一种薏苡仁多菌发酵液及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及发酵技术领域，尤其涉及一种薏苡仁多菌发酵液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌统称；乳酸菌发酵的代谢产物主要有有机酸类、细菌素类、乙醛等芳香物质、胞外多糖等。乳酸隶属于α-羟基酸(aha)，可以加快细胞的新陈代谢，去除皮肤不健康角质，使肤色得到改善；经过乳酸菌发酵可将碳水化合物和糖分转化成皮肤喜好的酶和氨基酸，使有效成分被分解和微化。乳酸乳球菌是革兰氏阳性，兼性厌氧菌。当血红素存在时，它能使乳酸乳球菌的代谢方式改变，进行有氧呼吸。在有氧呼吸方式下，乳酸乳球菌有更快的生长速率、较高的存活率，且乳酸乳球菌的生物量可显著提高。
3.薏苡仁营养丰富，其中可溶性糖6.38-8.25％，粗脂肪9.5-11.5％，蛋白质14.7-16.63％，总氨基酸量12.57-12.75％，油脂5％，被誉为“世界禾本科植物之王”，有研究表明薏苡仁提取物可通过抑制酪氨酸酶来抑制黑色素生成。市面上存在的薏苡仁提取物，采用水提法提取效率不高，醇提法会引入对人体刺激性较大的醇类，而一些其它的如超临界流体萃取则操作复杂。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种薏苡仁多菌发酵液及其制备方法和应用，以提高薏苡仁提取物的美白和抗氧化效果，同时成分对人体刺激小，安全性能高。
5.为了解决上述技术问题，本发明目的之一提供了一种薏苡仁多菌发酵液的制备方法，采用混合菌种发酵薏苡仁，所述混合菌种包括乳酸乳球菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。
6.作为优选方案，发酵过程中，所述乳酸乳球菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的添加量为0.2wt％-2wt％，所述乳酸乳球菌菌液浓度为8-10g/l，所述保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的含菌量均为100亿cfu/g。
7.作为优选方案，包括以下步骤：
8.(1)菌种准备；
9.(2)将薏苡仁糖化处理，制备薏苡仁发酵培养基底物；
10.(3)将步骤(1)所得的乳酸乳球菌、嗜热链球菌和保加利亚乳菌接种到薏苡仁发酵培养基中，发酵得到薏苡仁多菌发酵液初产品；
11.(4)在薏苡仁多菌发酵液初产品内加入溶菌酶，搅拌均质后，离心收集上清；过滤后得到薏苡仁多菌发酵液。
12.作为优选方案，在步骤(2)中，将薏苡仁粉末与水混合后加入cacl2，糊化处理，冷却至75-80℃，加入α-淀粉酶，保温进行液化处理；调节ph至4-4.2，随后冷却至60℃后加入
糖化酶，75-80℃保温进行糖化，最后灭菌，得到薏苡仁发酵培养基。
13.作为优选方案，在步骤(2)中，cacl2的添加量为底物质量的1-5％，糊化时间为0.5-2.5h；α-淀粉酶的酶使用量为10-50u/g薏苡仁粉，液化时间为1-5h；糖化酶的酶使用量为100-500u/g薏苡仁粉，糖化时间为1-5h。
14.作为优选方案，在步骤(4)中，溶菌酶的添加量为0.2-2g/l。
15.作为优选方案，在步骤(4)中，搅拌时间为1-5h，均质次数为2-8次。
16.作为优选方案，在步骤(4)中，过滤为依次经过0.8μm和0.22μm滤膜过滤。
17.作为优选方案，所述乳酸乳球菌为乳酸乳球菌mg1363。
18.为了解决上述技术问题，本发明目的之二提供了一种采用上述薏苡仁多菌发酵液的制备方法获得的薏苡仁多菌发酵液。
19.为了解决上述技术问题，本发明目的之三提供了一种薏苡仁多菌发酵液在化妆品中的应用。
20.作为优选方案，所述薏苡仁多菌发酵液的质量分数在0.5wt％以上。
21.相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：
22.1、本技术采用乳酸乳球菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌三种菌种混合对薏苡仁进行发酵，其中乳酸乳球菌为其中的发酵优势菌，发酵液中总酚和总酸的含量显著提高，对羟自由基清除率和对酪氨酸酶活性抑制效果提高，发酵液的抗氧化性能和美白性能优越。
23.2、本技术的发酵过程中无需使用乙醇进行洗涤，无需处理乙醇去除的步骤，避免乙醇残留的风险，最终成品中含有发酵液滤液和多菌溶胞产物，性能更卓越。
24.3、本技术发酵过程中采用高密度兼性厌氧发酵工艺进行，同时发酵的乳酸乳球菌mg1363为基因工程培养技术获得菌种，菌种繁殖量和活性更高。
附图说明
25.图1：为本发明实施例一中一种薏苡仁多菌发酵液的制备方法的流程示意图；
26.图2：为本发明实施例1中薏苡仁多菌发酵液在检测菌量生长趋势中获得的电泳条带结果(注：1、2、3表示三个生物重复；乳酸乳球菌条带为991bp；保加利亚乳杆菌条带为为650bp；嗜热链球菌条带为为797bp)；
27.图3：为本发明实施例1中薏苡仁多菌发酵液在斑马鱼试验中黑色素抑制率的统计结果(注：与control相比，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001)。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.人体因为与外界的持续接触，包括呼吸(氧化反应)、外界污染、放射线照射等因素不断的在产生自由基，抗氧化即抗自由基。氧化表现在皮肤方面，是皮肤被氧化后容易暗沉，因此有效清除皮肤上的自由基即可使肤色提亮达到美白亮肤的目的。多酚是很强的抗氧化剂。多酚中的酚经基结构(邻苯二酚或邻苯三酚》中的邻位酚经基很容易被氧化成醒类
结构,同时对活性氧等自由基具有很强的捕捉能力,这使多酚具有较强的清除自由基的能力。因此当发酵液中总酚含量越多，其抗氧化效果越好。
30.以乳酸菌对薏苡仁进行生物转化后，可将薏苡仁中的大分子分解为小分子物质，且能产生有益的有机酸如乳酸和丁酸等，可溶性膳食纤维含量显著增加，且发酵后游离脂肪酸和游离氨基酸含量显著增加。其中，乳酸可对皮肤的废旧角质进行温和剥脱，达到焕白亮肤的目的。
31.同时，不同种属菌在共同发酵时有各种交互关系，乳酸乳球菌与嗜热链球菌间存在偏利共生关系，嗜热链球菌的存在可以较好地促进乳酸乳球菌的生长发酵。本技术从乳酸乳球菌和双歧杆菌到嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的混合体系，并试图改善薏苡仁发酵液的性能。
32.实施例一
33.一种薏苡仁多菌发酵液的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
34.(1)菌种准备:
35.a、乳酸乳球菌来自于ntcc典型培养物保藏中心mg1363，购自荷兰nizo公司，乳酸乳球菌甘油菌于m17平板常规操作活化后挑选单克隆菌落接种到m17培养基中30℃进行过夜培养20h；将过夜培养得到的菌液以1％的比例接种到高密度培养基中培养48h，高密度培养基的配方如表1所示，得到浓度为8-10g/l的乳酸乳球菌菌液；
36.b、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为山东中科嘉亿生物工程有限公司商品化的保加利亚乳杆菌菌粉(保加利亚乳杆菌-100亿cfu/g)与嗜热链球菌菌粉(嗜热链球菌-100亿cfu/g)。
37.(2)发酵底物制备：
38.将薏苡仁打碎成粉末状，过40目筛，取3kg，以料液比为1：10比例与30l水混合，再加入底物质量2％的cacl2，加热煮沸糊化1h，得到糊化液；所得的糊化液冷却至75-80℃，加入α-淀粉酶(酶使用量为20u/g薏苡仁粉)，75-80℃保温进行液化2h，得到液化液；在液化液中，调节ph至4-4.2，冷却至60℃后加入糖化酶(酶使用量为300u/g薏苡仁粉)，75-80℃保温进行糖化2h，得到糖化液；所得糖化液调ph至6.0，117℃高温高压灭菌20min，得到薏苡仁发酵培养基。
39.(3)工业化发酵：
40.薏苡仁发酵培养基降温到37℃，将步骤(1)所得的乳酸乳球菌菌液、保加利亚乳杆菌菌粉和嗜热链球菌菌粉分别以1％重量比例加入到步骤(2)所得薏苡仁发酵培养基中，在50l的发酵罐厌氧发酵48h，得到薏苡仁多菌发酵液初产品。
41.(4)终产品获得：
42.对上述获得的薏苡仁多菌发酵液初产品内加入1g/l的溶菌酶，于30℃条件下搅拌作用2h；收集罐内产物，均质机均质5次(压力500-800bar)后，4℃，18000rpm/min，离心20min，收集上清；依次经过0.8μm和0.22μm滤膜过滤后，所得滤液即为本发明所述薏苡仁多菌发酵液。
43.表1-高密度培养基配方
[0044][0045][0046]
对比例一
[0047]
一种薏苡仁发酵液的制备方法，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于：步骤(3)中添加的乳酸菌为双歧杆菌，添加量为1％重量比例，来源于山东中科嘉亿生物工程有限公司商品化菌粉，含菌量为100亿cfu/g。
[0048]
对比例二
[0049]
一种薏苡仁发酵液的制备方法，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于：步骤(3)中添加的乳酸菌为乳酸乳球菌菌液，添加量为1％重量比例，乳酸乳球菌的来源与实施例一相同。
[0050]
对比例三
[0051]
一种薏苡仁多菌发酵液的制备方法，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺参数均与实施例一相同，不同的地方在于：步骤(3)中添加的乳酸菌为双歧杆菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，各个菌种的添加量为1％重量比例，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的来源与实施例一相同，双歧杆菌的来源与对比例一的相同。
[0052]
对比例四
[0053]
发明专利cn108078880b公开了一种包含薏苡仁发酵液的美白组合物，采用其中公开的薏苡仁发酵液的制备方法获得的薏苡仁发酵液。
[0054]
性能检测试验
[0055]
1、抗氧化功能检测：参考总抗氧化能力测定(frap法)检测总抗氧化，参考《水杨酸法测定黄酮对羟自由基清除能力的实验》检测对羟自由基清除率，参考《化妆品功效评价实验》第六章实验二十一《超氧阴离子自由基清除能力测试实验》检测超氧阴离子清除率，对实施例1和对比例1-3获得的发酵液进行检测，同时检测步骤(2)发酵前的薏苡仁发酵培养基样品，获得的对羟自由基清除率结果如表2所示。
[0056]
2、美白功能检测：参考t/gdca 006-2021《化妆品原料对酪氨酸酶活性抑制试验方法(体外法)》的标准检测对酪氨酸酶抑制率，对实施例1和对比例1-4获得的发酵液进行检测，同时检测步骤(2)发酵前的薏苡仁发酵培养基样品，获得的对酪氨酸酶抑制率结果如表2所示。
[0057]
表2-实施例1和对比例1-3中薏苡仁发酵液的抗氧化和美白功能检测结果
[0058][0059]
如表2所示，实施例1获得的薏苡仁多菌发酵液对对羟自由基和超氧阴离子清除效果以及对酪氨酸酶活性抑制效果最优，说明本技术获得的发酵液的抗氧化效果最佳。
[0060]
3、理化性质检测：采用gb/t 12456-2008标准检测总酸含量，采用gb/t8313-2018标准检测总酚含量，采用dns法检测总糖含量，检测样品为实施例1步骤(2)中发酵前的薏苡仁发酵培养基样品和发酵后获得的薏苡仁多菌发酵液，同时检测汕头市勋诺化工科技有公司生产的乳酸杆菌/薏苡仁发酵液作为竞品，以及检测对比例4获得的薏苡仁发酵液作为参比，检测结果如表3所示。
[0061]
4、乳酸含量检测：参考《化妆品安全技术规范-2015版》中第四章理化检验方法中(3.1α-羟基酸第一法)高效液相色谱法检测样品的乳酸含量，检测样品为实施例1步骤(2)中发酵前的薏苡仁发酵培养基样品和发酵后获得的薏苡仁多菌发酵液，同时检测对比例4获得的薏苡仁发酵液作为参比，检测结果如表3所示。
[0062]
表3-实施例1与各对照组的总糖、总酚和总酸的含量测定结果
[0063][0064]
注：实施例1与发酵前有显著性差异(p《0.05)a；实施例1与参比例有显著性差异(p
《0.05)b；实施例1与竞品有显著性差异(p《0.05)c。
[0065]
如表3所示，实施例1中获得薏苡仁多菌发酵液的总糖的含量与参比和竞品均有显著性差异；总酚和总酸的含量与发酵前、竞品和参比例均有显著性差异；此外经过乳酸乳球菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵后的薏苡仁发酵液中乳酸的含量与发酵前相比显著性增加，同时乳酸含量相比于参比含量较高。发酵液中乳酸和多酚含量的增加均可以增强美白效果。
[0066]
5、检测实施例1中三种乳酸菌不同发酵阶段的菌量生长趋势，包括以下步骤：
[0067]
1)样品处理：采用实施例1方法制备薏苡仁多菌发酵液过程中，分别在发酵时间0h、4h、8h、24h、28h、32h、48h提取发酵液，发酵液样品经两层无菌纱布过滤，取滤液过100μm过滤器，过滤液再经40μm过滤器过滤，得到的滤液经15000rpm/min离心5min，得到菌体沉淀样品。
[0068]
2)基因组dna提取：根据omega细菌dna提取试剂盒bacteria dna kitd3550-1操作。
[0069]
3)特异性引物设计：根据三种菌种的16s rrna基因可变区序列，采用premier 5设计特异性引物，如表4所示。
[0070]
4)pcr反应程序：94℃预变性4min,94℃变性30sec、55℃退火30sec、72℃延伸1min(30个循环)，72℃延伸5min。
[0071]
5)电泳：1％琼脂糖凝胶电泳，每个泳道上样量为10μl，电泳条带检测结果如图2所示。
[0072]
表4-三种乳酸菌的pcr引物序列
[0073][0074]
如图2所示电泳条带的亮度可以看出，发酵到4h时菌种的条带亮度较高，其中乳酸乳球菌在三种菌种中的菌量最多，且在前24h发酵时间持续增长，因此乳酸乳球菌为多菌发酵中的优势菌种。
[0075]
6、斑马鱼试验：根据团标t/hpcia 005-2021《化妆品美白功效的测定斑马鱼胚法》检测，将实施例1获得的薏苡仁多菌发酵液0.5％、1％、2％质量浓度作为测试样品，同时以空白(control)、溶剂(arbutin1.0mg/ml)作为对照组，斑马鱼鱼胚黑色素生成抑制率的测试结果统计数据如图3所示。
[0076]
如图3所示，实施例1样品处理的斑马鱼胚黑色素生成抑制率随浓度的增加而提高，说明斑马鱼鱼胚可以明显变白，可以减少黑色素颗粒分布，具有统计学显著性差异，说
明实施例1获得的薏苡仁多菌发酵液在质量浓度为0.5％-2％时具有美白功效。
[0077]
7、人体祛斑功效测评，包括以下步骤：
[0078]
1)样品制备：将实施例1配制成5％质量浓度的薏苡仁发酵液样品后进行人体功效评价，具体配方如下表5所示。
[0079]
表5-5％质量浓度的薏苡仁发酵液的配方
[0080][0081]
2)样品使用方法：使用前清洁面部，先涂抹基础保湿水，再取适量样品均匀涂抹于产品侧，直至完全吸收，对照侧使用空白基质样品；每天2次，早晚各一次，连续使用56天；在试验期间，受试者禁止使用影响美白祛斑测试的制剂；受试者禁止点滴、注射、口服或其他形式摄入影响美白祛斑测试的制剂；受试者以室内活动为主，避免长期暴露在室外光照下；在试验期间不能有暴晒情况，并应做好试验部位的防晒工作。
[0082]
3)客观定量评价：面部清洁30min后，使用visia-cr面部图像分析仪进行面部拍摄，并用ipp软件在色斑位置的同等大小区域(aoi，area of interest，r＝1cm)内进行色斑分析，并用cl400和mx18于试验部位检测皮肤ita
°
值和黑素指数(mi)，以上测量值均作为基线值(d0)，然后进行产品发放并指导使用方法；受试者使用产品后14天(d14)、28天(d28)及56天(d56)需回访并进行同样的指标检测；同一个受试者的测试使用同一仪器、同一测试人员完成，两个测试时间点之间应保持测试部位前后一致，测试结果如表6所示。
[0083]
表6-实施例1中5％质量浓度的薏苡仁多菌发酵液祛斑检测结果(n＝33)
[0084][0085][0086]
注：与d0相比有显著性差异(p《0.01)**。
[0087]
4)判定标准：根据国家药品监督管理局2021年颁布的《化妆品祛斑美白功效测试方法》第二法人体开放使用祛斑美白功效测试法进行人体功效评价。试验组(侧)使用产品前后任一访视时点仪器测试或图像分析相关参数中任一参数的变化结果相差显著(p《0.05)，或使用样品后测试值结果显著优于对照组(侧)结果时(p《0.05)，则认定试验产品有祛斑美白功效，否则认为试验产品无祛湿热斑美白功效。
[0088]
如表6结果显示，受试者使用5％浓度的薏苡仁多菌发酵液后，皮肤ita
°
值在各回访时间点(d14、d28及d56)均有上升趋势，d28与基线值有显著性差异，d56与d28之间无显著性差异，说明使用56天可维持美白效果，不返黑；色斑mi值在各回访时间点(d14、d28及d56)逐渐下降，d28及d56与基线值有显著性差异，而d14与基线值及对照侧相比差异均不明显；根据《化妆品祛斑美白功效测试方法》第二法人体开放使用祛斑美白功效测试法中3.8可判定5％的薏苡仁多菌发酵液具有祛斑美白功效。
[0089]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。