色粘稠粗产物。把粗产物重新溶解在四氢呋喃中，向溶液中滴加去离子水并搅拌，当加水体积到50wt％时，将聚合物溶液转移至mwco 3500da的透析袋中，20
±
5℃下用去离子水进行透析，每8～10h换一次水，40～48h后得到乳白色纳米粒子溶液，将其冷冻干燥得到白色絮状产物，记为p2。
[0031]
5.聚合物-阿霉素共轭化合物p3的合成
[0032]
5.1将dox
·
hcl溶于dmso中制成有机溶液，然后用微量注射器加入少量三乙胺，在20
±
5℃条件下避光搅拌6～10h；
[0033]
5.2将步骤4制备的聚合物p2溶于dmso中制成有机溶液；
[0034]
5.3将步骤5.2制备的聚合物p2溶液缓慢滴加(20～25滴/分)到步骤5.1制备的dox
·
hcl溶液中，在20
±
5℃条件下避光搅拌10～15h。反应结束后，在体系中加入20～30ml去离子水，将混合溶液转移到mwco 3500da的透析袋中，在去离子水中透析40～48h，每8～10h换一次水，以去除体系中的杂质，最后将保留液冻干，得红色絮状产物p3。添加量按dox
·
hcl的质量为聚合物p2的30～40％。
[0035]
6.纳米药物载体dox-m的制备
[0036]
6.1在超声条件下，将p3溶解于dmso中，然后在超声分散的条件下滴加pbs缓冲溶液(ph＝7.4)。继续超声15～20min使纳米粒子溶液分散均匀；
[0037]
6.2将步骤6.1制备的溶液转移到mwco 3500da透析袋中，用pbs缓冲液(ph＝7.4)透析40～48h，每8～10h更换透析液，透析后的保留液经0.45μm滤膜过滤后，得到dox偶联纳米粒子(dox-m)。制备的纳米粒子溶液储存在4℃冰箱中，整个操作过程避光进行，如需要高浓度纳米粒子溶液可用超滤离心管进行浓缩。
[0038]
上述的mpeg
113
为聚乙二醇单甲醚，结构式为
[0039][0040]
上述的mbc为5-甲基-5-苄氧羰基三亚甲基碳酸酯，结构式为
[0041][0042]
上述的mpeg
113-b-pmbcn的结构式为
[0043][0044]
上述的mpeg
113-b-pmccn的结构式为
[0045][0046]
上述的p1的结构式为
[0047]
其中x+y＝53。
[0048]
上述的p2的结构式为
[0049]
其中x+y+z＝53。
[0050]
上述的p3的结构式为
[0051]
其中x+y+z＝53。
[0052]
本发明的特点及其有益效果是：
[0053]
本发明制备的基于双亲性聚碳酸酯电荷反转型纳米药物载体，以聚碳酸酯-阿霉素偶联聚合物为基础，自组装形成双ph响应可电荷反转的载药纳米粒子(dox-m)以抑制肿瘤的生长和转移其中，dox以酸性条件下可裂解的亚胺键与聚碳酸酯主链进行化学偶联。此外，引入的叔胺七元环使纳米粒子具有电荷转换的能力，进一步促进纳米粒子在肿瘤epr效应的基础上富集。纳米粒子被细胞内吞后，亚胺键在细胞酸性环境中迅速断裂，抗肿瘤药物dox+lap被释放到细胞质中以协同抑制细胞增殖。
附图说明
[0054]
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根
据这些附图获得其他相关的附图。
[0055]
图1为本发明实例1中制备的共聚物的ft-ir谱图；
[0056]
图2为本发明实例1中制备的共聚物的1h-nmr谱图；
[0057]
图3为本发明实例1中制备的共聚物的gpc曲线；
[0058]
图4为本发明实例1中制备的载体纳米粒子的形貌；
[0059]
图5为本发明实例1中制备的载体纳米粒子的粒径分布图；
[0060]
图6为本发明实例1中制备的载体纳米粒子在不同ph条件下zeta电位变。
具体实施方式
[0061]
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
[0062]
这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。本发明实施例中所用化学试剂均为市购，化学纯；采用的水为去离子水；旋转蒸发采用的设备为r201d型旋转蒸发器，工作时的旋转速度为120rpm。实施例中进行还原反应是采用三口烧瓶进行反应，通过插入反应溶液中的玻璃管通入氩气和氢气。
[0063]
本发明采用的仪器与表征方法如下：
[0064]
①
ft-ir采用美国pe公司的spectrum one红外光谱仪进行测试。固体样品采用kbr压片，吸收光谱扫描的波数量程4000～500cm-1。
[0065]
②
1h-nmr采用德国bruker arx 600mhz超导核磁共振仪，以cdcl3或dmso作为溶剂，tms为内标。
[0066]
③
凝胶渗透色谱(gpc)(waters，1515isocratic hplc pump)，检测器型号为waters 2414refractive index detector，配置有3根色谱柱，测试过程中以聚苯乙烯作为标准物，色谱纯thf作为流动相，控制流速1ml/min，测试温度为35℃
[0067]
④
透射电子显微镜(tem)(jeol，jem 2100plus)，使用的是美国fei公司生产的型号为tecnai g2 20的透射电镜，主要技术指标如下：点分辨0.23nm，线分辨0.14nm，加速电压200kv，lab6钨丝，放大倍数20
×‑
1000000
×
，全数字化计算机控制系统。
[0068]
⑤
动态光散射粒度仪(dls)(malvern，nano-zs90)，所用dls型号为英国malvern有限公司的zetasizer nano s，光源为功率4.0mw的he-ne激光器，测试波长为633nm，测试温度为25℃，测试散射角为173
°
。
[0069]
基于双亲性聚碳酸酯电荷反转型纳米药物载体及其制备方法，首先以聚乙二醇单甲醚(mpeg
113
)为引发剂，1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(dbu)为催化剂，在一定条件下通过溶液聚合，制备出嵌段共聚物mpeg
113-b-pmbcn，然后以pd/c和pd(oh)2/c为还原剂，通过加氢还原获得了含羧基嵌段共聚物mpeg
113-b-pmccn；其次将mpeg
113-b-pmccn与2-(六甲撑亚胺)
乙醇在二环己基碳二亚胺(dcc)与4-二甲氨基吡啶(dmap)作用下制备出共聚物p1，然后将p1与n-羟基丁二酰亚胺在dcc作用下制备共聚物p2，再将p2与阿霉素(dox)在dmso中反应合成出电荷反转型纳米药物载体p3；最后采用溶剂交换法制备纳米药物载体粒子dox-m。
[0070]
基于双亲性聚碳酸酯膨胀型快速释药纳米药物载体，其分子设计：
[0071][0072]
其中n＝53,x+y＝53,x+y+z＝53。
[0073]
基于双亲性聚碳酸酯电荷反转型纳米药物载体及其制备方法的制备方法，按以下步骤进行：
[0074]
1.嵌段共聚物mpeg
113-b-pmbcn的合成
[0075]
1.1将mpeg
113
与bmc按照摩尔比为1:50～60的配比放入茄形瓶中；
[0076]
1.2向茄形瓶中添加30～60ml二氯甲烷，待药品完全溶解后加入dbu，添加量按dbu的摩尔量与mpeg
113
等量；
[0077]
1.3对体系抽真空充氩气，确保在氩气氛围保护下，将反应装置转移至25
±
5℃油浴锅中磁力搅拌，20～24h后加入苯甲酸淬灭反应，添加量按苯甲酸的摩尔量为mpeg
113
的1.2～1.5％。
[0078]
1.4反应结束后将体系旋蒸浓缩，浓缩至大部分溶剂被蒸馏，在此温度继续操作基本没有溶剂蒸馏出为止，在甲醇中沉降析出聚合物，过滤出沉淀后，在20
±
5℃真空干燥20
～24h后，得嵌段共聚物mpeg
113-b-pmbcn。
[0079]
2.含羧基嵌段共聚物mpeg
113-b-pmccn的合成
[0080]
2.1采用步骤1制备的mpeg
113-b-pmccn，在茄形瓶中用混合溶剂将mpeg
113-b-pmccn溶解，制成共聚物溶液；所述的混合溶剂由甲醇和四氢呋喃按体积比1:1混合制成；
[0081]
2.2向共聚物溶液中加入pd系催化剂，加入量按pd催化剂占mpeg
113-b-pmccn总重量的5～8％。体系抽真空通氢气，确保体系中空气全部被氢气取代，在氢气氛围下，25
±
5℃磁力搅拌反应30～48h；所述的pd催化剂由pd/c和pd(oh)2/c按质量比1:1混合制成；
[0082]
2.3减压抽滤除去pd系催化剂，滤液进一步旋转蒸发至干，然后25
±
5℃真空干燥20～24h，得含羧基嵌段共聚物mpeg
113-b-pmccn。
[0083]
3.嵌段共聚物p1的合成
[0084]
3.1将dcc和dmap溶于四氢呋喃中制成催化剂有机溶液，dmap为dcc总重量的10％；
[0085]
3.2采用步骤2制备的含羧基嵌段共聚物mpeg
113-b-pmccn，将其溶于四氢呋喃中制成共聚物有机溶液；
[0086]
3.3将步骤3.1制备的催化剂有机溶液滴加到步骤3.2制备的共聚物有机溶液中，滴加量按dcc与mpeg
113-b-pmccn的摩尔比为1:1.3～1.5，在氩气保护下于20
±
5℃搅拌40～60min，此时溶液变为乳白色；
[0087]
3.4将2-(六甲撑亚胺)乙醇溶于四氢呋喃中制成有机溶液，再缓慢滴加(20～25滴/分)到步骤3.3制备的溶液中，滴加结束后在25
±
5℃搅拌反应20～24h，然后加入去离子水1～2ml终止反应，继续搅拌0.5～1h；添加量按2-(六甲撑亚胺)乙醇的摩尔量为mpeg
113-b-pmccn的50～60％；
[0088]
3.5用砂芯漏斗减压抽滤除去反应生成的二环己基脲(dcu)，然后将滤液在-20℃冷冻后再次减压抽滤去除dcu，然后将溶液放入-20℃冰箱中冷冻后再次减压抽滤去除dcu。反复操作3～5次，完全除去dcu。把粗产物重新溶解在四氢呋喃中，向溶液中滴加去离子水并匀速缓慢搅拌，当加水体积到50wt％时，将聚合物溶液转移至mwco 3500da的透析袋中，20
±
5℃下用去离子水进行透析，每8～10h换一次水，40～48h后得到乳白色纳米粒子溶液，将其冻干得到白色粉末固体产物，记为p1。
[0089]
4.嵌段共聚物p2的合成
[0090]
4.1将dcc和nhs溶解于干燥的四氢呋喃中，dcc与nhs的摩尔比为1:1；
[0091]
4.2将共聚物p1溶解于干燥的四氢呋喃中制成溶液；
[0092]
4.3将步骤4.1所配制的溶液缓慢滴加(20～25滴/分)到步骤4.2所配制的溶液中，滴加完毕后氩气保护条件下，25
±
5℃磁力搅拌活化0.5～1h。dcc与nhs的总量与p1的摩尔比为1.0～1.2:1；
[0093]
4.4将己二胺溶解于二氯甲烷中制成溶液；
[0094]
4.5将步骤4.3活化后的共聚物p1溶液滴加到步骤4.4的溶液中，滴完后抽真空在氩气保护下，于25
±
5℃磁力搅拌反应20～24h后加去离子水1～2ml，在继续搅拌0.5～1h，用砂芯漏斗抽滤除去dcu，然后将滤液放入-20℃冰箱中冷冻后再次减压抽滤去除dcu，反复操作3～5次，旋转蒸干溶液，得淡黄色粘稠粗产物。把粗产物重新溶解在四氢呋喃中，向溶液中滴加去离子水并搅拌，当加水体积到50wt％时，将聚合物溶液转移至mwco 3500da的透析袋中，20
±
5℃下用去离子水进行透析，每8～10h换一次水，40～48h后得到乳白色纳米粒
子溶液，将其冷冻干燥得到白色絮状产物，记为p2。
[0095]
5.聚合物-阿霉素共轭化合物p3的合成
[0096]
5.1将dox
·
hcl溶于dmso中制成有机溶液，然后用微量注射器加入少量三乙胺，三乙胺的量能使物质全部溶解即可(三乙胺为dox.hcl的6mol当量，也就是说1moldox.hcl，对应的三乙胺大概是6mol)，在20
±
5℃条件下避光搅拌6～10h；
[0097]
5.2将步骤4制备的聚合物p2溶于dmso中制成有机溶液；
[0098]
5.3将步骤5.2制备的聚合物p2溶液缓慢滴加(20～25滴/分)到步骤5.1制备的dox
·
hcl溶液中，在20
±
5℃条件下避光搅拌10～15h。反应结束后，在体系中加入20～30ml去离子水，将混合溶液转移到mwco 3500da的透析袋中，在去离子水中透析40～48h，每8～10h换一次水，以去除体系中的杂质，最后将保留液冻干，得红色絮状产物p3。添加量按dox
·
hcl的质量为聚合物p2的30～40％。
[0099]
6.纳米药物载体dox-m的制备
[0100]
6.1在超声条件下，将p3溶解于dmso中，然后在超声分散的条件下滴加pbs缓冲溶液(ph＝7.4)。继续超声15～20min使纳米粒子溶液分散均匀；
[0101]
6.2将步骤6.1制备的溶液转移到mwco 3500da透析袋中，用pbs缓冲液(ph＝7.4)透析40～48h，每8～10h更换透析液，，透析后的保留液经0.45μm滤膜过滤后，得到dox偶联纳米粒子(dox-m)。制备的纳米粒子溶液储存在4℃冰箱中，整个操作过程避光进行，如需要高浓度纳米粒子溶液可用超滤离心管进行浓缩。
[0102]
上述的mpeg
113
为聚乙二醇单甲醚，结构式为
[0103][0104]
上述的mbc为5-甲基-5-苄氧羰基三亚甲基碳酸酯，结构式为
[0105][0106]
上述的mpeg
113-b-pmbcn的结构式为
[0107][0108]
上述的mpeg
113-b-pmccn的结构式为
[0109][0110]
上述的p1的结构式为
[0111]
其中x+y＝53。
[0112]
上述的p2的结构式为
[0113]
其中x+y+z＝53。
[0114]
上述的p3的结构式为
[0115]
其中x+y+z＝53。
[0116]
实施例1
[0117]
聚合物-阿霉素共轭化合物p3，化学结构式如下：
[0118][0119]
纳米药物载体dox-m的制备，包括以下6个步骤：
[0120]
(1)称取5-甲基-5-苄氧羰基三亚甲基碳酸酯(mbc)6.0g(24mmol)，mpeg
113 2.0g
(0.4mmol)于100ml茄形瓶中，加入50ml二氯甲烷使其溶解，待药品完全溶解后加入dbu 60μl(0.4mmol)。对体系抽真空充氩气，确保在氩气氛围保护下，将反应装置转移至25℃油浴锅中磁力搅拌，24h后加入74mg苯甲酸淬灭反应。反应结束后将体系旋蒸浓缩，在冰甲醇中沉降析出聚合物，沉淀物在25℃真空干燥24h后，得无色半透明嵌段共聚物mpeg
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53
，产率：91％，玻璃化温度为-9℃；
[0121]
(2)取250ml茄形瓶，加入mpeg
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n 10.0g，用150ml比例为1:1的甲醇与四氢呋喃的混合溶剂将其溶解，再向其中加入0.5g pd/c和0.5g pd(oh)2/c共还原剂。体系抽真空通氢气，在氢气氛围下，于25℃搅拌反应48h。减压抽滤除去钯碳催化剂，滤液旋蒸至干，然后25℃真空干燥24h，得到无色透明半结晶共聚物mpeg
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53
，产率：81％，玻璃化温度为-12℃；
[0122]
(3)向100ml的三口烧瓶中加入mpeg
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53 0.42g(1.65mmol-cooh)，再加入20ml干燥的四氢呋喃使其溶解。预先将dcc 0.2451g(1.188mmol)和dmap 0.025g溶解于10ml干燥的四氢呋喃中，然后采用恒压滴液漏斗缓慢滴加(25滴/分钟)混合液，此时溶液变为乳白色。滴加完毕后在氩气保护条件下，25℃油浴磁力搅拌活化1h。然后将溶解在四氢呋喃中的2-(六甲撑亚胺)乙醇0.1418g(0.99mmol)缓慢滴入(30滴/分钟)上述反应体系中，25℃反应24h后向体系中加入去离子水2ml。继续反应1h后用砂芯漏斗减压抽滤去除反应生成的dcu，然后将溶液放入-20℃冰箱中冷冻后再次减压抽滤去除dcu。反复操作5次，直到dcu除尽后旋干体系得到淡黄色粘稠粗产物。把粗产物重新溶解在四氢呋喃中，向溶液中滴加去离子水并匀速缓慢搅拌，当加水体积到50wt％时，将聚合物溶液转移至mwco 3500da的透析袋中，室温下用去离子水进行透析，每8h换一次水，48h后得到乳白色纳米粒子溶液，将其冻干得到白色粉末固体产物，记为p1。产率：87％，玻璃化温度为9℃；
[0123]
(4)向100ml的三口烧瓶中加入聚合物p1 0.2g，再加入15ml干燥的thf使其溶解。预先将dcc 0.197g(0.954mmol)和nhs 0.110g(0.954mmol)溶解于10ml干燥的thf中，然后将dcc和nhs混合液缓慢滴加(25滴/分钟)到p1溶液中，此时溶液变为乳白色。滴加完毕后氩气保护条件下，25℃油浴磁力搅拌活化1h。称取己二胺0.0461g(0.397mmol)溶解于20ml二氯甲烷中，然后把上述活化后的聚合物p1溶液滴加到己二胺的二氯甲烷溶液中，滴完后重新抽真空氩气保护，25℃油浴磁力搅拌反应24h后加去离子水2ml。继续反应1h后用砂芯漏斗减压抽滤去除反应生成的dcu，然后将溶液放入-20℃冰箱中冷冻后再次减压抽滤去除dcu。反复操作，直到dcu除尽后旋干体系得到淡黄色粘稠粗产物。把粗产物重新溶解在thf中，向溶液中滴加去离子水并匀速缓慢搅拌(30滴/分钟)，当加水体积到50wt％时，将聚合物溶液转移至mwco 3500da的透析袋中，室温下用去离子水进行透析，每8h换一次水，48h后得到乳白色纳米粒子溶液，将其冻干得到白色絮状产物，记为p2。产率：82％，玻璃化温度为15℃；
[0124]
(5)称量dox
·
hcl 20mg于10ml茄形瓶中，加入dmso 3ml使其溶解，然后加入三乙胺18μl，反应在室温条件下避光搅拌12h。将60mg聚合物p2溶解在5ml dmso中，然后在磁力搅拌条件下缓慢滴加到dox溶液中并继续室温避光搅拌12h。将反应体系转移到透析袋(mwco 3500da)中，用去离子水进行透析48h，每8h换一次水，以除去溶剂和杂质。最后将保留液冻干，得到红色絮状粉末产物，记为p3。产率：78％，玻璃化温度为21℃；
[0125]
(6)在超声条件下，将15mg p3用2ml dmso全部溶解，然后缓慢滴加10ml pbs缓冲
液(ph＝7.4)到上述体系中，继续超声15min使之混合均匀。然后将混合物转移到mwco 3500da的透析袋中，在pbs缓冲液(ph＝7.4)中透析48h，每8h更换透析液。透析后的保留液经0.45μm滤膜过滤后，得到纳米载药粒子载体，dxo-m。制备的纳米粒子溶液储存在4℃冰箱中，整个操作过程避光进行，如需要高浓度纳米粒子溶液可用超滤离心管进行浓缩。
[0126]
tem与dls研究表明：纳米粒子粒径分布较窄，分布系数小于0.2，分散性良好，平均粒径分别为90nm，该尺寸的纳米粒子有利于其避免被肾脏或者免疫系统清除，并且可以通过epr效应在肿瘤组织中高效聚集。此外，tem图像也证明所制备的纳米粒子为光滑球形结构，粒径与dls所测基本一致。
[0127]
该载体材料可以自组装形成双ph响应可电荷反转的载药纳米粒子(dox-m)以抑制肿瘤的生长和转移其中。纳米粒子被细胞内吞后，亚胺键在细胞酸性环境中迅速断裂，抗肿瘤药物dox+lap被释放到细胞质中以协同抑制细胞增殖，如图6所示。
[0128]
图6zeta电位结果显示，药物载体在中性条件下为负电性，而在肿瘤组织细胞环境中由于ph值的变化可以迅速将表面电位由负电性逆转为正电性。这种超快速的电荷反转效应显著增强了肿瘤细胞对纳米粒子的摄取，实现了药物的快速精准的靶向递送。
[0129]
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。