一种表达微菌素Y的枯草芽孢杆菌工程菌株及其制备和应用

一种表达微菌素y的枯草芽孢杆菌工程菌株及其制备和应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术和生物技术领域，具体涉及mcyabcd基因序列的改造和采用枯草芽孢杆菌(食品级益生菌)作为表达系统，对mccy的抗菌活性研究。


背景技术：

2.微菌素y(mccy)是近期发现的一种来源于肠道菌的小分子抗菌肽，其生物合成需要四个基因参与，即mcyabcd，其中mcya编码mccy的线性氨基酸前体，mcyb、mcyc和mcyd编码翻译后修饰蛋白，转运蛋白以及分泌和自身免疫相关蛋白。类似于微菌素j25(mccj25)，mccy通过铁载体受体蛋白(fhua)进入细菌，对细菌进行内部瓦解，进而杀死细菌，其主要针对鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和婴儿沙门氏菌等血清型以及部分志贺氏菌和大肠杆菌。
3.mccy的发现极大地扩展了现有微菌素的抑菌谱，尤其弥补了微菌素j25在抑制鼠伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌等常见致病菌能力方面的缺陷。相似的是，它们都由肠杆菌分泌产生并且被发现，由于菌自身表达系统限制性的影响，极少有人使用革兰氏阳性菌作为表达系统，对此展开研究。目前，mccy的分泌表达是以大肠杆菌bl21菌株作为表达菌株，并且展现了良好的杀菌活性，但是由于大肠杆菌内毒素的影响，对于mccy的纯化具有很高的的要求，限制了其在养殖业生产实际中的应用。而作为革兰氏阳性菌的枯草芽孢杆菌属于食品级益生菌，其表达的mccy在生产应用上具有更经济快捷的使用方法，可以避免内毒素的影响，简化纯化工艺，并且实现直接饲添和活菌肠道定殖等。由于微菌素的杀菌机理不同于抗生素，mccy有望在全面禁抗的行业背景下，成为一种新型药物制剂，而益生菌对于mccy的成功表达，开启了更经济便捷的生产模式。


技术实现要素：

4.为了开发益生菌对微菌素y的表达系统，本发明以pht43作为载体，通过枯草芽孢杆菌对改造后的mcyabcd基因进行表达并成功表达mccy，其表达产物具有良好的鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的杀菌活性，为mccy在养殖业生产实践中的应用提供了更经济便捷的模式。
5.本发明的目的和采取的技术方案如下：
6.本发明的目的一在于提供用于在枯草芽孢杆菌中表达微菌素y的多核苷酸，所述多核苷酸为mcyabcd改造基因或包含所述mcyabcd改造基因；所述mcyabcd改造基因的核苷酸序列如seq id no：01所示。
7.本发明的目的二在于提供一种包含上述多核苷酸的重组质粒。
8.优选地，所述重组质粒为pht43-mcyabcd，是将mcyabcd改造基因插入到pht43质粒中构建所得。
9.本发明的目的三在于提供一种工程菌，所述工程菌包含上述的重组质粒。
10.优选地，所述工程菌为枯草芽孢杆菌工程菌株，是将重组质粒pht43-mcyabcd转入
枯草芽孢杆菌中制备所得。
11.本发明的目的四在于提供一种药物制剂，包含所述的工程菌或/和所述工程菌表达分泌的微菌素y。
12.本发明的目的五在于提供一种微菌素y的枯草芽孢杆菌表达系统，该表达系统将重组质粒pht43-mcyabcd转入枯草芽孢杆菌中，然后进行诱导表达。
13.本发明的目的六在于提供所述的枯草芽孢杆菌表达系统的构建方法，包括以下步骤：步骤一、设计携带对应同源臂的引物，分别扩增pht43线性化片段、mcya和mcybcd片段并引入sd和起始密码子序列，然后进行多片段连接和环化，构建pht43-mcyabcd重组质粒；步骤二、将步骤一构建的pht43-mcyabcd重组质粒转入到大肠杆菌中进行阳性验证；步骤三、将经步骤二验证的pht43-mcyabcd重组质粒转化到枯草芽孢杆菌中，利用iptg进行诱导表达制备微菌素y。
14.本发明的目的七在于提供所述的工程菌或7所述的枯草芽孢杆菌表达系统在制备微菌素y或包含微菌素y的抑菌制剂中的应用。
15.有益效果：本发明利用枯草芽孢杆菌，以pht43作为载体，对改造后的mcyabcd基因进行表达，其表达产物对鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌具有良好的杀伤性；该工程菌株标志着mccy可以突破芽孢杆菌表达系统的限制性，为其在益生菌上的应用提供广阔的前景。
附图说明
16.图1是pht43-mcyabcd重组质粒构建示意图；
17.图2是pht43-mcyabcd重组质粒转化大肠杆菌dh5α，部分阳性转化子的pcr验证产物凝胶电泳图；其中，扩增片段大小4965bp；
18.图3是枯草芽孢杆菌转化pht43-mcyabcd重组质粒的pcr产物凝胶电泳图；其中，a为bs168::pht43-mcyabcd阳性菌，b为wb800n::pht43-mcyabcd阳性菌，扩增片段大小为4965bp；
19.图4是枯草芽孢杆菌表达mccy，在0、4、6、8、12、16和24h的鼠伤寒沙门氏菌抑菌图；其中，c为bs168表达mccy，d为wb800n表达mccy，其中20～25梯度样本均按照0h所示的顺序；
20.图5是枯草芽孢杆菌wb800n表达mccy对鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的杀菌活性对比图，其中，e：鼠伤寒沙门氏菌；f：鸡白痢沙门氏菌；其中20～25样本梯度点样顺序参照图4；
21.图6是枯草芽孢杆菌表达mccy质谱分析图；其中e和g分别表示在bs168菌株和wb800n菌株检测到的mccy异源表达，x轴表示保留时间，y轴表示响应值；f和h分别表示bs168菌株和wb800n菌株表达mccy的esi-ms分析，检测到对应带电荷mccy的m/z值为743.2da[m+3h]
3+
，x轴表示m/z(da)值，y轴表示响应值。
具体实施方式
[0022]
一种表达微菌素y(mccy)的枯草芽孢杆菌工程菌株的开发，该工程菌株以pht43作为载体，对改造后的mcyabcd基因进行表达，其表达产物对鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏
菌具有良好的杀伤性；该工程菌株标志着mccy可以突破芽孢杆菌表达系统的限制性，为其在益生菌上的应用提供广阔的前景。
[0023]
所述改造后的mcyabcd基因将mcya和mcybcd的基因序列调整为相同方向，并且用sd和起始密码子序列(aaaggaggaaagatcaatg)相连，其核苷酸序列如seq id no：01所示。
[0024]
所述枯草芽孢杆菌为野生菌株bs168和工程菌株wb800n，表达质粒为pht43，mcyabcd基因共用质粒自身p43启动子，验证杀菌活性所用的指示菌为鼠伤寒沙门氏菌(atcc14028)和鸡白痢沙门氏菌(cvcc1800)。
[0025]
枯草芽孢杆菌mccy的表达及其抗菌活性评价，具体步骤如下：(1)设计携带对应同源臂的引物，分别扩增pht43线性化片段、mcya和mcybcd片段并引入sd和起始密码子序列，使用多片段无缝克隆试剂盒进行片段连接和环化，构建pht43-mcyabcd整合质粒；(2)将步骤(1)连接所得的整合质粒转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑选阳性转化子并扩大培养，提取质粒，将鉴定正确的质粒-20℃保存备用；(3)将pht43-mcyabcd重组质粒转化至bs168和wb800n菌株，鉴定阳性转化子，-80保菌备用；(4)将步骤(3)得到的携带pht43-mcyabcd重组质粒的bs168和wb800n阳性菌分别通过iptg诱导，对mccy进行表达，并通过抑制鼠伤寒沙门氏菌(atcc14028)和鸡白痢沙门氏菌(cvcc1800)的生长，测定其杀菌活性。
[0026]
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0027]
实施例1
[0028]
一、生物材料
[0029]
枯草芽孢杆菌bs168菌株和wb800n菌株(均购于北纳生物科技有限公司)、大肠杆菌dh5α(购于南京诺唯赞生物科技有限公司)、鼠伤寒沙门菌为(salmonella typhimurium atcc14028)、鸡白痢沙门菌为(salmonella pullorum cvcc1800)、pht43质粒(武汉淼灵生物科技有限公司)。
[0030]
质粒提取试剂盒(广州美基生物科技有限公司)；pcr扩增酶预混液试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)；无缝克隆试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)。
[0031]
引物的合成与基因测序(广州艾基生物技术有限公司)，全质粒二代高通量测序(北京擎科生物科技有限公司)。
[0032]
dl-苏氨酸、甘氨酸、色氨酸、tween 80、山梨醇、甘露醇、海藻糖等试剂材料(上海生工生物工程股份有限公司)。
[0033]2×
yt液体培养基：胰蛋白胨16g\l，酵母提取物10g\l，氯化钠5g\l，121℃灭菌20min。
[0034]
lb固体培养基：胰蛋白胨10g\l，酵母提取物5g\l，氯化钠5g\l，琼脂粉15g\l，121℃灭菌20min。
[0035]
lb软琼脂培养基：胰蛋白胨10g\l，酵母提取物5g\l，氯化钠5g\l，琼脂粉5g\l，121℃灭菌20min。
[0036]
电穿孔缓冲液：0.5m海藻糖；0.5m山梨醇；0.5m甘露醇；0.5mm mgcl2；0.5mm k2hpo4；0.5mm kh2po4。
[0037]
本实施例中所用的其它材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径购得。
[0038]
二、实验仪器
[0039]
pcr仪(德国耶拿分析仪器股份公司)、凝胶成像仪(广州誉维生物科技仪器有限公司)、凝胶电泳仪(北京荣阳科技发展有限公司)、超高压液相色谱仪/三重四极杆质谱连用仪(安捷伦科技有限公司)。
[0040]
三、具体试验步骤：
[0041]
1.构建pht43-mcyabcd重组质粒
[0042]
设计具有对应同源序列的引物，在多酶切位点对质粒pht43线性化，以pet-28a(+)-mccy重组质粒(来源于已授权专利cn 112876543 b)为模板，扩增mcya和mcybcd片段并引入sd和起始密码子序列，获得改造后的mcyabcd，其核苷酸序列如seq id no：01所示，其中，第1-162bp为mcya序列，第163-181bp为sd和起始密码子序列，第182-4115bp为mcybcd序列。涉及引物序列如下表1所示。
[0043]
表1：pht43-mcyabcd重组质粒构建引物序列表。
[0044]
使用多片段无缝克隆试剂盒，进行多片段连接和环化，示意图如图1所示。
[0045]
2.对pht43-mcyabcd重组质粒进行转化和提取
[0046]
将步骤1连接所得的整合质粒转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞，从中挑选部分阳性转化子，并设计pht43质粒多酶切位点两侧验证引物verify-f：gcgacatcgtataacgttactgg(seq id no：08)和verify-r：cgtaccattaaccttccaccc(seq id no：09)进行pcr验证，结果如图2所示。
[0047]
对于验证正确的菌落进行扩大培养，提取质粒，将测序鉴定正确的质粒-20℃保存备用。
[0048]
3.将pht43-mcyabcd重组质粒转化至枯草芽孢杆菌bs168和wb800n菌株(1)将枯草芽孢杆菌单菌落(bs168或wb800n)接种至2ml的2
×
yt培养基中(采用15ml生化管)，37℃，200rpm，培养过夜；(2)将1ml过夜培养的菌液稀释至100ml新鲜2
×
yt培养基中(250ml锥形瓶)，37℃，200rpm，培养至od600为0.8；(3)分别补充1％dl-苏氨酸(w/v)、2％甘氨酸(w/v)、0.1％色氨酸(w/v)和0.03％tween80(v/v)至培养基；(4)继续37℃，200rpm，培养2h；(5)置于冰上冷却15min；(6)4000
×
g，4℃离心10min；(7)用电穿孔缓冲液重悬-离心，10min，6000
×
g，重复3次，4℃；
(8)用少量电穿孔缓冲液重悬菌，制成枯草芽孢杆菌感受态细胞；(9)吸取100μl的感受态细胞，置于离心管(冰上操作)，加入1～2μl的pht43-mcyabcd重组质粒(100ng/μl)，混匀后转移至预冷的电转杯；(10)电击条件为1250v/mm，200ω，25μf；(11)立即加入1ml添加有0.5m山梨醇和0.38m甘露醇的2xyt肉汤；(12)在37℃，200rpm，摇菌3h；(13)涂具有氯霉素(10μg/ml)抗性的lb固体培养基板，进行筛选。
[0049]
对于阳性转化子采用verify-f和verify-r引物进行pcr验证，结果如图3所示。
[0050]
4.枯草芽孢杆菌表达mccy的杀菌功能验证
[0051]
试验1.枯草芽孢杆菌表达mccy，在不同时间点的杀菌活性验证(1)将带有pht43-mcyabcd重组质粒的bs168和wb800n阳性菌株单菌落接种于2
×
yt液体培养基中(cm为10μg/ml)，37℃、200r/min过夜培养；(2)将过夜培养物以1：50接种于100ml新鲜的2
×
yt培养基中(cm为10μg/ml)，37℃、200r/min摇菌至od
600
＝0.6～0.8；(3)加入1.5mmol/l的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导；(4)分别在诱导后0、4、6、8、12、16和24取5ml的菌液样本，10000
×
g离心5min收集上清，过0.22μm的滤网除菌，制成含有mccy的无菌上清液。(5)将鼠伤寒沙门氏菌atcc14028挑单菌落于2
×
yt液体培养基中，37℃、200r/min过夜培养；(6)将过夜培养的鼠伤寒沙门氏菌以1：200稀释于无菌双蒸水中，取100μl，使用棉棒均匀的涂在无抗lb固体培养板上，晾干；(7)将步骤(4)所得的无菌上清液进行20、21、22、23、24、25的梯度稀释，得到不同浓度等级的mccy上清液(8)将8μl步骤(7)所得不同梯度浓度的无菌上清液点在步骤(6)所述的培养板上，7～8h后看抑菌结果，如图4所示。
[0052]
我们发现枯草芽孢杆菌bs168和wb800n菌株均能分泌出对鼠伤寒沙门氏菌有杀菌活性的mccy，并且在iptg诱导后8～16h具有比较好的杀菌活性，且枯草芽孢杆菌bs168(稀释8～16倍具有杀菌活性)相比wb800n(稀释4～8倍具有杀菌活性)具有更好的表达性能。
[0053]
试验2.枯草芽孢杆菌表达mccy对鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的杀菌活性对比(1)将带有pht43-mcyabcd重组质粒的wb800n菌株进行诱导表达，表达过程同试验1，在iptg诱导12h后收集菌液样本，同时做未诱导的空白对照，10000
×
g离心5min收集上清，过0.22μm的滤网除菌，制成无菌mccy上清液；(2)将步骤(1)所得的上清液使用无菌双蒸水进行2倍梯度稀释，得到6个不同稀释样本(20、21、22、23、24、25)；(3)将8μl样本通过双层琼脂法(上层为混有1
‰
指示菌的lb软琼脂培养基，下层为lb固体培养基)测定杀菌活性，观察抑菌结果，如图5所示。
[0054]
我们发现枯草芽孢杆菌表达的mccy，相比鼠伤寒沙门氏菌(样本最大稀释比例为22)，鸡白痢沙门氏菌(样本最大稀释比例为23)具有更好的敏感性。
[0055]
试验3.枯草芽孢杆菌bs168菌株和wb800n菌株表达mccy的定量分析
[0056]
(1)将两菌株同时进行诱导表达，表达过程按照试验1进行，同样在诱导12后收集菌液上清，并制成无菌mccy上清液；
[0057]
(2)将步骤(1)所得上清液使用超高压液相色谱(三重四级杆质谱联用仪)进行质谱分析，结果如图6所示。
[0058]
我们计算得出枯草芽孢杆菌bs168菌株和wb800n菌株表达mccy，诱导12h后可以分别达到0.92mg/l(0.41μm，稀释8～16倍具有杀菌活性)和0.77mg/l(0.35μm，稀释4～8倍具有杀菌活性)左右，结合上述抑菌结果，枯草芽孢杆菌表达mccy对于鼠伤寒沙门氏菌的最小抑菌浓度介于0.026～0.088μm，对于鸡白痢沙门氏菌的最小抑菌农都为0.013～0.044μm。
[0059]
结论：枯草芽孢杆菌可以成功表达出具有杀菌活性的mccy；枯草芽孢杆菌bs168菌株表达mccy相比wb800n菌株具有更好的效果；枯草芽孢杆菌表达mccy对于鸡白痢沙门氏菌具有更好的敏感性。
[0060]
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。