一种高质量低分子量肝素钙的制备方法与流程

1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种高质量低分子量肝素钙的制备方法。


背景技术：

2.肝素是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，广泛分布在哺乳动物的组织中，如肝、肺、肠粘膜、心、脾、肾、胸腺、胎盘、肌肉和血液中都有存在。其作为天然抗凝血物质受到世界各国的重视，也是我国主要的出口药物之一。但普通肝素存在生物利用率低、副作用大等缺陷。
3.低分子量肝素不仅抗血栓作用优于普通肝素，而且生物利用度高，出血倾向小，体内半衰期长。低分子量肝素钙是肝素通过亚硝酸盐降解，还原，钙置换后的一种抗凝药物，属于低分子肝素的一种。与钠盐相比，钙盐注射体内后不会减少局部细胞间毛细血管的钙胶质，也不改变血管通透性，几乎不会引起局部出血等副作用，适用于预防和治疗血栓栓塞性疾病及血栓形成。
4.当前，评价低分子量肝素钙的质量标准主要包括：重均分子量及分子量分布，抗xa因子效价及抗xa/抗iia比值，亚硝酸盐含量及溶液澄清度与颜色。产品分子量及分布越稳定，抗xa因子效价及抗xa/抗iia比值越高，亚硝酸盐含量越低，溶液越澄清，颜色越浅，产品质量越好。以亚硝酸盐降解制备低分子量肝素为例，其分子量大小为从几百到近一万的不同分子量片段，由于亚硝酸盐降解过程反应剧烈及分级纯化过程效果不佳不能有效控制小分子肝素钙分子量及分子量分布范围，也造成抗xa因子效价损失，抗xa/抗iia比值较低，严重影响了产品质量。同时去除亚硝酸盐以及后续纯化脱色工序，也降低了该产品的工业化生产效率。
5.cn104072638a公开了一种那屈肝素钙的制备方法，此发明将超滤法和氯化钙搅拌融为一体。此种工艺改进虽然优化减少了工艺步骤，但对产品分子量及分布没有进行精准控制，产品稳定性较差。cn112830980a公开了一种制备那屈肝素钙和达肝素钠的方法，此发明采用微通道反应器裂解肝素钠，从而避免小分子肝素增多，降低后期分子量筛分负荷。但此种工艺制备效率低，不适合工业化生产。cn106749769a公开了一种低分子量肝素钙原料药的制备方法，此种工艺过程仍采用较为落后的氯化钙溶液醇沉转钙，且制备过程没有控制分子量及分子量分布，容易造成抗xa因子效价损失。cn104072637a公开了一种低分子量肝素钙的制备方法，利用亚硝酸钠法制备低分子量肝素钠溶液，然后用阳离子交换树脂进行树脂钙化，再上钙化后的阳离子树脂柱进行钙钠离子置换，最后将置换液过滤、冻干、粉碎。此方法转钙过程过于繁琐，制备周期较长，不适合工业化生产。因此，需要一种简单、高效、稳定的低分子量肝素钙生产工艺来有效的提高产品质量。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种肝素钙的制备方法，在提高生产效率的同时，制备出抗xa因子效价及抗xa/抗iia比值高，分子量及分布稳定，亚硝酸盐含量低，溶液颜色及澄清度好的高质量低分子量肝素钙产品。
7.本发明采用如下技术方案：
8.一种高质量低分子量肝素钙的制备方法，用冰醋酸溶液溶解肝素钠，使用硼氢化钠还原后用乙醇沉淀，加入氯化钙溶液溶解，再经低温溶媒分级沉淀，最后采用deae柱进行梯度洗脱，滤液经溶媒沉淀后，干燥。
9.进一步的，其包括如下步骤：
10.(1)解聚：将肝素钠原料用15～25倍浓度为3～5％的冰醋酸溶液溶解，调节并保持溶液温度为18～25℃，滴加0.4％～0.8％的亚硝酸钠溶液，滴加完成后进行降解反应，反应时间控制在180～230分钟，再用氢氧化钠溶液调节反应液ph 6.5～7.5，搅拌10～20min终止反应；
11.(2)还原：向步骤(1)反应后的溶液加入8％～10％的硼氢化钠，在45～55℃条件下还原1～3h，加入至少2倍溶液体积的乙醇沉淀，静置沉淀8h以上；
12.(3)分级沉淀：步骤(3)得到的沉淀物用相对于肝素钠原料重量5～10倍的1％～3％的氯化钙溶液中溶解，加乙醇进行第一次沉淀，静置沉淀8h以上；取出上清液，加乙醇进行第二次沉淀，静置沉淀8h以上，去除上清，获得第二次沉淀物；
13.(4)deae层析柱纯化：用5～6倍纯化水溶解第二次沉淀物，ph调节至7.0～7.5，按流速1.0～3.0l/min进行上样；用至少1.5倍柱床体积的缓冲液按流速1.0～3.0l/min冲洗deae柱；用至少1.0倍柱床体积的缓冲液按流速1.0～3.0l/min；
14.(5)洗脱deae柱：收集洗脱液，用0.2/0.22μm的微孔滤膜过滤；计算滤液体积，搅拌下加入至少4倍体积95％乙醇，继续搅拌10～20min，停止搅拌，静置沉淀8h以上，去除上清，得沉淀物；
15.(6)真空干燥：将步骤(5)获得的沉淀物加入无水乙醇脱水2～3次，放入真空干燥箱中进行两次真空干燥，粉碎后得产品。
16.其中，步骤(1)中，每千克肝素钠原料加入8～10l亚硝酸钠溶液。
17.其中，步骤(3)中，所述乙醇为15℃以下的95％乙醇。
18.其中，步骤(3)中，进行第一次沉淀时，加入乙醇后，料液中的乙醇浓度为20～25％。
19.其中，步骤(3)中，进行第二次沉淀时，加入乙醇后，料液中的乙醇浓度为40～45％。
20.其中，步骤(4)中，所述deae层析柱为deae sephadex a-25、deae sephadex a-50、deae cellufine a-200、deae cellufine a-500或deae cellufine a-800交换柱中一种，洗脱过程采用线性梯度洗脱。
21.其中，步骤(4)中，deae柱冲洗所用缓冲液为浓度为0.01～0.05mol/l cacl2溶液和0.01～0.04mol/l tris-hcl溶液。
22.其中，步骤(5)中，deae柱洗脱所用缓冲液为浓度为0.1～0.5mol/l cacl2溶液和0.01～0.04mol/l tris-hcl溶液。
23.本发明的有益效果在于：
24.本发明的低分子量肝素钙的生产工艺，制备出的，亚硝酸盐含量，溶液颜色浅于黄色1号标准比色液，
25.(1)降解过程中采用了具有缓冲作用的冰醋酸，避免了肝素钠与亚硝酸盐反应时
的ph变化剧烈而引起的分子量剧烈变化，同时特定浓度低温溶媒分级沉淀，减少了抗xa因子效价损失，增加产品结构的稳定性。
26.(2)改变了落后的离子交换转钙的方法，采用较为先进的deae柱层析转钙。
27.(3)deae柱层析转钙的同时精准调控了分子量及分子量分布，同时也达到了产品纯化除杂的目的，后续无需再进行氧化等步骤，极大简化了生产步骤，缩短了制备周期，提高了生产效率。
28.(4)本生产工艺制得的成品分子量及分布稳定，低分子量肝素钙重均分子量为4000～5000，分子量小于8000的组分不小于75％，小于2000的组分低于15％。亚硝酸盐含量低(小于5ppm)，溶液澄清，颜色浅，浅于黄色1号标准比色液。得到的低分子量肝素钙抗xa因子活性为95～130iu/mg，抗xa/抗iia比值为2.5～4.0，均高于国家标准，质量得到明显提升。
具体实施方式
29.以下结合实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。
30.实施例1
31.解聚：称取2kg肝素钠用40l浓度为5％冰醋酸溶液溶解，调节并保持溶液温度为18～20℃，缓慢滴加入16l浓度为0.50％的亚硝酸钠溶液，进行降解反应，反应时间为180min。反应结束后调节反应液ph值至7.0，继续搅拌20min。
32.还原：向溶液中加入160g硼氢化钠粉末，控制料液温度在50℃，保温反应3h；降温至55℃以下，缓慢加入冰醋酸调节ph值至6.0。搅拌下加入112l 95％乙醇，继续搅拌20min，停止搅拌，静置沉淀8h，去除上清，得沉淀物。
33.分级沉淀：将上述沉淀物加入16l浓度为2％的氯化钙溶液中搅拌溶解，控制料液温度为55℃以下，调节ph值至7.0，缓慢加入已预冷至15℃以下的95％乙醇，使料液中乙醇浓度为25％(用william’s试管精准测定乙醇浓度)，继续搅拌10min，停止搅拌，静置沉淀8h，取出上清液。向上述上清液缓慢加入已预冷至15℃以下的95％乙醇，使料液中乙醇浓度为40％(用william’s试管精准测定乙醇浓度)，继续搅拌10min，停止搅拌，静置沉淀8h，去除上清，得沉淀物。
34.deae层析柱纯化：用10l纯化水溶解上述沉淀物，ph值调节至6.5，上deae cellufine a-800层析柱，用0.03mol/l cacl2溶液和0.04mol/l tris-hcl溶液冲洗deae柱，用洗脱液浓度为0.3mol/lcacl2溶液和0.04mol/l tris-hcl溶液进行洗脱，流出液用层析系统的280nm紫外检测器监测。收集洗脱液，用0.22μm的微孔滤膜过滤，搅拌下加入40l 95％乙醇，继续搅拌10min，停止搅拌，静置沉淀8h，去除上清，得沉淀物。
35.真空干燥：将上述沉淀物加入无水乙醇脱水2次，放入真空干燥箱中进行两次真空干燥，粉碎后得产品。
36.实施例2
37.解聚：称取10kg肝素钠用200l浓度为5％冰醋酸溶液溶解，调节并保持溶液温度为18～20℃，缓慢滴加入90l浓度为0.50％的亚硝酸钠溶液，进行降解反应，反应时间为230min。反应结束后调节反应液ph值至7.0，继续搅拌20min。
38.还原：向溶液中加入850g硼氢化钠粉末，控制料液温度在50℃，保温反应3h；降温
至50℃以下，缓慢加入冰醋酸调节ph值至6.0。搅拌下加入560l 95％乙醇，继续搅拌20min，停止搅拌，静置沉淀8h，去除上清，得沉淀物。
39.分级沉淀：将上述沉淀物加入80l浓度为2％的氯化钙溶液中搅拌溶解，控制料液温度为55℃以下，调节ph值至7.0，缓慢加入已预冷至15℃以下的95％乙醇，使料液中乙醇浓度为25％(用william’s试管精准测定乙醇浓度)，继续搅拌10min，停止搅拌，静置沉淀8h，取出上清液。向上述上清液缓慢加入已预冷至15℃以下的95％乙醇，使料液中乙醇浓度为40％(用william’s试管精准测定乙醇浓度)，继续搅拌10min，停止搅拌，静置沉淀8h，去除上清，得沉淀物。
40.deae层析柱纯化：用50l纯化水溶解上述沉淀物，ph值调节至6.5，上deae cellufine a-800层析柱，用0.04mol/lcacl2溶液和0.05mol/l tris-hcl溶液冲洗deae柱，用洗脱液浓度为0.4mol/lcacl2溶液和0.05mol/l tris-hcl溶液进行洗脱，流出液用层析系统的280nm紫外检测器监测。收集洗脱液，用0.22μm的微孔滤膜过滤，搅拌下加入200l95％乙醇，继续搅拌10min，停止搅拌，静置沉淀8h，去除上清，得沉淀物。
41.真空干燥：将上述沉淀物加入无水乙醇脱水2次，放入真空干燥箱中进行两次真空干燥，粉碎后得产品。
42.实验例
43.将实施例1和实施例2制备的产品质量标准如下。
[0044][0045]
本领域技术人员应该理解，以上实施例仅为本发明的优选实施方案，详尽的说明只是为了帮助读者更好地理解本发明精神，而并非对本发明保护范围的限制，相反，任何基于本发明的发明精神所作的任何改进或修饰都应当落在本发明的保护范围之内。