水稻种子中稻瘟病菌RPA快速检测方法及应用

水稻种子中稻瘟病菌rpa快速检测方法及应用
技术领域
1.本发明属于农作物分子遗传育种学领域，涉及水稻种子中稻瘟病菌rpa快速检测方法及应用。


背景技术：

2.水稻作为我国重要粮食作物之一，在保证国家粮食安全方面有着重大的意义。水稻生长过程中常常遭受稻瘟病(rice blast)的危害，而稻瘟病菌(magnaporthe oryzae,m.oryzae)作为水稻稻瘟病发生的病原菌，对水稻的生长发育产生了严重危害。播种带菌水稻种子往往造成苗瘟，使水稻秧苗产生病斑甚至枯死。对水稻种子中的稻瘟病菌进行检测，可以提前采取预防措施，减少稻瘟病的发生，对水稻生产有重要意义。
3.rpa是一种快速灵敏的新型核酸恒温扩增技术，能在37-42℃之间进行反应，10-20min内获得可检出水平的扩增产物。此外rpa体系较为稳定，可直接利用粗提取的核酸样本进行扩增，因此为了建立简便快速的稻瘟病菌检测法，rpa是一个比较好的选择。因为其极高的特异性和灵敏度且反应在恒温下发生的特性，重组酶聚合酶扩增检测技术已被广泛运用于病原物检测领域。


技术实现要素：

4.本发明的目的是：基于rpa技术建立一种快速检测水稻种子中稻瘟病菌的方法，并采用naoh溶液粗提法对水稻种子中稻瘟病菌进行核酸提取，为农业生产上提供一种方便快捷、安全可靠的检测技术。
5.本发明的目的可通过如下技术方案实现：
6.用于水稻种子中稻瘟病菌检测的rpa引物组合物，其特征在于选自以下任意一组:
7.第一组由seq id no.1所示的引物fi，seq id no.2所示的引物ri组成；
8.第二组由seq id no.3所示的引物fii，seq id no.4所示的引物rii组成。
9.本发明所述的rpa引物组合物在检测水稻种子稻瘟病菌中的应用。
10.一种检测水稻种子稻瘟病菌的rpa快速检测试剂盒，包含本发明所述的rpa引物组合物。rpa技术(重组酶聚合酶扩增检测技术)检测水稻种传稻瘟病菌，包含如下操作步骤：
11.(1)取水稻种子样品，采用naoh溶液粗提法提取水稻样品基因组dna。取0.2g待测水稻种子置于含有小钢珠的2ml试管中，液氮速冻磨碎好后加入1000μl的0.5m naoh(0.5m naoh，10mm na2edta)裂解液，上下轻微摇晃混匀，并在室温条件下静置4min。取上层较清的研磨提取液，用te缓冲液(10mm tris，ph8.0，1mm edta)进行1:30倍数的稀释。取5.0μl稀释液直接用于rpa扩增。
12.(2)以水稻稻瘟病菌xm_003710175基因中种内保守、种间特异的一段序列为靶标设计引物(图2)，并且这段dna序列从未被用于稻瘟病菌的检测，针对这段dna序列设计了多组rpa引物，经过大量的筛选工作，剔除了那些扩增效果不好、稳定性差的引物，最终留下了两组rpa引物，如表1所示。
13.(3)按照体系：体积为50μl，其中a buffer(水化缓冲液)29.4μl，上下游引物(f/r)各2μl，再加入9.1μl ddh2o和5.0μl核酸模板，最后加入2.5μl mgac(醋酸镁)并充分混匀。反应条件为：密闭条件下，39℃恒温扩增20min。反应结束后，加入50μl酚/氯仿1:1抽提反应液，12000r
·
min-1
离心5min，取5μl上清液进行电泳检测，每个反应重复3次。
14.(4)将上述配制好的体系放在恒温水浴锅上进行扩增。反应温度为恒温39℃，时间为二十分钟。反应结束后每个试管取5μl反应上清液，通过琼脂糖凝胶电泳观察是否有扩增的目标条带，如果有扩增的目标条带，则在水稻种子中检测到了水稻稻瘟病菌；如果无扩增的目标条带，则种子中不带有水稻稻瘟病菌。
15.表1 rpa引物序列
16.名称引物序列(5'—3')ficttcgcaagaggtttcatatcttctcccg(seq id no.1)ritcgctagacaccatatatcacggggttatcc(seq id no.2)fiitctcctcgggtaatagatgcggagaaagc(seq id no.3)riiccaacatggtgagcagtcagactttccag(seq id no.4)
17.有益效果
18.本发明提供的利用rpa技术(重组酶聚合酶扩增检测技术)快速检测水稻种子带稻瘟病菌的方法，具有以下优点：
19.(1)反应在39℃恒温下进行，因此只需一台水浴锅即可，不需要pcr仪，节省了检测成本。
20.(2)检测结果可视化，通过琼脂糖凝胶电泳观察是否有扩增的目标条带来判断检测结果，且反应时间只用20min，方便快捷。
21.(3)采用naoh溶液粗提法提取水稻样品基因组dna，使核酸提取时间大大缩短，核酸粗提取过程只需要10min。
22.通过本发明提供的方法可以快速准确的诊断出水稻种子中是否含有稻瘟病菌，有利于防治稻瘟病，减少经济损失。
附图说明：
23.图1：水稻种子基因组dna重组酶聚合酶扩增结果。
24.其中：1号管为加水阴性对照，结果无条带；2-10号管为加入9组病谷水稻种子基因组dna模板，结果2-10号管均有目标条带，说明2-10号管水稻种子中均含有稻瘟病菌。
25.图2：rpa引物的位置
26.图3：普通pcr和rpa的灵敏度比较
27.其中：a.rpa中1号管为加水阴性对照，结果无条带；2-10号管分别为浓度550ng/μl，100ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl，100fg/μl，10fg/μl，1fg/μl的水稻稻瘟病菌dna扩增结果；其中2-5号管有目标条带。
28.b.普通pcr中1-10号条带分别为100ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl，100fg/μl，10fg/μl，1fg/μl的水稻稻瘟病菌dna扩增结果；其中2-5号琼脂糖凝胶电泳有条带。
29.图4：rpa特异性验证。
30.其中：1号管为加稻瘟病菌dna阳性对照，结果有目标条带；2-10管为加其它真菌的dna，结果无条带。
具体实施方式
31.实施例1
32.(一)材料与方法：
33.1.水稻稻瘟病菌菌株；9组病谷产生的水稻种子。
34.2.dna提取方法：用naoh溶液粗提法提取水稻稻瘟病菌小种2016-5a47，9组病谷水稻种子基因组dna。
35.3.rpa反应体系：体积为50μl，其中a buffer(水化缓冲液)29.4μl，上下游引物(f/r)各2μl，再加入9.1μl ddh2o和5.0μl核酸模板，最后加入2.5μl mgac(醋酸镁)并充分混匀。反应条件为：密闭条件下，39℃恒温扩增20min。反应结束后，加入50μl酚/氯仿1:1抽提反应液，12000r
·
min-1
离心5min，取5μl上清液进行电泳检测，每个反应重复3次。
36.反应条件为：密闭条件下，39℃恒温扩增20min。通过琼脂糖凝胶电泳观察是否有扩增的目标条带，如果有扩增的目标条带，则在水稻种子中检测到了水稻稻瘟病菌；如果无扩增的目标条带，则种子中不带有水稻稻瘟病菌。
37.(二)结果与分析：
38.研究结果发现，2-10号管中反应液均有目标条带，说明在9组病谷水稻种子中都带有水稻稻瘟病菌(图1)。
39.实施例2
40.(一)材料与方法：
41.1.水稻稻瘟病菌菌株。
42.2.dna提取方法：用ctab法提取水稻稻瘟病菌菌株的基因组dna。
43.3.将水稻稻瘟病菌小种2016-5a47的dna进行浓度梯度稀释，分别稀释为100ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl。
44.4.rpa反应体系：体积为50μl，其中a buffer(水化缓冲液)29.4μl，上下游引物(f/r)各2μl，再加入9.1μl ddh2o和5.0μl核酸模板，最后加入2.5μl mgac(醋酸镁)并充分混匀。反应条件为：密闭条件下，39℃恒温扩增20min。反应结束后，加入50μl酚/氯仿1:1抽提反应液，12000r
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min-1
离心5min，取5μl上清液进行电泳检测，每个反应重复3次。
45.反应条件为：密闭条件下，39℃恒温扩增20min。通过琼脂糖凝胶电泳观察是否有扩增的目标条带，如果有扩增的目标条带，则在水稻种子中检测到了水稻稻瘟病菌；如果无扩增的目标条带，则种子中不带有水稻稻瘟病菌。
46.普通pcr反应体系：体积为20μl,其中f和r引物(与rpa的fi/ri、fii/rii引物相同)各1μl，ddh2o 6μl，dna模板2μl，pcr 2
×
rapid taq master mix 10μl。
47.反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃复性15s，72℃延伸15s，34个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
48.(二)结果与分析：
49.rpa反应中，水稻稻瘟病菌dna含量为100pg/μl仍然能检测出，普通pcr也只能检测出dna含量为100pg/μl。本发明中rpa检测灵敏度和普通pcr灵敏度相同(图3)。
50.实施例3
51.(一)材料与方法：
52.1.水稻稻瘟病菌菌株；香柱属真菌(epichlo endophytes)、禾谷镰孢菌(fusarium graminearum)、藤仓镰孢菌(fusarium fujikuroi)、黄绿木霉菌(trichoderma xanthophyllum)、禾谷丝核菌(rhizoctonia graminis)、稻绿核菌uv-p1(ustilaginoidea virens uv-p1)、立枯丝核菌(rhizoctonia zeae)、青霉属真菌(penicillium fungi)、链格孢属真菌(alternaria fungi)。
53.2.dna提取方法：用ctab法提取各菌株的基因组dna。
54.3.rpa反应体系：体积为50μl，其中a buffer(水化缓冲液)29.4μl，上下游引物(f/r)各2μl，再加入9.1μl ddh2o和5.0μl核酸模板，最后加入2.5μl mgac(醋酸镁)并充分混匀。反应条件为：密闭条件下，39℃恒温扩增20min。反应结束后，加入50μl酚/氯仿1:1抽提反应液，12000r
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min-1
离心5min，取5μl上清液进行电泳检测，每个反应重复3次。
55.反应条件为：密闭条件下，39℃恒温扩增20min。通过琼脂糖凝胶电泳观察是否有扩增的目标条带，如果有扩增的目标条带，则在水稻种子中检测到了水稻稻瘟病菌；如果无扩增的目标条带，则种子中不带有水稻稻瘟病菌。
56.(二)结果与分析：
57.只有含水稻稻瘟病菌dna的1号管有目标条带，其他无条带。说明该rpa体系不仅灵敏度高，特异性也很强(图4)。