一种体外规模化培养扩增间充质干细胞的方法与流程

1.本发明属于间充质干细胞培养技术领域，具体涉及一种体外规模化培养扩增间充质干细胞的方法。


背景技术：

2.间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建，间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。由于它分化的组织类型十分广泛，因此临床应用价值不菲，间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，间充质干细胞在神经系统修复及更多方面具有长远的发展前景，间充质干细胞是一种早期未分化的细胞，它具有一切干细胞的特征，具有自我复制、自我分裂、自我更新、多向分化的功能。间充质干细胞主要存在于骨髓腔中，同时也存在于骨小梁等其他结缔组织中。间充质干细胞对造血干细胞的正常发育成熟发挥着重要的作用，间充质干细胞提供了正常造血干细胞生长发育所需要的环境和各种刺激因子。在临床上通过注射间充质干细胞，经常应用于血液系统疾病、结缔组织病以及心血管系统疾病和脑血管系统疾病的治疗，比如在骨髓移植的患者，同时注射间充质干细胞能够更快的促进造血功能的重建。另外间充质干细胞在治疗神经损伤、心肌梗死损伤等也有一定的作用，取得了较好的治疗效果。
3.目前常规体外培养扩增间充质干细胞的方法多是采用从脐带中分离培养得到，而制备的方法通常是组织块贴壁法以及酶消化法。使用酶消化法一般采用胶原蛋白酶和胰蛋白酶消化脐带沃顿胶组织后进行大量培养，在这个方法中胰蛋白酶是通过离解细胞间的粘蛋白、糖蛋白而影响细胞骨架从而使细胞分离，对细胞间质的蛋白成分及细胞膜蛋白均有较强的破坏作用，因此造成分离到的干细胞易由于受到损伤而造成活性不佳，难以扩增出理想数目和活性的间充质干细胞，同时常规体外培养扩增间充质干细胞的方法通常一次性培养细胞较少，难以达到规模化。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种体外规模化培养扩增间充质干细胞的方法，以解决上述背景技术中提出的目前常规体外培养扩增间充质干细胞的方法多是采用从脐带中分离培养得到，而制备的方法通常是组织块贴壁法以及酶消化法。使用酶消化法一般采用胶原蛋白酶和胰蛋白酶消化脐带沃顿胶组织后进行大量培养，在这个方法中胰蛋白酶是通过离解细胞间的粘蛋白、糖蛋白而影响细胞骨架从而使细胞分离，对细胞间质的蛋白成分及细胞膜蛋白均有较强的破坏作用，因此造成分离到的干细胞哟一由于受到损伤而造成活性不佳，难以扩增出理想数目和活性的间充质干细胞，同时常规体外培养扩增间充质干细胞的方法通常一次性培养细胞较少，难以达到规模化的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种体外规模化培养扩增间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
6.s1：准备脐带原料，并使用清洗液对脐带原料进行清洗；
7.s2：将脐带原料切碎成细碎组织，并放入培养瓶中；
8.s3：依次向每个培养瓶中添加培养基；
9.s4：将培养瓶放入培养箱中，并向培养箱通入co2；
10.s5：对培养瓶中溶液进行换液；
11.s6：将培养瓶中加入分层液进行溶液的分层；
12.s7：对分层后的溶液进行离心分离，得到充质干细胞；
13.s8：对充质干细胞进行液氮冻存，需要时再进行复苏。
14.本发明中，优选的，所述清洗液为生理盐水，所述培养瓶的数量为六个。
15.本发明中，优选的，所述培养基选择氨基酸、维生素、有机化合物、无机化合物、激素、生长因子以及微量矿物质。
16.本发明中，优选的，所述培养箱内控制温度为37℃，所述co2的浓度为5％。
17.本发明中，优选的，所述培养第五天后进行第一次换液，第一次换液为全量换液，全量换液后七天进行半量换液，往后三天进行一次全量换液，直到细胞融合度达到40％-50％。
18.本发明中，优选的，所述分层液为一种密度介于1.075-1.092g/ml之间而近于等渗的溶液，通过分层液进行密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
19.本发明中，优选的，所述使用液氮对冻存盒以及冻存管内的充质干细胞进行保存，复苏时，将细胞置于37℃的水浴中，保持1-2分钟完成复苏。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果是：所选培养基是经灭菌的液体培养基，培养基缓冲体系为重碳酸盐，在含5％co2的细胞培养箱中平衡后ph值为7.4。该培养基的配方能够选择性的促进间充质干细胞体外培养中的生长和分化，并为其达到最理想营养平衡状态提供数量上和质量上的保证，培养箱以及培养瓶均经过灭菌处理，整个培养过程能够达到无菌、无污染的状态。所得细胞活性佳、受损率较低，同时能够扩增出理想数目和活性的间充质干细胞。
附图说明
21.图1为本发明的步骤图；
22.图2为本实用培养基的结构组成图。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
24.请参阅图1-图2，本发明提供如下技术方案：一种体外规模化培养扩增间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
25.s1：准备脐带原料，并使用清洗液对脐带原料进行清洗；
26.s2：将脐带原料切碎成细碎组织，并放入培养瓶中；
27.s3：依次向每个培养瓶中添加培养基；
28.s4：将培养瓶放入培养箱中，并向培养箱通入co2；
29.s5：对培养瓶中溶液进行换液；
30.s6：将培养瓶中加入分层液进行溶液的分层；
31.s7：对分层后的溶液进行离心分离，得到充质干细胞；
32.s7：对充质干细胞进行液氮冻存，需要时再进行复苏。
33.本实施例中，优选的，原料选择有机质丰富的草炭土、腐植酸、黄腐酸、豆粕，原料的混合配比为3份草炭土、3份腐植酸、1份黄腐酸和2份豆粕。
34.本实施例中，优选的，清洗液为生理盐水，所述培养瓶的数量为六个。
35.本实施例中，优选的，所述培养基选择氨基酸、维生素、有机化合物、无机化合物、激素、生长因子以及微量矿物质。
36.本实施例中，优选的，所述培养箱内控制温度为37℃，所述co2的浓度为5％。
37.本实施例中，优选的，所述培养第五天后进行第一次换液，第一次换液为全量换液，全量换液后七天进行半量换液，往后三天进行一次全量换液，直到细胞融合度达到40％-50％。
38.本实施例中，优选的，所述分层液为一种密度介于1.075-1.092g/ml之间而近于等渗的溶液，通过分层液进行密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
39.本实施例中，优选的，所述使用液氮对冻存盒以及冻存管内的充质干细胞进行保存，复苏时，将细胞置于37℃的水浴中，保持1-2分钟完成复苏。
40.间充质干细胞的生长过程分为：潜伏期-指数增生期-停滞期。
41.干细胞相关的培养液都必须在5％co2的气体环境中培养使用。否则会对细胞产生影响。气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和干细胞相关的培养液都必须在5％co2的气体环境中培养使用。否则会对细胞产生影响。气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时
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般把细胞置于95％空气加5％二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的ph值。大多数细胞的适宜ph为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。一般情况下，细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。
42.不同形状底板的细胞培养箱有不同用途，培养细胞，通常是选用平底的，这样便于镜下观测、有明确的底面积、细胞培养液面高度相对一致。因此做mtt等实验时，无论是贴壁和悬浮细胞，-般选用平底板。测吸光值一定要使用平底的培养板。要特别注意材质。u型或v型板，-般在某些特殊要求时才使用。如在免疫学方面，当做两种不同淋巴细胞混合培养时，需要二者相互接触刺激，这时一般会选用∪型板，因为细胞会由于重力的作用而聚集在很小的范围内内。圆底培养板还会用于同位素掺入的实验，需要用细胞收集仪收集细胞的培养，如“混合淋巴细胞培养”等。v型板常用做细胞杀伤、免疫学血凝集实验。细胞杀伤这种实
验也可用u型板替代(加入细胞后，低速离心)。
43.实验例1：
44.扩增间充质干细胞在规模化培养方面的试验效果
45.试验目的：对比扩增间充质干细胞规模化培养的成果。
46.供试对象：扩增间充质干细胞普通培养模式；扩增间充质干细胞规模化培养模式。
47.试验设计
48.处理培养方式1扩增间充质干细胞普通培养模式2扩增间充质干细胞规模化培养模式
49.培养方法：
50.同时进行扩增间充质干细胞普通培养模式以及扩增间充质干细胞规模化培养模式，普通培养模式采用酶消化法，规模化培养模式采用换液分层分离法。
51.调查内容：
52.每个处理内选择3个培养瓶进行试验调查。
53.试验结果与分析：
54.对细胞分化指标的影响
55.处理时间(h)流失贴壁14805060％24721075％
56.从上表可看出使用规模化培养模式的扩增间充质干细胞在培养时间以及细胞流失量方面均降低于普通培养模式，并且使用规模化培养模式的扩增间充质干细胞在贴壁能力方面提高与普通培养模式。
57.处理产量150290
58.结论：
59.扩增间充质干细胞规模化培养模式产量远远高于规模化培养模式。
60.规模化培养模式的细胞促贴壁的时间为40.8
±
3.69小时，相比规模化培养模式贴壁培养的时间上减少了约8h左右；同时在细胞贴壁之后可以采用动作比较细致和轻微的全量换液操作进行，并且从培养基中只检测到极少量的流失细胞，细胞贴壁的能力有提升；降低了培养过程中的操作难度，更加便于后续收集。
61.将收获的规模化培养模式细胞进行表型检测，各组细胞的hla-i类分子、间充质干细胞表面常见分子cd105、cd73均表达为阳性；而hla-ii类分子及造血干细胞表面分子cd34、白细胞表面共同抗原cd45均表达为阴性。说明细胞的类型较为一致，表型上较为一致、亚型较少，可以认为细胞的分化和均一程度还是比较好的。
62.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。