超声法核酸探针制备方法与流程

1.本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种超声法核酸探针制备方法。


背景技术：

2.单链dna与rna是由一定数量的脱氧核苷酸或者核苷酸组合而成。而对dna或者rna的结构进行一些改造，就形成了dna修饰探针以及rna修饰探针。dna修饰探针与rna修饰探针广泛应用在分子诊断qpcr（实时荧光定量）、str（短串联重复序列）、以及fish（荧光原位杂交技术）等领域。
3.一般地，有两种常见的方法可用于单链dna与rna的改造。一种为固相亚磷酰胺三酯法，另一种为液相氨基活化酯加成法。传统的液相氨基活化酯加成法是把含有氨基活性基团的dna或rna溶解在碱性的缓冲液中，然后加入3倍摩尔量的有机溶剂溶解的活化酯修饰染料，在常温反应4-12小时，然后加入酒精进行沉淀，同时用酒精对沉淀物进行反复洗涤，拿到沉淀固体，然后用水溶解，最后经高效液相色谱仪纯化得到纯的dna修饰探针或rna 修饰探针。
4.液相氨基活化酯加成法，需要在dna或者rna上合成氨基结构（nh2），同时需要活化酯修饰染料为琥珀酰亚胺活化酯结构，见下反应式（1），这种活化酯结构，相比较亚磷酰胺结构，容易合成。
5.液相氨基活化酯加成法的具体操作的方案如下：（1）将100nmol含有氨基结构的dna/rna溶解于100ul ph为8.5的0.5mna2co3/nahco
3 缓冲液中，充分震荡混匀。
6.（2）用37.5uldmf溶剂去溶解300nmol琥珀酰亚胺活化酯修饰染料固体，并加入至上述缓冲液中，室温震荡混匀。
7.（3）将上述溶液放入摇床，震荡4-12小时。
8.（4）在上述溶液中加入2ml酒精，-20℃冷冻30分钟出现絮状沉淀，12000转高速离心，去除上清液，取沉淀。
9.（5）用2ml
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20℃冷冻酒精清洗沉淀3遍，并将沉淀烘干，得dna/rna修饰探针粗品。
10.（6）用1ml超纯水将干燥后的dna/rna修饰探针粗品溶解，装载至高效液相色谱仪
上纯化，拿到纯的产品。
11.液相氨基活化酯加成法具有以下不足：（1）因为dna/rna都易溶于水，而琥珀酰亚胺活化酯修饰染料固体绝大多数都是不溶于水的，所以琥珀酰亚胺活化酯修饰染料固体都需要有机溶剂进行溶解。且为了反应体系偏向于均相反应，需要使用与水互溶性较高的有机溶剂，而这些有机溶剂都具有较高的毒性。
12.（2）因反应过程使用了有机溶剂以及缓冲盐，这些都必须在后续生产中提前去除，故在反应后处理中，会大量使用乙醇进行沉淀洗涤后处理。产生较多的有机溶剂浪费。
13.（3）琥珀酰亚胺活化酯修饰染料与dna/rna底物的摩尔比例约为3:1，但是因为反应为含水的反应，虽然琥珀酰亚胺活化酯修饰染料能优先与带有氨基结构的dna/rna反应，琥珀酰亚胺活化酯修饰染料也能与水较快发生副反应，液相氨基活化酯加成法的最终摩尔收率仍然不高，大多数都在20-30%之间，即以修饰染料利用率来看，仅为7-10%。材料成本仍然太高。
14.（4）因dna/rna的内部结构复杂包裹，当dna含有50个以上脱氧核苷酸、rna含有40个以上核苷酸时，其带有的氨基结构难以与琥珀酰亚胺活化酯修饰染料接触反应，传统的液相氨基活化酯加成法收率极低。
15.固相亚磷酰胺三酯法的合成过程主要有脱保护、偶联、盖帽、氧化4个步骤。每完成4个步骤就连接上一个脱氧核苷酸或核苷酸，通过重复这4个步骤，就把一个个的脱氧核苷酸或核苷酸连接起来就形成了dna或rna。
16.利用固相亚磷酰胺三酯法也可以在合成dna/rna过程中，把修饰染料合成到dna或rna的链上。
17.固相亚磷酰胺三酯法（1）固相亚磷酰胺三酯法为固液两相反应，所需要的修饰染料与dna/rna底物的比例为20:1以上，其摩尔收率约为30-40%，即以修饰染料利用率来看，仅为1.5-2%，材料成本
dye se seris,(alexa 染料系列)、amca-x se、atto dye se seris. (atto 染料系列)。
36.本发明的液相氨基活化酯超声加成法是一种快速高效的合成dna/rna修饰探针的方法。本发明通过将带有氨基活性基团的单链核酸溶解在碱性缓冲液中然后加入1-4倍摩尔量的有机溶剂溶解的修饰染料活化酯，放在超声仪中在30-50℃温度加热超声5-15分钟，利用超声波产生的空化作用促进反应加速完成；然后加入酒精进行沉淀，同时用酒精对沉淀物进行反复洗涤，拿到沉淀固体，加入超纯水并利用超声快速溶解，即可直接装载至高效液相色谱仪上进行纯化，并得到纯的dna修饰探针或rna 修饰探针。本发明在生产过程中不需要等待4-12小时的反应，只需5min即可反应完成，极大的提高了反应速率，极大的缩短了反应周期；同时本发明大大提高了修饰染料的利用率，特别是对于长链核酸，例如46个碱基以上的核酸。
37.更为重要的是，本发明解决了固相亚磷酰胺三酯法的应用受限问题，解决了传统的液相氨基活化酯加成法对于结构复杂的dna/rna修饰探针生产困难的问题。
具体实施方式
38.为了使本领域技术领域人员更好地理解本技术中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本技术保护的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。
39.实施例一本发明方法的基本原理通过超声波产生空化现象，使带有氨基结构的dna/rna与琥珀酰亚胺活化酯修饰染料快速结合，提高了化学反应速率；同时因为反应时间极短，琥珀酰亚胺活化酯修饰染料不会降解，副反应大大减少，从而可以保证反应充分进行。本发明的反应化学方程式如下：具体的实施方案如下：步骤一：将200nmol含有氨基结构的dna/rna溶解于200ul ph为8.5的0.5m na2co3/nahco3缓冲液中，充分震荡混匀；步骤二：用75uldmf溶剂去溶解600nmol琥珀酰亚胺活化酯修饰染料，将此溶液加入至步骤一缓冲液中，震荡混匀；步骤三：将溶液放入超声仪，45度加热超声5-10分钟；步骤四：在上述溶液中加入酒精沉淀，12000转高速离心，去除上清液，取沉淀；
步骤五：用酒精清洗沉淀3遍，并将沉淀烘干，得dna/rna修饰探针粗品；步骤六：用超纯水将干燥后的dna/rna修饰探针粗品溶解，装载至高效液相色谱仪上，采用0.1m 三乙胺醋酸盐与乙腈进行纯化，拿到纯的产品。
40.本发明的原理在于：1. 通过超声波产生空化现象，即存在于反应体系中的微小气泡在超声场的作用下被激活，产生极短暂的高能环境，使结构复杂的dna/rna链得到有效的展开，更多的裸露出带有氨基结构的基团，提高反应效果。
41.2. 反应是在均相溶液中进行的，超声空化过程中形成的气泡里不仅含有液体本身产生的蒸气，而且含有溶解于液体的气体，空化气泡崩溃时，产生的能量可导致键的断裂，促进自由基的产生，改变溶剂结构从而加快反应速度。
42.实施例二.带有氨基活性基团的dna/rna和琥珀酰亚胺活化酯修饰染料不同超声频率比较实验1. 本发明对超声波的频率进行筛选：a. 将300nmol含有氨基结构的dna/rna溶解于300ul ph为8.5的0.5m na2co3/nahco3缓冲液中；b. 用450ul dmf溶剂去溶解3600nmol 琥珀酰亚胺活化酯修饰染料，充分震荡混匀；c. 取112.5ul上述活化酯溶液，加入至（a）dna/rna溶液中，旋涡震荡5秒，形成dna/rna底物与活化酯摩尔比为1:3的溶液；d. 将上述溶液均分为3份，分别在28khz、40khz、60khz 三个不同超声波频率下室温反应10分钟；e. 酒精沉淀后处理，采用0.1m三乙胺醋酸盐与乙腈进行hplc纯化后计算其摩尔收率进行对比，表中碱基数即指dna/rna中脱氧核苷酸或核苷酸的个数。具体数据如表1所示，各个样品样品序列如表2所示：表1表2
结论：因为空化效应的强度直接跟频率有关，频率越高，空化气泡越小，空化强度越弱，且其减弱的程度非常大。从数据来看，40khz的超声频率比60k hz的超声频率促进反应效率的效果更好，而28khz超声频率下，空化效应太强，直接导致修饰染料的底物骨架化学键断裂，反应最终非常杂，难以拿到纯的产品。
43.在此基础上，在保持上述超声反应条件不变的情况下，发明人在40khz的超声频率基础上进一步进行了验证不同频率对摩尔收率的影响，发明人选择了在室温和反应时间10分钟下对30khz、35khz、38khz、40khz、42khz、45khz、50khz、55khz进行测试，样品是dna-rox-1和rna-cy5-1，与40khz相比：a. 30khz的dna-rox-1和rna-cy5-1摩尔收率分别是40khz平均摩尔收率37%和54%；b. 35khz的dna-rox-1和rna-cy5-1摩尔收率分别是40khz平均摩尔收率67%和76%；c. 38khz的dna-rox-1和rna-cy5-1摩尔收率分别是40khz平均摩尔收率87%和90%；d. 42khz的dna-rox-1和rna-cy5-1摩尔收率分别是40khz平均摩尔收率106%和111%；e. 45khz的dna-rox-1和rna-cy5-1摩尔收率分别是40khz平均摩尔收率96%和105%；f. 50khz的dna-rox-1和rna-cy5-1摩尔收率分别是40khz平均摩尔收率82%和96%；
g. 55khz的dna-rox-1和rna-cy5-1摩尔收率分别是40khz平均摩尔收率45%和68%。
44.根据上述实验结果，选择35khz-50khz是优选的。
45.实施例三.带有氨基活性基团的dna/rna和琥珀酰亚胺活化酯修饰染料不同超声时间比较实验a. 将400nmol含有氨基结构的dna/rna溶解于400ul ph为8.5的0.5m na2co3/nahco3缓冲液中；b. 用600ul dmf溶剂去溶解4800nmol 琥珀酰亚胺活化酯修饰染料，充分震荡混匀；c. 取150ul上述（b）活化酯溶液加入至（a）dna/rna溶液中，旋涡震荡5秒，形成dna/rna底物与活化酯摩尔比为1:3的溶液；d. 将上述（c）溶液均分四份，在40khz超声频率和室温下分别反应2min、5min、10min、15min；e. 酒精沉淀后处理，采用0.1m 三乙胺醋酸盐与乙腈进行hplc纯化后计算其摩尔收率进行对比，表中碱基数即指dna/rna中脱氧核苷酸或核苷酸的个数。具体数据如表3：表3结论：从数据来看，对于碱基数较短的引物超声波反应5min后达到最大的反应收率，对于碱基数稍长的引物超声波反应10min后达到最大的反应收率，15min的反应效率与5min反应效率类似。
46.实施例四.带有氨基活性基团的dna/rna和琥珀酰亚胺活化酯修饰染料不同超声温度比较实验a. 将100nmol含有氨基结构的dna/rna溶解于100ul ph为8.5的0.5m na2co3/nahco3缓冲液中；b. 用600ul dmf溶剂去溶解4800nmol 琥珀酰亚胺活化酯修饰染料，充分震荡混匀；c. 取37.5ul上述（b）活化酯溶液加入至（a）dna/rna溶液中，旋涡震荡5秒，形成dna/rna底物与活化酯摩尔比为1:3的溶液；
d. 在40khz超声频率下，在25-60℃不同温度下反应10分钟；e. 酒精沉淀后处理，采用0.1m 三乙胺醋酸盐与乙腈进行hplc纯化后计算其摩尔收率进行对比，表中碱基数即指dna/rna中脱氧核苷酸或核苷酸的个数。具体数据如表4和样品序列如表5：表4表5
结论：从数据来看，超声波反应加热温度在45摄氏度时最佳，当温度过低时不足以使反应充分进行；当温度过高时，修饰引物会有部分发生降解，反应最终非常杂，导致收率降低。
47.实施例五.带有氨基活性基团的dna/rna和琥珀酰亚胺活化酯修饰染料不同摩尔比比较实验1.dna/rna底物与修饰染料的摩尔量对比进行实验a. 将100nmol含有氨基结构的dna/rna溶解于100ul ph为8.5的0.5m na2co3/nahco3缓冲液中；b. 用500ul dmf溶剂去溶解4000nmol 琥珀酰亚胺活化酯修饰染料，充分震荡混匀；c. 根据设定的摩尔比取不同体积的（b）活化酯溶液加入至（a）dna/rna溶液中，旋涡震荡5秒，形成不同摩尔浓度比的溶液；d. 在40khz超声频率下45℃反应10分钟；e. 酒精沉淀后处理，采用0.1m 三乙胺醋酸盐与乙腈进行hplc纯化后对dna/rna摩尔收率进行对比，表中碱基数即指dna/rna中脱氧核苷酸或核苷酸的个数。实验数据如表6：表6
结论：通过底物浓度筛选，得出结论氨基结构的dna/rna与琥珀酰亚胺活化酯修饰染料的摩尔比例为1:2为最佳比例，在摩尔比例为1:2的基础上再增加琥珀酰亚胺活化酯修饰染料，对收率影响不大；在探针合成中染料成本高，为了节省成本，尽可能减少染料使用
的量。
48.2.按照dna/rna与活化酯修饰染料的摩尔比例为1:2，超声频率为40khz，温度为45℃，反应时间为10分钟进行液相氨基活化酯超声加成实验，平行比较dna/rna与活化酯的摩尔比例为1:3的传统液相氨基活化酯加成实验，传统液相氨基活化酯加成实验的具体实验条件根据本发明背景技术中说明的实验条件完成。计算两种方法的摩尔收率与修饰染料利用率进行对比，表中碱基数即指dna/rna中脱氧核苷酸或核苷酸的个数。其对比数据如表7：表7结论：可以看到无论是dna还是rna，液相氨基活化酯超声加成法都较大幅度的提高了收率；特别是较长核酸中，液相氨基活化酯超声加成法相比传统液相氨基活化酯加成更具有优势，为大批量工业化生产提供了新的可靠工艺。
49.液相氨基活化酯超声加成法/传统液相氨基活化酯加成法比较结果如下表8和相应样品序列如表9所示。
50.表8
表9
从以上可以看出，对于核酸，本发明液相氨基活化酯超声加成法比传统液相氨基活化酯加成法的产物摩尔收率和单位修饰染料的利用率显著增加，特别是对于长度在46个以上碱基的rna或dna，本发明方法的优势更明显，本发明方法可以有效解决了长核酸的探针修饰技术难题。
51.3. 为验证本发明对结构复杂的dna/rna修饰探针合成效率的促进情况，按照dna/rna与活化酯的摩尔比例为1:2，超声频率为40khz，反应时间为10min，反应温度为45℃的反应条件进行液相氨基活化酯超声加成实验，平行比较dna/rna与活化酯的比例为1:3的传统液相氨基活化酯加成实验，传统液相氨基活化酯加成实验的具体实验条件根据本发明背景技术中说明的实验条件完成。计算两种方法的摩尔收率进行对比，具体数据如表10：表10
结论：从数据可以看到本发明方法对结构复杂的dna/rna修饰探针合成效率超声法的摩尔收率明显高于传统的活化酯加成法，本发明对于结构复杂的dna/rna修饰探针的接酯效率有显著提升。
52.实施例六.带有氨基活性基团的dna/rna和异硫氰酸活化酯修饰染料超声反应实验为了拓展本实验的普遍适用性，本专利同时研究了dna和rna与异硫氰酸活化酯修饰染料不同摩尔比的液相氨基活化酯超声加成实验，发现本发明对异硫氰酸酯修饰染料也具有良好的反应效果，反应原理见下反应式，具体数据见下表11和样品序列见表12： 具体操作方案如下：a. 将100nmol含有氨基结构的dna/rna溶解于100ul ph为8.5之间的0.5m na2co3/nahco3缓冲液中b. 用500ul dmf溶剂去溶解4000nmol 异硫氰酸活化酯修饰染料，充分震荡混匀；
c. 根据设定的摩尔比取不同体积的（b）活化酯溶液加入至（a）dna/rna溶液中，旋涡震荡5秒，形成不同摩尔浓度比的溶液；d. 在40khz超声频率下，45℃反应10分钟；e. 酒精沉淀后处理，采用0.1m 三乙胺醋酸盐与乙腈进行hplc纯化后对dna/rna摩尔收率进行对比。
53.表11表12
结论：结合异硫氰酸活化酯修饰染料的利用效率，带氨基结构的dna/rna与异硫氰酸活化酯修饰染料的反应的最佳摩尔比例为1:2。
54.应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
55.本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。