一种诊断烟雾病的分子标志物及其引物对、试剂盒与应用

1.本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种诊断烟雾病的分子标志物及其引物对、试剂盒与应用。


背景技术：

2.烟雾病是一种病因不明的、以双侧颈内动脉末端及大脑前动脉、大脑中动脉起始部慢性进行性狭窄或闭塞为特征，并继发颅底异常血管网形成的一种脑血管疾病，由于这种颅底异常血管网在脑血管造影图像上形似“烟雾”，故称为“烟雾病”。烟雾病发病隐匿，早期症状以短暂性脑缺血发作为主，后期以脑梗死或脑出血为主，致残率及致死率较高，目前对该病尚无早期的筛查手段，因此，明确病因，早期诊断尤为重要。
3.脑血管造影被认为是目前诊断烟雾病的金标准，但其成本高昂且具有创伤性，难以满足临床早期筛查需要。因此，开发一种特异性强、灵敏度高的诊断烟雾病的分子标志物对于烟雾病的治疗和早期发现具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强的诊断烟雾病的分子标志物及其引物对、试剂盒与应用。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种诊断烟雾病的分子标志物，所述分子标志物为外周血外泌体内mir-151a-3p，所述的mir-151a-3p的核苷酸序列如seq id no:1所示。
7.本发明还提供了上述分子标志物的引物对，所述分子标志物的引物对为扩增mir-151a-3p的上游引物如seq id no:2所示和扩增mir-151a-3p的下游引物如seq id no:3所示。
8.本发明还提供了上述分子标志物或上述的引物对在制备诊断烟雾病产品中的应用。
9.优选地，所述产品包括试剂盒、试剂、芯片或试纸条。
10.优选地，当外周血外泌体内mir-151a-3p相对表达含量小于1.81时，表明未患烟雾病，当外周血外泌体内mir-151a-3p表达含量大于或等于1.81时，表明患有烟雾病。
11.本发明还提供了一种用于诊断烟雾病的试剂盒，包括上述引物对。
12.优选地，所述试剂盒还包括外周血外泌体提取试剂、反转录试剂、定量pcr试剂。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
14.本发明提供了一种诊断烟雾病的分子标志物，所述分子标志物为外周血外泌体内mir-151a-3p，本发明选择外泌体内mir-151a-3p作为烟雾病新型血液分子标志物具有如下优点：1)烟雾病患者外周血中外泌体的数量显著高于健康人，且外泌体不含有血液中的高丰度蛋白，对检测干扰小，具有更高的敏感性。2)外泌体以脂质双分子层结构包裹mirnas，使外泌体转运的mirnas免于rna酶的降解，提高外泌体在血液中的稳定性。3)血液标本易获
取，易于检测和标准化试剂盒生产。4)本发明外周血外泌体内mir-151a-3p在诊断烟雾病时特异性强、灵敏度高。
附图说明
15.图1中a:电镜观察外泌体形态；b:外泌体粒径大小；c:western blot检测外泌体特征性抗原cd9和tsg101的表达和阴性抗原calnexin的表达；d:烟雾病(mmd)组和健康对照(health)组外周血外泌体浓度分析；
16.图2为烟雾病患者组与健康对照组外周血外泌体内和外周血血浆内mir-151a-3p pcr鉴定结果图；
17.图3为mir-151a-3p的分子roc曲线图。
具体实施方式
18.本发明提供了一种诊断烟雾病的分子标志物，所述分子标志物为外周血外泌体内mir-151a-3p，所述的mir-151a-3p的核苷酸序列为ctagactgaagctccttgagg(如seq id no:1所示)。
19.在本发明中，所述外周血外泌体提取方式优选地包括超速离心法、试剂盒提取法。
20.本发明还提供了一种上述分子标记物的引物对，所述引物对为扩增mir-151a-3p的上游引物为5
’‑
gggcaacctagactgaagctc-3’(如seq id no:2所示)和扩增mir-151a-3p的下游引物5
’‑
gtgcgtgtcgtggagtcg-3’(如seq id no:3所示)。
21.本发明还提供了上述分子标志物或上述的引物对在制备诊断烟雾病产品中的应用。
22.在本发明中，所述产品优选为包括试剂盒、试剂、芯片或试纸条。
23.在本发明中，判断是否患有烟雾病以样本中外周血外泌体内mir-151a-3p相对表达含量作为判断标准，以mir-425-5p为内参，当外周血外泌体内mir-151a-3p相对表达含量小于1.81时，表明未患烟雾病，当外周血外泌体内mir-151a-3p相对表达含量大于或等于1.81时表明患有烟雾病。在本发明中，所述试剂盒还优选地包括外周血外泌体提取试剂、反转录试剂、定量pcr试剂。
24.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.以下实施例中涉及的烟雾病患者及健康患者的相关实验研究均征得济宁医学院附属医院伦理委员会批准，并经患者及家属同意，签署知情同意书。
26.以下实施例中的烟雾病入选标准：
①
所有患者均经脑血管造影检查确诊为烟雾病；
②
年龄小于60周岁；
③
无脑动脉硬化等合并疾病，排除严重心肺等其他系统疾病。
27.实施例1
28.建立临床血液标本及外周血外泌体实验数据库
29.选取烟雾病患者共20例入组研究，同时收集挑选与烟雾病患者年龄、入院时间、体重等身体状况相似的健康对照组10例，收集烟雾病患者血液标本，并记录详细病历资料信
息，包括年龄、性别、发病部位、狭窄程度以及随访资料。
30.收集外周血标本：使用肝素钠抗凝管或edta抗凝管采集全血，并尽快进行外周血分离：3000rpm室温离心10min(血样采集后室温放置需在1h之内进行离心；血样采集后冰上放置需在2h内进行离心)，取上层，0.2ml/管分装至1.5ml离心管中，-80℃冻存。
31.提取外周血外泌体：采用外泌体抽提试剂盒(上海宇玫博生物科技有限公司，货号ur52136)的方法提取：
32.(1)样本预处理
33.①
离心去细胞碎片：于4℃以3000g离心10min去除细胞碎片等杂质，将去除细胞碎片的离心上清液转移到新的离心管中；
34.②
离心去杂质：转移后的上清液于4℃以10000g离心10min，去除样本中杂质，将离心后的上清液转移至新的离心管中。
35.(2)提取外泌体
36.①
上清液预处理：在去除杂质的离心上清液中先加入预冷的1
×
pbs进行稀释，再加入blood pureexo solution(bps)；具体加入剂量如表1所示(注：其他剂量规格请根据表中的试剂用量等比例换算)。
37.表1外周血预处理时所用试剂及其含量
38.样品名称样品剂量pbs剂量bps剂量外周血1.0ml3.0ml1.0ml
39.②
溶液混合：加入bps试剂后将离心管盖紧，通过涡旋震荡器混匀1min,再放置于4℃静置2h；
40.③
沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管4℃以10000g离心60min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；
41.④
外泌体重悬：取1
×
pbs均匀吹打离心沉淀物，其中1
×
pbs与离心沉淀物的体积比为1:2，待其溶解后，将重悬液转移至新的1.5ml离心管中；
42.⑤
收获外泌体颗粒：将含有重悬液的1.5ml离心管于4℃12000g离心2min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒。
43.(3)纯化外泌体
44.①
纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入exosome purification filter(epf柱)上室中，于4℃以3000g离心10min，离心后收集epf柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒；
45.②
外泌体的保存：纯化后的外泌体以50～100μl进行分装保存于-80℃,以备后续实验使用。
46.外泌体的鉴定及其含量的测定
47.1、透射电镜技术观察外泌体一般形态及其表面标记：取悬置均匀的外泌体溶液，3％磷钨酸溶液负染后电镜下观察外泌体形态；
48.2、采用nanosight可视型纳米颗粒分析仪检测外泌体浓度和大小；
49.3、western-blot检测cd9、tsg101标记蛋白分子在外周血外泌体的表达；
50.由图1的结果表明，电镜观察外周血外泌体的形态呈“茶托状”(图1中的a)；粒径大小集中在40～150nm之间(图1中的b)；western blot检测分离的外周血外泌体表达特征性
gggcaacctagactgaagctc-3’和seq id no:3所示5
’‑
gtgcgtgtcgtggagtcg-3’；
62.5)以对照组健康cdna，作为阴性对照组与检测样本cdna共同定量pcr检测，每个反应体系使用与检测样本cdna相同。
63.外周血外泌体内mir-151a-3p诊断效能评价：在本实施例中，从济宁医学院附属医院选取患烟雾病的患者20例，同时收集挑选与烟雾病患者年龄、入院时间、体重等身体状况相似的健康对照组10例，用于检测烟雾病患者mir-151a-3p表达水平的方法，包括如下步骤：
64.1)烟雾病患者及对照组健康人外周血血浆及外泌体总rna提取：根据trizol法进行总rna提取，提取外周血血浆及外泌体rna；
65.2)cdna合成：使用mirna第一链cdna合成试剂盒合成cdna，mir-151a-3p反转录引物序列如seq id no：4所示，具体如下：gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgaccctcaag；内参选mir-425-5p，mir-425-5p反转录引物序列如seq id no：5所示，具体如下：gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgactcaacg；在无rna酶离心管中依次加入下述反转录试剂，反转录体系为：dntp(2.5mm each)2.0μl，10
×
rt buffer 2.0μl，total rna250ng，1μm rt特异引物0.3μl，m-mulv reverse transcriptase(200u/μl)0.2μl，rnase inhibitor(40u/μl)0.3μl,rnase-free water up to 20μl，反应混合物16℃温浴30min，42℃温浴40min，85℃加热5min使酶失活，4℃保存；
66.3)mirnas rt-qpcr扩增：mirnart-qpcr扩增体系为ddh2o 2μl，mastermix 5.0μl，模板dna 2.0μl，10μm上游引物0.5μl，10μm下游引物0.5μl；扩增分子标记引物对的序列如seq id no:2所示5'-gggcaacctagactgaagctc-3’和seq id no:3所示5
’‑
gtgcgtgtcgtggagtcg-3’；内参选mir-425-5p，扩增mir-425-5p的引物对的序列如seq id no：6和seq id no：7所示，具体如下：5'-ggggaatgacacgatcactc-3’(seq id no：6)，5
’‑
gtgcgtgtcgtggagtcg-3’(seq id no：7)；mirnas rt-qpcr扩增程序：95℃，10min；40个pcr循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。
67.4)鉴定：扩增完成后，利用2-δδct
方法分析基因表达量。
68.由图2结果表明，在外泌体转运的情况下，其中20例烟雾病患者mir-151a-3p均表达上调，并且20例其中烟雾病患者外周血外泌体内mir-151a-3p相对表达含量均大于或等于1.81，10例健康人中的外周血外泌体内mir-151a-3p相对表达含量均小于1.81，表明试剂盒检测的准确性。也进一步说明若外周血外泌体内mir-151a-3p分子标记物相对表达含量均大于或等于1.81，则患有烟雾病，若外周血外泌体内mir-151a-3p相对表达含量均小于1.81，则未患烟雾病。
69.由图2结果显示，在非外泌体转运的情况下，烟雾病患者组和健康对照组外周全血浆中mir-151a-3p表达无差异，这提示mir-151a-3p只有外泌体特异富集转运的情况下才能体现其诊断效能。
70.实施例3
71.外周血外泌体内mir-151a-3p诊断烟雾病的特异性和灵敏度
72.选择经脑血管造影确诊的烟雾病患者和健康对照组，采用实施例2所述的定量rt-pcr方法检测烟雾病患者(20例)与健康对照组(10例)外周血外泌体内“mir-151a-3p”含量。使用spss软件绘制受试者工作曲线(roc曲线)及曲线下面积(auc)值，以接近左上角的点为
最佳诊断临界值。
73.由图3可知，mir-151a-3p的auc值为1，表明mir-151a-3p的特异性、敏感性最高，检测标本结果显示诊断效能接近100％。
74.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。