CRISPR/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统及制备方法与应用与流程

crispr/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统及制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及领域，尤其涉及crispr/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统及制备方法与应用。


背景技术：

2.为了有效控制疫情的发展，新冠肺炎疫情的检测非常重要。国内外各研究团队和机构已经开发了各种有效的新冠肺炎检测手段和工具。但各种检测方法的改进仍值得进一步探索。为了有效控制疫情的发展，新冠肺炎疫情的检测非常重要。国内外各研究团队和机构已经开发了各种有效的新冠肺炎检测手段和工具。在本次疫情中，我们可以通过流行病学病史、临床表现、核酸检测、基因测序和抗体检测，全面确定患者是否感染了covid-19。但要特别注意检测过程中的假阳性和假阴性问题。目前，covid-19的检测方法是缩短检测时间，简化检测步骤，降低检测成本，检测环境安全，准确检测结果。因此，对该检测方法的改进仍值得进一步探索。
3.基于crispr/cas12a系统的生物传感器系统已经相继被开发出来，并已经检测到了多种靶点。如单核苷酸多态性、致病菌、转基因作物、covid-19和其他致病性病毒。一些crispr/cas12a检测平台经常将crispr系统与核酸扩增技术相结合，如pcr、lamp、rpa、raa等。核酸扩增技术的应用可以大大提高目标含量，从而大大提高crispr检测平台的灵敏度。利用crispr/cas12a系统和rt-lamp技术，针对covid-19的n基因和e基因，开发了基于胶体金检测论文的crispr/cas12a检测平台。该法对covid-19检测有良好准确性和特异性。检测灵敏度最高可达10个拷贝/ul。还有采用rt-raa等温扩增技术、crispr/cas12a检测系统和磁珠上的生物传感器对信号进行扩增和转导，通过家用血糖仪输出信号，在10-104拷贝/ul的浓度范围内实现定量检测，有良好检测准确性、特异性和实用性，不需要专业设备和复杂操作，然而，扩增导致检测时间长，检测成本高。
4.低场核磁共振(lf-nmr)是核磁共振技术的延伸，是一种新兴技术，与核磁共振技术相比，lf-nmr技术有较低的场强，其恒定场强低于0.5t。因为它的优点设备小，操作简单，分析成本低，重复性好，结果精度高，弥补和改善了核磁共振和其他分析方法和检测技术。但由于lf-nmr技术的场强较低，虽能无损检测样品内部结构和各种指标，但却无法区分不同质子的化学位移，导致其对微量物质的检测仍受到一定的限制。因此，开发了一种检测介质来实现核磁共振，信号放大的功能将成为未来开发一种更灵敏、更高效的无损检测系统的热点。因此，测量纵向弛豫时间(t1)横向弛豫时间(t2)，扩散系数(d)用来反映样品中特定质子的运动特性，从而获得样品中目标成分的信息。采用核磁共振系统中的氢、碳磷谱和定量或二维核磁分析方法与统计分析相结合的方法进行检测。同时与传统的拉曼光谱、红外光谱、荧光、介电测试等技术进行比较，lf-nmr检测技术更加多样化和方便，可以无破坏性、重复测定。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供crispr/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统及制备方法与应用，以解决上述技术问题。
6.为实现上述目的本发明采用以下技术方案：crispr/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统，其在covid-19的快速检测的应用。
7.crispr/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统，病毒核酸提取试剂盒和逆转录放大cdna通过rt-rpa反应，然后二进制复杂cas12和特定的引导rna添加形成一个三联体与cdna元复合物，从而激活cas12a蛋白的反式裂解活性，通过制备不同粒径的磁性纳米颗粒，耦合单链dna形成桥，制备了磁响应探针，由于不同粒径的磁性纳米颗粒在磁场作用下的磁性吸附力不同，实现两种不同粒径的分离，激活的cas12a蛋白疯狂地切割磁性探针的桥链，触发磁性粒子的分散，根据不同的t2弛豫时间，利用低场核磁传感器探测器分析粒子的聚集和分散状态，通过改变t2弛豫时间检测病毒核酸。
8.crispr/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统的制备方法，包括如下步骤：步骤1、氨基修饰的300nm超顺磁性纳米粒子的制备；使用分析天平称量7g1,6-六甲基二胺，2gnaoac和1gfec
l3·
6h2o.将称量粉放入三颈瓶中混合，在三颈瓶中加入30毫升乙烯二胺后密封三颈瓶，瓶口涂抹密封油脂，将搅拌桨插入密封的三颈烧瓶中，放入50
°
c水浴中加热并搅拌5小时，将搅拌后得到的棕红色混合溶液转移到聚四氟乙烯反应器中并密封，置于205
°
c的高温烘箱中放置6小时。取出反应完成产生的黑色粉末，用50%乙醇溶液进行磁分离洗涤，反复4次，充分洗脱材料表面的有机溶剂，将洗过的混合物放入烤箱，在50
°
c下干燥6小时，在确认粉末足够干燥后，收集粉末并储存在一个密封的容器中；步骤2、370nm氨基改性硅涂层超顺磁性纳米颗粒的制备；使用分析天平称出423毫克铁(ac)3，放入100毫升四颈瓶中，加入15毫升油胺，在磁力搅拌器上搅拌，慢慢将温度升高至140
°
c，并保持30min，在此期间，保持氩气的流动，直到溶液变黑，当溶液变黑时，搅拌温度迅速升高到330
°
c，继续搅拌1小时，然后停止搅拌，将溶液冷却至室温后，加入20ml乙醇溶解沉淀颗粒，通过磁性分离溶液，丢弃上清液来分离磁性粒子，用无水乙醇清洗磁性颗粒两次，后用正己烷清洗三次，将所得产品放入烤箱，调整温度至50
°
c，干燥24小时；将获得的四氧化三铁磁性纳米颗粒用二氧化硅修饰并与氨基结合，用分析天平称重制备的600mg四氧化三铁磁性纳米颗粒，并放入三颈瓶中。首先，在超声波清洗器中，超声波分散10分钟。在超声处理后的磁性颗粒中加入41.5ml纯水和37.5ml无水乙醇，继续超声处理10分钟。超声处理后，加入氨水20ml和teos4ml。在三颈烧瓶中加入一个磁铁，用一个磁力搅拌器以200rpm的速度进行2小时的搅拌反应。反应结束后，用乙醇洗涤磁性颗粒3次，置于70℃的烤箱中，干燥6小时。
9.步骤3、磁响应探针的制备；准备实验所需的hepes缓冲液，用分析天平称量氯化镁和氯化钠，使最终缓冲系统包含25mmol氯化镁和10mmol氯化钠，然后使用ph试剂使最终ph为7.2。将购买的单链dna在离心机中离心，确保引物完全附着在离心管底部，在10,000r/min下离心5分钟。取出后，加
入纯水，在涡旋摇床上摇晃，使引物均匀分布，得到的引物初始浓度为100μmol。用分析天平称重edc和nhs，然后用pbs制备终浓度为0.2mg/ml的edc溶液和终浓度为0.2mg/ml的nhs溶液。取出制备的3umol单链dna600μl，加入400μledc溶液和200μlnhs溶液，在恒温振荡下激活单链dna，在37℃孵育2h。单链dna激活完成后，取出加入1ml不同大小的胺化四氧化三铁超顺磁性纳米颗粒中，在37℃恒温摇床上孵育2小时，可适当提高振荡强度，确保反应均匀，使单链dna完全连接到磁性纳米颗粒表面。孵育完成后，进行磁分离去除未结合的引物，并在2mlhepes缓冲液中重悬。准备hepes缓冲液，使用分析天平称量mgcl2和氯化钠，使最终的缓冲系统含有25mmol的mgcl2和10mmol的氯化钠，然后使用ph代理使最终的ph为7.2，将购买的单链dna用离心机离心，确保引物完全附着在离心管底部，在10,000r/min下离心5分钟，取出后，加入纯水，在涡旋摇床上摇晃，使引物均匀分布，得到的引物初始浓度为100μmol，用分析天平称量edc和nhs，然后用pbs制备终浓度为0.2mg/ml的edc溶液和终浓度为0.2mg/ml的nhs溶液，取出制备的3μmol单链dna600μl，加入400μledc溶液和200μlnhs溶液，在恒温摇床上恒温激活单链dna，在37
°
c孵育2h，单链dna激活完成后，取出来，加入1ml胺化铁中3o4不同大小的超顺磁性纳米颗粒分散在水中，和孵化在37
°
c恒温摇床2小时，所以单链dna完全连接到磁性纳米颗粒的表面，孵育完成后，进行磁分离去除未结合的引物，并在2mlhepes缓冲液中重悬；步骤4、crispr/cas12a介导的lf-nmr响应系统的构建；不同浓度合成的病毒rna的逆转录和扩增，如在rt-rpa（反转录-重组酶聚合酶扩增）反应中产生dsdna，实现对新冠病毒rna的全程闭管、三十分钟无需热循环、可现场的超灵敏度快速检测。重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，rpa），被称为是可以替代pcr的核酸检测技术。rpa技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链dna结合蛋白（ssb）和链置换dna聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，zui适反应温度在37
°
c左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-dna复合物，能在双链dna中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动dna合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的dna链与ssb结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。
10.在crispr-cas12检测系统中，dsdna可以被引导rnas(grnas)直接靶向。为了实现高效、稳定的病毒核酸分析，所有实验均采用neb2.1缓冲液。将cas12a蛋白和crrna(不含rnase)在37℃下孵育30分钟(cas12a-crrna=1：1.25)，形成二元复合物。将病毒dsdna和二元配合物的1.5：1的比例在金属浴中加热到95℃1分钟，形成三元配合物。然后加入磁响应探针(70nmfe3o4-ssdna-300nmfe3o4)，在37℃下反应30分钟。反应结束后，在70℃下加热5分钟，以停止酶促反应。用磁铁分离300nm和70nm的磁性球探针，保留上清液，用lf-nmr检测仪测定溶液的t2持续时间，并绘制响应曲线和标准曲线。
11.基于超顺磁性纳米颗粒和crispr/cas12a技术，设计了一种磁响应开关，构建了低场核磁共振(lfnmr)传感平台，实现了对sars-cov-2的快速、超灵敏的检测。该方法具有快速、方便、成本低、操作方便、重复性高等优点。本研究构建的通用crispr-lfnmr传感平台只能通过替代识别靶点的crrna来实现多个靶点的检测效果，并可在临床检测、环境监测和食品安全等领域得到推广。
12.与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明是一种检测介质来实现核磁共振；信号放大的功能将成为未来开发一种更灵敏、更高效的无损检测系统的热点。基于四氧化三铁超顺磁性纳米颗粒的，crispr/cas12a基因编辑低场核磁共振传感器系统，具有体积小、成本低的特点。由于其灵敏度高、检测速度短、具有独特的方便性、无损性和可重复性，有效地解决了现有检测技术成本高、耗时长的问题。可应用于病毒突发事件的快速检测，为公共场所的安全保护提供技术支持。综上所述，这种简单、便携的低场核磁共振技术与相对较新的灵敏、特异性基因编辑组合技术相结合，使该传感器具有多功能，具有良好的快速检测前景。
附图说明
13.图1是crispr/cas12a介导的covid-19快速检测的低场核磁共振传感检测系统示意图。
14.图2是nh的tem图像
3-fe3o4@sio2磁性纳米颗粒(a)和nh
3-fe3o4磁性纳米粒子(b)；磁性纳米粒子的磁滞环(c)和(c)射线衍射表征结果为(d)。
15.图3是磁探针制备的(a)和紫外分光光度计(b)表征结果示意图。
16.图4 是lf-nmr(a)和实验条件优化的结果示意图。图5是低场核磁共振检测系统的检测范围和最低的检测极限图 (5a)；检测低场核磁共振传感器系统的特异性图（5b）；测试传感系统的三个选定浓度检测该传感检测系统的稳定性图（5c）。
具体实施方式
17.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细阐述。
18.crispr/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统，其在covid-19的快速检测的应用。病毒核酸提取试剂盒和逆转录的cdna通过rt-rpa反应，crispr/cas12a系统和特定的引导rna添加形成一个三联体与cdna元复合物，从而激活cas12a蛋白的反式裂解活性，通过制备不同粒径的磁性纳米颗粒，耦合单链dna形成桥，制备了磁响应探针，由于不同粒径的磁性纳米颗粒在磁场作用下的磁性吸附力不同，实现两种不同粒径的分离，激活的cas12a蛋白可切割磁性探针的桥链，触发磁性粒子的分散，根据不同的t2弛豫时间，利用低场核磁传感器探测器分析粒子的聚集和分散状态，通过改变t2弛豫时间检测病毒核酸。
19.所有dna和rna均从生工生物技术公司（上海）订购， engen
®
lbacas12a(cpf1)核酸酶和neb2.1(10x)购自新英格兰生物实验室（北京）有限公司。1,6-六甲基二胺(h2n (ch2)6nh2)、乙酸钠(naoac)、六水合氯化铁（fecl3
·
6h2o)；乙二醇(ch2（哦）ch2(oh))；化学试剂，如无水乙醇(c2h6o)；正硅酸乙酯(teos)购自中国天津帆船化学试剂技术有限公司，均为分析纯度，无需进一步纯化。采用中国天根的tianamp病毒rna试剂盒提取病毒核酸，twistamp
®
basicrt-rparna逆转录和扩增试剂盒购自英国twistdx。s-4500透射电子显微镜(tem)购自日本日立；d8先进x射线衍射(xrd)购自德国brukeraxs；fts6000傅里叶变换红外光谱仪(ft-ir)购自美国bio-rad；ppms-9物理性质测量系统购自美国量子设计公司；纳米+zeta电位分析仪购自美国微粒子仪器公司。micromr20-025vlf-nmr仪器购自中国上海newmai电子科技有限公司。
20.crispr/cas12a介导的低场核磁共振传感检测系统的制备方法，包括如下步骤：步骤1、氨基修饰的300nm超顺磁性纳米粒子的制备；使用分析天平称量7g1,6-六甲基二胺，2gnaoac和1gfec
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6h2o.将称量粉放入三颈瓶中混合，在三颈瓶中加入30毫升乙烯二胺后密封三颈瓶，瓶口涂抹密封油脂，将搅拌桨插入密封的三颈烧瓶中，放入50
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c水浴中加热并搅拌5小时，将搅拌后得到的棕红色混合溶液转移到聚四氟乙烯反应器中并密封，置于205
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c的高温烘箱中放置6小时。取出反应完成产生的黑色粉末，用50%乙醇溶液进行磁分离洗涤，反复4次，充分洗脱材料表面的有机溶剂，将洗过的混合物放入烤箱，在50
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c下干燥6小时，在确认粉末足够干燥后，收集粉末并储存在一个密封的容器中；步骤2、370nm氨基改性硅涂层超顺磁性纳米颗粒的制备；使用分析天平称出423毫克铁(ac)3，放入100毫升四颈瓶中，加入15毫升油胺，在磁力搅拌器上搅拌，慢慢将温度升高至140
°
c，并保持30min，在此期间，保持氩气的流动，直到溶液变黑，当溶液变黑时，搅拌温度迅速升高到330
°
c，继续搅拌1小时，然后停止搅拌，将溶液冷却至室温后，加入20ml乙醇溶解沉淀颗粒，通过磁性分离溶液，丢弃上清液来分离磁性粒子，用无水乙醇清洗磁性颗粒两次，后用正己烷清洗三次，将所得产品放入烤箱，调整温度至50
°
c，干燥24小时；将获得的四氧化三铁磁性纳米颗粒用二氧化硅修饰并与氨基结合，用分析天平称重制备的600mg四氧化三铁磁性纳米颗粒，并放入三颈瓶中。首先，在超声波清洗器中，超声波分散10分钟。在超声处理后的磁性颗粒中加入41.5ml纯水和37.5ml无水乙醇，继续超声处理10分钟。超声处理后，加入氨水20ml和teos4ml。在三颈烧瓶中加入一个磁铁，用一个磁力搅拌器以200rpm的速度进行2小时的搅拌反应。反应结束后，用乙醇洗涤磁性颗粒3次，置于70℃的烤箱中，干燥6小时。
21.步骤3、磁响应探针的制备；准备实验所需的hepes缓冲液，用分析天平称量氯化镁和氯化钠，使最终缓冲系统包含25mmol氯化镁和10mmol氯化钠，然后使用ph试剂使最终ph为7.2。将购买的单链dna在离心机中离心，确保引物完全附着在离心管底部，在10,000r/min下离心5分钟。取出后，加入纯水，在涡旋摇床上摇晃，使引物均匀分布，得到的引物初始浓度为100μmol。用分析天平称重edc和nhs，然后用pbs制备终浓度为0.2mg/ml的edc溶液和终浓度为0.2mg/ml的nhs溶液。取出制备的3umol单链dna600μl，加入400μledc溶液和200μlnhs溶液，在恒温振荡下激活单链dna，在37℃孵育2h。单链dna激活完成后，取出加入1ml不同大小的胺化四氧化三铁超顺磁性纳米颗粒中，在37℃恒温摇床上孵育2小时，可适当提高振荡强度，确保反应均匀，使单链dna完全连接到磁性纳米颗粒表面。孵育完成后，进行磁分离去除未结合的引物，并在2mlhepes缓冲液中重悬。准备hepes缓冲液，使用分析天平称量mgcl2和氯化钠，使最终的缓冲系统含有25mmol的mgcl2和10mmol的氯化钠，然后使用ph代理使最终的ph为7.2，将购买的单链dna用离心机离心，确保引物完全附着在离心管底部，在10,000r/min下离心5分钟，取出后，加入纯水，在涡旋摇床上摇晃，使引物均匀分布，得到的引物初始浓度为100μmol，用分析天平称量edc和nhs，然后用pbs制备终浓度为0.2mg/ml的edc溶液和终浓度为0.2mg/ml的nhs溶液，取出制备的3μmol单链dna600μl，加入400μledc溶液和200μlnhs溶液，在恒温摇床上恒温激活单链dna，在37
°
c孵育2h，单链dna激活完成后，取出来，加入1ml胺化
铁中3o4不同大小的超顺磁性纳米颗粒分散在水中，和孵化在37
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c恒温摇床2小时，所以单链dna完全连接到磁性纳米颗粒的表面，孵育完成后，进行磁分离去除未结合的引物，并在2mlhepes缓冲液中重悬；步骤4、crispr/cas12a介导的lf-nmr响应系统的构建；不同浓度合成的病毒rna的逆转录和扩增，如在rt-rpa（反转录-重组酶聚合酶扩增）反应中产生dsdna，实现对新冠病毒rna的全程闭管、三十分钟无需热循环、可现场的超灵敏度快速检测。重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，rpa），被称为是可以替代pcr的核酸检测技术。rpa技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链dna结合蛋白（ssb）和链置换dna聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，zui适反应温度在37
°
c左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-dna复合物，能在双链dna中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动dna合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的dna链与ssb结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。
22.在crispr-cas12检测系统中，dsdna可以被引导rnas(grnas)直接靶向。为了实现高效、稳定的病毒核酸分析，所有实验均采用neb2.1缓冲液。将cas12a蛋白和crrna(不含rnase)在37℃下孵育30分钟(cas12a-crrna=1：1.25)，形成二元复合物。将病毒dsdna和二元配合物的1.5：1的比例在金属浴中加热到95℃1分钟，形成三元配合物。然后加入磁响应探针(70nmfe3o4-ssdna-300nmfe3o4)，在37℃下反应30分钟。反应结束后，在70℃下加热5分钟，以停止酶促反应。用磁铁分离300nm和70nm的磁性球探针，保留上清液，用lf-nmr检测仪测定溶液的t2持续时间，并绘制响应曲线和标准曲线。
23.取样；鼻拭子：采样器用一只手轻轻支撑被收集起来的人的头部，另一只手手持拭子。将拭子插入鼻孔，并沿着下鼻通道的底部慢慢深入。由于鼻通道是弯曲的，不应该使用过度的力来避免创伤性出血。拭子尖端到达鼻咽腔后壁后，轻轻旋转一周（如出现反射性咳嗽，停留一会儿），慢慢取出拭子，将拭子头浸入2-3ml病毒保存液（也可使用等渗盐水、组织培养基或磷酸盐缓冲液），弃尾，拧紧帽。
24.咽拭子：尽可能在发病3天内收集患者的咽拭子标本。用拭子擦拭咽部后壁3~5次，避免接触舌头，将拭子头浸入3ml病毒保存液中，弃用尾部，拧紧管盖。
25.样品检测；所有试样应放置在合适尺寸的螺丝盖中，带有垫片和抗冻样品采集管，并拧紧。样品编号、类型、名称和取样日期显示在容器的外部。将密封的试样放入适当大小的塑料袋中密封。用75%乙醇喷洒消毒后，将外部标本转移箱置于实验室xg标本接收箱内，通过标本输送通道转移到pcr实验室入口外侧，置于消毒台上。打开xg标本接收箱，用75%乙醇喷雾消毒，将标本转移至pcr实验室的样品处理区。人员检测时采用三级防护（现采用三级防护）。
26.实时荧光rt-pcr作为本研究的检测方法，是目前医疗机构检测新型冠状病毒核酸的主要技术。由rna通过逆转录酶的作用合成cdna，然后在dna聚合酶的作用下以cdna作为模板，扩增和合成目标片段，具体方法请参考试剂盒说明书。
27.磁性纳米颗粒的特性；
fe3o4通过透射电子显微镜(tem)表征，在制备的表面形成了涂有二氧化硅的磁性纳米颗粒。如图2a所示，合成的铁的直径fe3o4磁性纳米颗粒约为50nm，壳层约为20nm。粒子形状均匀。胺化fe3o4采用一步法制备的磁性纳米颗粒如图2b所示，粒径约为300nm，分散性均匀。两种颗粒在纯水溶剂中分散，肉眼未见明显沉降现象。以迟滞环为特征，合成的胺化fe3o4磁性纳米颗粒具有超顺磁性，如图2c所示，我们发现了两种胺化铁的磁滞曲线，fe3o4磁性纳米粒子都穿过原点，表明这两个粒子都具有超顺磁性、副磁性。如图2d所示，采用x射线衍射(xrd)进一步表征了超顺磁粒子的晶体，并与标准卡进行了比较，证明了合成材料为fe3o4超顺磁晶体。
28.磁性探针的特性描述；如图3a所示，我们利用zeta电位进一步证明了fe表面氨基的成功修饰fe3o4磁性纳米颗粒。一般来说，未被氨基修饰的纳米颗粒表面是带负电荷的，但通过表征，发现fe3o4合成的超顺磁性纳米粒子具有带正电荷的电位。因此，进一步表明了合成的铁的表面fe3o4超顺磁性纳米粒子被氨基修饰。随后，对表面修饰了单链dna的磁性纳米探针进行了表征。电位从+值35.6变为-23.7。经过核酸修饰后的纳米探针具有明显的负电荷。因此成功制备了磁性纳米探针利用紫外分光光度计对其核酸修饰进行了表征。从图3b可以看出，通过edc/nhs反应，在核酸的两端，分别连接两个磁性粒子，构建一个磁性探针，通过磁分离去除未经修饰的核酸。在上清液中分离后，可以看到大量的核酸已被构建成磁性探针。当磁探针表面的氨基位点被占据时，剩余的核酸在上清液中游离，再次表明磁探针制备成功。
29.crispr/cas12a响应系统的验证与优化；为了验证crispr系统的成功与否，我们使用低场核磁共振技术分析了磁性探针在激活cas12a蛋白活性前后的t2磁域时间。如图4a所示，在低场核磁共振系统中，测试了两种磁性纳米颗粒混合物、加入crispr切割系统的磁性探针。结果表明，当两种超顺磁性纳米粒子在体系中混合和分散时，其具有较长的t2弛豫时间，证明其对周围水分子的作用力较小。当两个磁性纳米粒子由单链dna组装形成磁性探针时，t2弛豫时间缩短，对周围水分子的影响增加，表明两个粒子之间的距离缩短，造成了局部磁性的增强。随后加入激活的crispr/cas12a系统，t2弛豫时间明显增加，证实crispr/cas12a激活引发了ssdna的切割，从而破坏了磁性探针结构，减少了两个磁性纳米颗粒之间的距离。扩大以上结果验证了crispr/cas12a系统对磁性探针的解离，引发了t2弛豫时间的变化，验证了该传感系统的成功构建。
30.同时，值得注意的是，磁探针的浓度和crispr系统的切割时间对检测范围的影响较大，因此我们优化了磁探针的浓度和系统的孵育时间。从图4b中可以看出，随着磁性探针浓度的增加，crispr系统的裂解时间从10-40min开始增加，t2弛豫时间逐渐延长，已知探针完全裂解达到饱和。由于本研究的检测时间要求较快，且不综合考虑成本，最佳条件是孵育20分钟，磁性探针的浓度为16μm。
31.对传感系统的检测性能进行评价；取20μl不同浓度的病毒核酸溶液，加入50μl的磁性探针和30μl的crispr三元配合物，将其置于恒温振荡器中，25
°
c振荡20分钟，并在低场核磁共振传感器系统中进行测试。检测之前充分振荡样品，使其均匀分散。通过测量的t2弛豫时间，可以得到低场核磁共振检测系统的检测范围和最低的检测极限。结果如图5a所示。它对病毒的响应范围为1-100拷
贝/μl，具有良好的线性响应，最低限制为1拷贝/μl。并根据相同的反应体系配置，制备类似的病毒核酸溶液。然后将其放入恒温振荡器中，25
°
c振荡20分钟，并在低场核磁共振传感器系统中测试t2弛豫时间，检测之前充分振荡样品，使其均匀分散。同时与空白样品进行比较。
32.同时检测低场核磁共振传感器系统的特异性。如图5b所示，covid-19与类似病毒及其空白样本相比，t2弛豫时间信号响应极为显著，证明了该传感器系统在atp检测方面具有特异性。采用不同批次制备的9个响应系统来检测，该传感检测系统的稳定性。从图5c可以看出，测试了传感系统的三个选定浓度，试验结果表明具有显著的稳定性。
33.样品检测和回收实验；为了证明该方法的实际应用能力，我们对该方法的实际样品检测能力进行了评价。通过对咽拭子中病毒的刺突恢复实验，验证了该方法的实用性。如表1所示，标准添加量的实测回收率在92.6%~103%之间。同时，与标准方法的rt-pcr和elisa试剂盒结果进行了比较，证明了传感器系统对病毒的检测结果与rt-pcr和elisa试剂盒无显著差异，可用于实际应用。
34.表1低场核磁传感器系统用于回收病毒的样品及方法比较结果。
35.表1收集了10份人咽拭子或鼻拭子样本，并采用rt-pcr和该方法进行检测。从表2中可以看出，该方法对样本是否感染了病毒和rt-pcr的检测结果具有较高的准确性。
36.表2低场核磁传感器系统检测真人样本中的病毒及与rt-pcr方法的比较结果。
37.表2。
38.以上所述为本发明较佳实施例，对于本领域的普通技术人员而言，根据本发明的指导，在不偏离本发明的原理的情况下，对实施方式所进行的改变、修改、替换仍在本发明的保护范围之内。