一株荧光假单胞菌及其在防治樱桃枝干病害中的应用的制作方法

1.本发明涉及一株荧光假单胞菌及其在防治樱桃枝干病害中的应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.樱桃枝干病害是樱桃生长期的一种常见病害，特别在幼苗移栽后及生长期的前三年发病严重。该病是由越橘间座壳(diaporthe vaccinii)侵染引起，樱桃树一旦感染此病，常常导致樱桃产量的下降，影响种植效益；若发现不及时，随着病原菌不断积累，樱桃树近乎全部死亡，造成绝收。
3.针对该病，目前主要通过剪枯枝、清园等物理措施进行防范，但该方法不能有效清除病原物，特别是在枯枝附近的健康植株中往往已侵染该病菌，虽把枯枝剪掉，但病原物还可不断侵染，严重影响来年樱桃挂果。喷施化学农药虽然在一定程度上能够缓解枯枝病的发病状况，但对于渗透性较差的农药来说往往指标不治本。化学农药的大量使用还会带来一系列问题，如：引起越橘间座壳抗药性，使其防治难度加大，还会造成环境污染，并且樱桃农药残留严重威胁人类健康。生物防治由于具有防效高、专一性强、药效持久性好、环境友好，以及不易产生抗药性等优点，因而受到越来越多的青睐。但目前对于樱桃枝干病害生物防治报道少之又少。
4.荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)隶属于变形菌门、假单胞菌目、假单胞菌科的假单胞菌属的细菌，在植物病害生物防治中用途广泛。目前报道有用于防治黄连白绢病(cn202110929652.3)、烟草角斑病(cn200910088952.2)、烟草野火病(cn200810224386.9)、多种细菌性软腐病(cn201810449282.1)等，但是没有发现荧光假单胞菌用于防治樱桃枝干病害的报道。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明提供了一株荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)gh2-1，该菌株及其发酵上清液对樱桃枝干病害菌均具拮抗效果，能够有效控制樱桃枝干病害的发生，可开发针对樱桃枝干病害的微生物农药，实现对樱桃枝干病害绿色、高效防治。
6.本发明首先自樱桃产区发病区域的健康植株根际土壤中分离，并经平板对峙培养法实验筛选到对樱桃枝干病害病原菌越橘间座壳(diaporthe vaccinii)具有较强拮抗效果的荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)gh2-1，然后将该菌株于2017年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.14743。实验表明：菌株gh2-1及其代谢产物均能有效抑制樱桃枝干病害菌生长，在樱桃枝干病害防治中具有广泛应用前景。
7.本发明还提供了上述荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)gh2-1的生物制剂。
8.该生物制剂的制备方法包括：将荧光假单胞菌gh2-1制备种子液后，将种子液接入
发酵培养基在25～30℃条件下发酵培养30～36h，得到发酵液，发酵液可以直接使用(液体制剂)，或者加入其他助剂，喷雾干燥制备成固体制剂，如可湿性粉剂等。
9.种子液培养基配方(质量比)：蛋白胨0.8～1.2％，牛肉粉0.2～0.4％，氯化钠0.4～0.6％，其余为水，调整ph7.3
±
0.1。优选种子液培养基配方(质量比)：蛋白胨1％，牛肉粉0.3％，氯化钠0.5％，其余为水，调整ph7.3
±
0.1。
10.发酵培养基配方(质量比)：蔗糖1.5～2.5％、可溶性淀粉1.5～2.5％、酵母浸粉1.0～2.0％、鱼蛋白胨0.3～0.5％、硫酸镁0.03～0.08％、磷酸二氢钾0.03～0.08％、碳酸钙0.5～0.8％，剩余为豆制品废水，ph调至7.0-7.2。优选的，发酵培养基配方(质量比)：蔗糖2％、可溶性淀粉2％、酵母浸粉1.5％、鱼蛋白胨0.4％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、碳酸钙0.6％，剩余为豆制品废水，ph调至7.0-7.2。
11.本发明采用豆制品废水代替水作为发酵培养基，豆制品废水中含有丰富的蛋白质、糖类、矿物质、维生素等，可以提供营养物质，豆制品废水中蛋白质含量控制在16-18％。
12.本发明还提供了荧光假单胞菌gh2-1菌株、代谢物以及生物制剂在拮抗樱桃枝干病害病原菌越橘间座壳(diaporthe vaccinii)，防治樱桃枝干病害方面的应用。
13.本发明的技术效果是：
14.1、防治樱桃枝干病害效果好
15.平板对峙实验表明：荧光假单胞菌gh2-1菌株及其发酵上清液对樱桃枝干病原菌越橘间座壳(diaporthe vaccinii)均具较强的拮抗效果，抑菌率分别为90.98％和87.45％；同时，该菌株液体制剂300倍稀释液田间对樱桃枝干病害防治效果为64.3％，能够有效控制樱桃枝干病害的发生。在樱桃枝干病害防治中具有广泛应用前景。
16.2、该菌株易于发酵生产，使用方式简单，适合大面积推广使用。
附图说明
17.图1为不同菌株对樱桃枝干病原菌越橘间座壳(diaporthe vaccinii)的平板抑制效果；
18.图2为不同菌株对樱桃枝干病原菌越橘间座壳(diaporthe vaccinii)的抑菌率比较；
19.图3为不同菌株发酵上清液对樱桃枝干病原菌越橘间座壳(diaporthe vaccinii)的平板抑制效果；
20.图4为不同菌株发酵上清液对樱桃枝干病原菌越橘间座壳(diaporthe vaccinii)的抑菌率比较；
21.图5为荧光假单胞菌gh2-1单菌落形态。
具体实施方式
22.以下结合实施例来说明其效果。
23.实施例1：荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)菌株gh2-1的分离与纯化
24.本发明的荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)菌株gh2-1是采用稀释涂布法从山东省潍坊市临朐县冶源镇樱桃产区发病区域的健康植株根际土壤中分离获得的，具体分离方法为：
25.(1)土样采集
26.采用五点取样法采集樱桃枝干病害发病区域的健康樱桃根系，放入保鲜袋带回实验室；利用毛刷轻刷樱桃树根系，收集土壤即为根际土壤。
27.(2)土壤悬液制备
28.准确称取1g根际土壤于盛有99ml无菌水的三角瓶中，三角瓶内含玻璃珠，置于28℃摇床中120～140rpm均匀震荡20～30min，然后置于55～60℃水浴锅中孵育25min，即为土壤悬液；
29.(3)稀释涂布
30.利用10倍稀释法将菌样依次稀释成10-1
～10-6
稀释度的菌样；分别从10-4
、10-5
和10-6
稀释度的菌样中吸取100μl涂布于na培养基中平板上，每个梯度涂布三个平行；
31.(4)培养纯化
32.在28℃培养24～30h后挑取na培养基上的不同形态的微生物菌落于na培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况；然后采用平板划线法挑单菌纯化，分别编号保存。
33.通过上述方法，依照不同菌落形态，初步分离到14株菌，分别编号为gh2-1～gh2-14。
34.实施例2：樱桃枝干病害高效拮抗菌株筛选
35.(1)初筛
36.利用平板对峙培养法，对高效拮抗樱桃枝干病害病原越橘间座壳(diaporthe vaccinii)的拮抗菌株进行筛选。
37.将实施例1中分离纯化的14株待测菌株于na培养基上划线培养，28℃恒温培养24h；用接种环挑取一环菌苔接种于含10ml nb培养基的50ml三角瓶中，于28℃摇床中120rpm/min均匀震荡36h，得到待选菌株的菌液。
38.挑取一块樱桃枝干病害菌菌种于pda培养基上进行活化培养，28℃恒温培养60h；用打孔器在活化好的樱桃枝干病害菌边缘打取直径为5mm的菌饼，接种在pda平板中央；在距中央2.0cm的两侧用接种环点接活化待选菌株菌液10μl；对照组在接种5mm樱桃枝干病害菌菌饼另外两侧相同距离处接种10μl nb培养基；每一处理重复3次；处理完成后，28℃恒温培养，逐日观察待选菌株对病原菌的抑制作用，待对照组病原菌长满平板后，测量实验组病斑的大小，并计算抑菌率。
39.抑菌率＝[(对照菌落直径-菌饼直径)-(处理菌落直径-菌饼直径)]/(对照菌落直径-菌饼直径)
×
100％。
[0040]
结果显示，在实施例1中分离到的14株菌中，有6株菌对樱桃枝干病害菌生长有抑制效果，分别为gh2-1、gh2-2、gh2-4、gh2-5、gh2-6和gh2-9(图1、表1)；通过对不同菌株抑菌率计算统计发现，菌株gh2-1对樱桃枝干病害菌抑制效果高达90.98％，显著高于其他菌株(表1、图2)。
[0041]
表1不同菌株抑菌率统计
[0042][0043]
(2)复筛
[0044]
利用含毒介质法比较了gh2-1、gh2-2、gh2-4、gh2-5、gh2-6和gh2-9菌株发酵上清液对樱桃枝干病原菌越橘间座壳(diaporthe vaccinii)的抑制效果。具体方法如下：
[0045]
将初筛筛选到的6株待测菌株于na培养基上划线培养，28℃恒温培养24h；用接菌环移取一环接种于装有10ml nb培养基的三角瓶中(50ml)，28℃、120rpm/min恒温振荡培养24h得到其种子液；种子液按照1％接种量接入装有100ml na液体培养基的三角瓶中(250ml)，28℃、120r/min恒温振荡培养36h，得到其发酵液；发酵液经离心后用0.22μm细菌过滤器过滤，得到发酵上清液。
[0046]
将发酵上清液与温度45～50℃的pda培养基按体积比1:19比例混匀倒入培养皿中，冷却后在平板中央放入直径5mm的病原菌菌饼；对照组按照相同比例加入无菌水代替发酵上清液；每一处理重复3次；处理完成后，28℃恒温培养，逐日观察6株菌株发酵上清液对病原菌的抑制作用，待对照组病原菌长满平板后，测量实验组病斑的大小，并计算抑菌率。
[0047]
结果表明，gh2-1、gh2-2、gh2-4、gh2-5、gh2-6和gh2-9发酵上清液均对樱桃枝干病害菌生长有抑制效果；其中，gh2-1与gh2-5发酵上清液对樱桃枝干病害菌抑制率分别为87.45％和83.92％，显著高于其他菌株发酵液抑菌活性，但两者无显著性差异(见表2和图3-4)。结合菌株gh2-1对樱桃枝干病害菌抑制结果，我们选择gh2-1作为我们的功能菌株进行后续研究开发。
[0048]
表2不同菌株发酵上清液抑菌率统计
[0049]
[0050]
以上结果可以说明，菌株gh2-1及其代谢产物均能高效抑制樱桃枝干病原越橘间座壳(diaporthe vaccinii)生长，在樱桃枝干病害防治中具有广泛应用前景。
[0051]
实施例3：菌株gh2-1鉴定
[0052]
(1)微生物学特性：该菌株在na培养基上生长后，菌落不规则，表面湿润光滑，粘稠，半透明，有黄绿色色素产生(图5)。
[0053]
(2)分子生物学特性
[0054]
该菌株的16s rdna基因序列测定结果如下(seq-1)：taagatcgctgggggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggtagagagaagcttgcttctcttgagagcggcggacgggtgagtaaagcctaggaatctgcctggtagtgggggataacgttcggaaacggacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctcccagatgagcctaggtcggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaagtgagactcggtccaaccctacggggcgcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttamgttgggaggaagggcattaacctaatacgttagtgtttcgacgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggtttgttaagttggatgtgaaggccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactgactgactagagtatggtagagggtggtggaatttcctgtgtagyggtgaaatgcgttgatataggaaggaacaccagtggtgaaggcgaccacctggactaatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttgggtgccttgagctcttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggagagtacggtcgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatccaatgaactttctagagatagattggtgccttcgggaacattgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtcgatagttaccagcacgtaatggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggcctggcctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccacaaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagctagtctaaccttcgggaggacggttaccacggtgtgattcatgactggagtgaagtcgtaacaaggtagccgtaggggaacctgcggctggaacaggtccgg
[0055]
经微生物学特性和分子生物学特性，鉴定菌株gh2-1为荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)，该菌株已于2017年09月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.14743。
[0056]
实施例4：荧光假单胞菌gh2-1液体制剂制备过程
[0057]
种子液培养基配方(质量比)：蛋白胨1％，牛肉粉0.3％，氯化钠0.5％，其余为水，调整ph7.3
±
0.1。
[0058]
发酵培养基配方(质量比)：蔗糖2％、可溶性淀粉2％、酵母浸粉1.5％、鱼蛋白胨0.4％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、碳酸钙0.6％，剩余为豆制品废水(蛋白质含量17％)，ph调至7.0-7.2。
[0059]
荧光假单胞菌gh2-1液体制剂制备过程：
[0060]
(1)种子液获取：将荧光假单胞菌gh2-1从试管斜面中挑取少量细菌，移至种子液培养基中，28℃、120r/min恒温振荡培养24h，此为种子液；
[0061]
(2)大量发酵培养：将发酵培养基物料在发酵罐中灭菌(温度121～124℃，30min)；在无菌条件下，将培养好的种子液(按接种体积比5％)倒入发酵罐中，在28℃条件下发酵培养30～36h，菌数可达650亿/ml左右，转孢率可达80％左右，发酵液即为gh2-1液体制剂。
[0062]
实施例5：荧光假单胞菌gh2-1液体制剂对樱桃枝干病害防治效果
[0063]
本实施例提供了荧光假单胞菌gh2-1液体制剂针对樱桃枝干病害的相关实验。
[0064]
(1)供试药剂
[0065]
gh2-1液体制剂(实施例4制备)。
[0066]
(2)供试材料与防治对象
[0067]
供试材料为樱桃幼苗；防治对象为樱桃枝干病害，病原越橘间座壳(diaporthe vaccinii)。
[0068]
(3)试验地情况
[0069]
试验地设在潍坊市临朐县樱桃产区。往年樱桃枝干病害在该地发病严重，特别是樱桃苗移栽后因感染樱桃枝干病害成活率较低；我们于2020年3-4月进行林间防治樱桃枝干病害试验。所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时樱桃枝干病害处于发病初期。
[0070]
(4)试验设计及安排
[0071]
本试验设计了荧光假单胞菌gh2-1液体制剂300倍稀释和不施药清水做对照共2个处理，每个小区200m2，重复3次，共6个小区，各小区随机排列。共施药两次，第一次于2020年3月15日进行浸根处理；移栽缓苗15d后于2020年3月底第二次施药，本次方式为灌根，每一小区施用量100公斤。4月底进行发病情况调查。
[0072]
(5)试验调查及计算方法
[0073]
最后一次用药间隔30d后统计发病状况，并计算防治效果。
[0074]
樱桃枝干病害发病级数参照表3，以单株为单位。
[0075]
表3樱桃枝干病害发病分级标准
[0076][0077]
药效按如下的病情指数和防治效果进行计算：
[0078]
病情指数di(％)＝[∑(病级数)
×
该级发病植株数)]/[(病级最高值
×
调查总株数)]
×
100％；
[0079]
防治效果(％)＝(对照病级指数-处理病情指数)/对照病情指数
×
100％。
[0080]
(6)结果
[0081]
各个处理后樱桃枝干病害的发病指数及防治效果如表4所示。
[0082]
表4各个处理后樱桃枝干病害的发病指数及防治效果
[0083][0084]
表4结果表明，最后一次施药后30d，荧光假单胞菌(p.fluorescens)菌株gh2-1液体制剂对樱桃枝干病害有较好的防治效果，防治效果为64.3％。这进一步说明菌株gh2-1在樱桃枝干病害防治中具有广泛应用前景。