一种提高pf1022a发酵产量的方法
技术领域
1.本发明涉及工业微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高pf1022a发酵产量的方法。
背景技术：
2.艾默德斯(emodepside)是一种以pf1022a为前体的半合成衍生物，对无脊柱动物(如线虫、蛔虫)等有杀伤作用，拜尔动物保健公司已研制出emodepside分别与吡喹酮(profender)及妥曲珠利(procox)的组合物用于猫和狗的驱肠虫药，profender(与吡喹酮联用)已于2007年在美国上市。拜耳公司与dndi合作开发emodepside，用于治疗盘尾丝虫病引起的“河盲症”(人用药)，2016年进入健康志愿者1期试验，2017年完成了单次递增剂量研究，2018年底完成了多次递增剂量研究。
3.pf1022a作为合成艾默德斯的前体原料，市场前景非常广阔，备受关注。目前，pf1022a合成有固相合成法和生物合成方法。固相合成法步骤繁琐及工艺复杂，不适合大规模生产。而关于pf1022a发酵生产报道比较少，pf1022a的产量又比较低。针对此现状，我公司选育出一株全新的pf1022a产生菌，具体公开在cn201711276671.0，该菌株具备生产能力高、遗产稳定性高等优势，但其公开的发酵方法仍然存在发酵产量不够高、发酵成本高等问题，不利于大规模工业化生产。
技术实现要素：
4.本发明提供了一种提高pf1022a发酵产量的方法，以可产pf1022a的座坚壳菌为生产菌株，在发酵培养基中进行有氧发酵，所述发酵培养基中包括可同化碳源，可同化氮源和无机盐，其中，所述可同化碳源中含有固体麦精。
5.在优选的实施方案中，所述固体麦精在发酵培养基中的含量为70-200g/l，进一步优选为100-200g/l，更优选为140-200g/l，最优选160g/l。
6.在优选的实施方案中，所述可同化的碳源进一步含有选自葡萄糖、麦芽糊精、麦芽糖、大豆油、可溶性淀粉、玉米淀粉之一或上述任何两种或多种物质的组合。
7.在优选的实施方案中，所述可同化的碳源进一步含有大豆油和麦芽糊精，优选为大豆油。
8.在优选的实施方案中，所述可同化的氮源选自酵母粉、棉籽饼粉、小麦胚芽粉、酵母提取粉、黄豆饼粉、花生饼粉之一或上述任何两种或多种物质的组合。
9.在优选的实施方案中，所述可同化的氮源为酵母粉和棉籽饼粉的组合。
10.在优选的实施方案中，所述无机盐选自硫酸锌、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锰、硫酸氢二铵、氯化钾、氯化钠、氯化镁、氯化镍、碳酸钙、氯化钙之一或任何两种或多种物质的组合。
11.在优选的实施方案中，所述无机盐为碳酸钙、氯化钠和硫酸镁的组合。
12.在优选的实施方案中，所述发酵培养基包含：75-210g/l可同化的碳源，15-40g/l
可同化的氮源，6-10g/l无机盐；优选的，所述发酵培养基包含：105-210g/l可同化的碳源，15-40g/l可同化的氮源，6-10g/l无机盐；进一步优选的，所述发酵培养基包含：145-200g/l可同化的碳源，15-40g/l可同化的氮源，6-10g/l无机盐。
13.在优选的实施方案中，所述发酵培养基包含：固体麦精，大豆油，棉籽饼粉，酵母粉，氯化钠，硫酸镁和碳酸钙。
14.在优选的实施方案中，所述发酵培养基中大豆油为5-10g/l；酵母粉为5-10g/l；棉籽饼粉为10-30g/l；氯化钠为2-3g/l；硫酸镁为2-3g/l；碳酸钙为2-4g/l。
15.在优选的实施方案中，所述发酵培养基含有固体麦精70-200g/l，优选为100-200g/l，更优选为140-200g/l，最优选160g/l；大豆油10g/l；棉籽饼粉25g/l；酵母粉10g/l；氯化钠2g/l；硫酸镁2g/l；碳酸钙2g/l。
16.在优选的实施方案中，所述发酵的培养温度为22-28℃，优选24-26℃，更优选25℃；所述发酵的培养时间6-10天，优选7-10天，最优选9天。
17.在优选的实施方案中，所述可产pf1022a的座坚壳菌为座坚壳菌(rosellinia sp.)hs-nf-1412z，保藏编号为cgmcc no.13893。
18.本发明中所述的g/l是指1l发酵培养基中所添加的相关物质的重量。
19.本发明人在研究过程中，经过多次试验，意外发现：当发酵培养基中含有固体麦精(尤其是一定范围内)作为碳源时，pf1022a发酵产量能够得到显著提高(发酵产量最高可达6000μg/ml以上)；当不含固体麦精作为碳源，碳源为别的物质(例玉米淀粉，蔗糖、麦芽糖等)时，均达不到这个效果。本发明所提供的技术方案简单易行，提高了pf1022a的生产效率，极大的提高了pf1022a的产量，降低了生产成本，便于pf1022a大规模工业化生产。
具体实施方式：
20.下面对本发明实施例中的技术方案进行描述，所描述的实施例仅仅为本发明的一部分。以下对比例及实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
21.本发明中，所述产pf1022a菌为hs-nf-1412z，本发明的实施例使用的菌种为座坚壳菌(rosellinia sp.)hs-nf-1412z，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.13893，公开于cn201711276671.0。本发明中，所述的各种材料和试剂都是本领域常用的材料和试剂，均可以通过常规的商业途径获得。
22.pf1022a高效液相检测方法：色谱柱采用依利特c18硅胶柱(5μm，4.6*250mm)。以乙腈：水(体积比为80:20)为流动相进行分离，流速1.0ml/min，紫外波长218nm，进样量20ul，柱温30℃，pf1022a的保留时间为10.5min左右，运行时间为pf1022a保留时间的1.9倍。
23.制备例1
24.(1)斜面培养基的制备：斜面采用土豆葡萄糖琼脂(pda)培养基：土豆200g，切成小块，加水1000ml煮沸30min，滤去土豆块，将滤液加水补足至1000ml，加葡萄糖20g，琼脂18g，自然ph，121℃灭菌20min，冷却至55℃左右时倒入平板，冷却凝固。将冻存的编号为hs-nf-1412z的菌株接种于斜面培养基，置于25℃
±
1℃培养6天。
25.(2)种子培养基的制备：每升含有以下组分：葡萄糖20g，可溶性玉米淀粉20g，酵母抽提物15g，棉籽饼粉20g，氯化钠2g，硫酸镁2g，碳酸钙2g，加水补足至1000ml，ph6.0，摇瓶
采用250ml三角摇瓶装量25ml，经121℃灭菌20min。
26.种子液培养方法：将生长的新鲜斜面座坚壳菌(rosellinia sp.)hs-nf-1412z菌种接入种子培养基中，摇床转速250r/min，25℃
±
1℃培养80h。
27.对比例1碳源中含有玉米淀粉(玉米淀粉在发酵培养基中的含量为120g/l)
28.将制备例1中制备得到的种子液接入到含以下成分的发酵培养基(以1l计)中：玉米淀粉120g加淀粉酶0.024g预先糊化，大豆油10g，棉籽饼粉25g，酵母粉10g，氯化钠2g，硫酸镁2g，碳酸钙2g，加水补足至1000ml，ph 6.0，摇瓶采用250ml三角摇瓶装量25ml，经121℃灭菌20min。温度25℃，250r/min摇床振荡培养9天得发酵液。
29.发酵液按如下方法检测pf1022a(对比例2-4和实施例1-9中的pf1022a检测方法与此相同):
30.①
发酵液中加入无水甲醇稀释5倍摇匀；
31.②
超声30min，将超声的发酵液过滤；
32.③
取上清液，以0.22um有机相针式滤膜过滤；
33.④
过滤后液体通过hplc检测，pf1022a的发酵单位为3290μg/ml。
34.对比例2碳源中含有麦芽糊精(麦芽糊精在发酵培养基中的含量为120g/l)
35.将制备例1中制备得到的种子液接入到含以下成分的发酵培养基(以1l计)中：麦芽糊精120g，大豆油10g，棉籽饼粉25g，酵母粉10g，氯化钠2g，硫酸镁2g，碳酸钙2g，加水补足至1000ml，ph 6.0；摇瓶采用250ml三角摇瓶装量25ml，经121℃灭菌20min。温度25℃，250r/min摇床振荡培养9天得发酵液。将发酵液用hplc检测，pf1022a产量为3112μg/ml。
36.对比例3碳源中含有麦芽糖(麦芽糖在发酵培养基中的含量为120g/l)
37.将制备例1中制备得到的种子液接入到含以下成分的发酵培养基(以1l计)中：麦芽糖120g，大豆油10g，棉籽饼粉25g，酵母粉10g，氯化钠2g，硫酸镁2g，碳酸钙2g，加水补足至1000ml，ph 6.0；摇瓶采用250ml三角摇瓶装量25ml，经121℃灭菌20min。温度25℃，250r/min摇床振荡培养9天得发酵液。将发酵液用hplc检测，pf1022a产量为3213μg/ml。
38.对比例4碳源中含有蔗糖(蔗糖在发酵培养基中的含量为120g/l)
39.将制备例1中制备得到的种子液接入到含以下成分的发酵培养基(以1l计)中：蔗糖120g，大豆油10g，棉籽饼粉25g，酵母粉10g，氯化钠2g，硫酸镁2g，碳酸钙2g，加水补足至1000ml，ph 6.0；摇瓶采用250ml三角摇瓶装量25ml，经121℃灭菌20min。温度25℃，250r/min摇床振荡培养9天得发酵液。将发酵液用hplc检测，pf1022a产量为623μg/ml。
40.实施例1碳源中含有固体麦精(固体麦精在发酵培养基中的含量为120g/l)
41.将制备例1中制备得到的种子液接入到含以下成分的发酵培养基(以1l计)中：固体麦精120g，大豆油10g，棉籽饼粉25g，酵母粉10g，氯化钠2g，硫酸镁2g，碳酸钙2g，加水补足至1000ml，ph 6.0；摇瓶采用250ml三角摇瓶装量25ml，经121℃灭菌20min。温度25℃，250r/min摇床振荡培养9天得发酵液。将发酵液用hpcl检测，pf1022a产量为5540μg/ml。
42.实施例2碳源中含有固体麦精(固体麦精在发酵培养基中的含量为70g/l)
43.将制备例1中制备得到的种子液接入到含以下成分的发酵培养基(以1l计)中：固体麦精70g，大豆油10g，棉籽饼粉25g，酵母粉10g，氯化钠2g，硫酸镁2g，碳酸钙2g，加水补足至1000ml，ph 6.0；摇瓶采用250ml三角摇瓶装量25ml，经121℃灭菌20min。温度25℃，250r/min摇床振荡培养9天得发酵液。将发酵液用hpcl检测，pf1022a产量为4112μg/ml。
44.实施例3碳源中含有固体麦精(固体麦精在发酵培养基中的含量为100g/l)
45.将制备例1中制备得到的种子液接入到含以下成分的发酵培养基(以1l计)中：固体麦精100g，大豆油10g，棉籽饼粉25g，酵母粉10g，氯化钠2g，硫酸镁2g，碳酸钙2g，加水补足至1000ml，ph 6.0；摇瓶采用250ml三角摇瓶装量25ml，经121℃灭菌20min。温度25℃，250r/min摇床振荡培养9天得发酵液。将发酵液用hpcl检测，pf1022a产量为4905μg/ml。
46.实施例4碳源中含有固体麦精(固体麦精在发酵培养基中的含量为140g/l)
47.将制备例1中制备得到的种子液接入到含以下成分的发酵培养基(以1l计)中：固体麦精140g，大豆油10g，棉籽饼粉25g，酵母粉10g，氯化钠2g，硫酸镁2g，碳酸钙2g，加水补足至1000ml，ph 6.0；摇瓶采用250ml三角摇瓶装量25ml，经121℃灭菌20min。温度25℃，250r/min摇床振荡培养9天得发酵液。将发酵液用hpcl检测，pf1022a产量为5870μg/ml。
48.实施例5碳源中含有固体麦精
49.将制备例1中制备得到的种子液接入到含以下成分的发酵培养基(以1l计)中：固体麦精140g，大豆油10g，黄豆饼粉25g，酵母提取粉10g，氯化钠2g，硫酸镁2g，碳酸钙2g，加水补足至1000ml，ph 6.0；摇瓶采用250ml三角摇瓶装量25ml，经121℃灭菌20min。温度25℃，250r/min摇床振荡培养9天得发酵液。将发酵液用hpcl检测，pf1022a产量为5562μg/ml。
50.实施例6碳源中含有固体麦精
51.将制备例1中制备得到的种子液接入到含以下成分的发酵培养基(以1l计)中：固体麦精140g，麦芽糊精40g，大豆油10g，棉籽饼粉25g，酵母粉10g，氯化钠2g，硫酸镁2g，碳酸钙2g，加水补足至1000ml，ph 6.0；摇瓶采用250ml三角摇瓶装量25ml，经121℃灭菌20min。温度25℃，250r/min摇床振荡培养9天得发酵液。将发酵液用hpcl检测，pf1022a产量为5412μg/ml。
52.实施例7碳源中含有固体麦精(固体麦精在发酵培养基中的含量为160g/l)
53.将制备例1中制备得到的种子液接入到含以下成分的发酵培养基(以1l计)中：固体麦精160g，大豆油10g，棉籽饼粉25g，酵母粉10g，氯化钠2g，硫酸镁2g，碳酸钙2g，加水补足至1000ml，ph 6.0；摇瓶采用250ml三角摇瓶装量25ml，经121℃灭菌20min。温度25℃，250r/min摇床振荡培养分别对不同的培养时间(6-10天)发酵液中pf1022a含量进行检测，hpcl测定所得的pf1022a的发酵单位结果如表1所示。发酵培养的时间在6天-10天时，pf1022a产量均较高，尤其是在第9天时，pf1022a产量最高为6148μg/ml。
54.表1.hplc测定不同培养时间下pf1022a的发酵单位
55.培养天数6天7天8天9天10天发酵单(μg/ml)41085312574761486017
56.实施例8碳源中含有固体麦精(固体麦精在发酵培养基中的含量为180g/l)
57.将制备例1中制备得到的种子液接入到含以下成分的发酵培养基(以1l计)中：固体麦精180g，大豆油10g，棉籽饼粉25g，酵母粉10g，氯化钠2g，硫酸镁2g，碳酸钙2g，加水补足至1000ml，ph 6.0；摇瓶采用250ml三角摇瓶装量25ml，经121℃灭菌20min。温度25℃，250r/min摇床振荡培养9天得发酵液。将发酵液用hpcl检测，pf1022a产量为5900μg/ml。
58.实施例9碳源中含有固体麦精(固体麦精在发酵培养基中的含量为200g/l)
59.将制备例1中制备得到的种子液接入到含以下成分的发酵培养基(以1l计)中：固体麦精200g，大豆油10g，棉籽饼粉25g，酵母粉10g，氯化钠2g，硫酸镁2g，碳酸钙2g，加水补
足至1000ml，ph 6.0；摇瓶采用250ml三角摇瓶装量25ml，经121℃灭菌20min。温度25℃，250r/min摇床振荡培养9天得发酵液。将发酵液用hpcl检测，pf1022a产量为5743μg/ml。