用于预测胃癌化疗疗效的甲基化CpG位点、检测试剂盒及用途

用于预测胃癌化疗疗效的甲基化cpg位点、检测试剂盒及用途
技术领域
1.本发明属于生物医学检测技术领域，特别涉及用于预测胃癌化疗疗效的甲基化cpg位点、检测试剂盒及用途。


背景技术：

2.胃癌(gastric cancer，gc)是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，是全世界最常见的恶性肿瘤之一。由于巨大多数胃癌属于腺癌，早期无明显症状，或出现上腹不适、嗳气等非特异性症状，常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似，易被忽略，因此，目前胃癌的早期诊断率仍较低，超过80％的胃癌患者确诊时已处于进展期，临床预后差，5年生存率低于20％，使得胃癌的死亡率很高。
3.由于胃癌的患病部位比较特殊，因此，目前药物治疗是胃癌患者的主要治疗手段。目前胃癌的主要化疗药物包括氟尿嘧啶类、铂类和紫杉类药物，通常以氟尿嘧啶类药物(5-fu/卡培他滨/替吉奥/雷替曲塞)为基础，联合铂类(奥沙利铂/顺铂/洛铂)和/或紫杉类(多西他赛/紫杉醇)组成两药或三药方案。但在化疗药物治疗过程，常常由于获得耐药性而导致治疗失败。因此，如何改善胃癌患者治疗的疗效和长期预后，提高患者的生存率和生活质量是亟待解决的问题。
4.长链非编码rna(long non-coding rna，lncrna)是指长度超过200个核苷酸的在众多功能上如可变剪接，染色质重构以及rna代谢等方面具有相关性但没有编码蛋白能力的调节的rna。近年来，lncrna作为一类新型、有效的致癌调节因子，已成为研究热点。已有研究表明，lncrna参与了多种肿瘤的形成过程，lncrna的表达与胃癌的发生发展、治疗及预后有关。
5.表观遗传是指由非dna序列改变引起的、可遗传的基因表达水平的改变。表观遗传的主要形式包括dna甲基化、rna干扰、组蛋白修饰和染色质重塑等。表观遗传通过调控基因表达参与发育编程，如早期发育重编程、基因组印记、x染色体失活和组织分化等事件。近年来，表观遗传因素在癌症中的作用已被证实。dna甲基化作为表观遗传的主要机制，在胃癌的发生、发展及预后中发挥着重要的作用。dna甲基化模式是组织和细胞特有的，是由dna甲基转移酶介导的一种共价修饰，通过s-腺苷甲硫氨酸将甲基添加到基因组中的胞嘧啶上，主要发生在胞嘧啶-鸟嘌呤(cpg)二核苷酸上，是哺乳动物dna的一种可遗传的、组织和物种特异性修饰。多项研究报道在癌症进展和患者预后期间，lncrna对dna甲基化的调控作用是控制基因表达的重要机制。此外，众多研究表明，dna甲基化与年龄、吸烟、饮酒等环境因素之间存在交互作用，而且这些与环境因素间的交互作用与肿瘤的发生发展相关。
6.转移相关肺腺癌转录本1(metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1，malat1)基因，最初是在研究人非小细胞肺癌的转移中通过减除杂交法筛选鉴定出的一个新的长链非编码rna，定位于人类11q13染色体上，其在序列上进化保守，种属间具有高度同源的序列，提示其在肿瘤的发生发展和转移的过程中发挥着重要功能。h19基因是一个在人类和其它动物中发现的lncrna基因，h19印迹基因位于人染色体11p15.5及鼠
的7号染色体上，属于单拷贝基因，受位于h19基因上游4kb处的差异甲基化区域(differentially methylated region，dmr)调控，基因印迹的分子基础可能是dna在胚胎发育的早期阶段的甲基化和染色质结构的变化。研究显示，h19作为lncrna能使许多与肿瘤细胞的侵袭、迁移及血管形成密切相关的基因表达上调，在一些癌症如乳腺癌、膀胱癌和胃癌中上调并扮演重要角色，并且h19的表达情况与术后早期复发现象有明显的关系，可作为判断术后早期复发的检测指标。
7.胃癌通常具有明确的发生部位和病变组织，因此，癌组织是进行胃癌相关研究时常用的标本。但是组织标本在取样时存在困难和阻碍，不仅成本高，而且研究对象依从性较差，因此并不适用于广泛的人群筛查和癌症的早期诊断。非侵入性生物样本(血液、唾液、尿液和乳汁等)中含有大量的分析物，尤其是外周血液来源的生物标志物，具有取样方便快速、微创、需求量少，可有效地提高研究对象的依从性等优点，为癌症早期识别和诊断治疗提供了新的途径。
8.目前已有多项研究表明malat1和h19基因在胃癌发生发展中发挥重要的作用，这些lncrna可能影响dna甲基化进而影响药物的作用，导致胃癌治疗结局在不同个体之间的差异。因此，本发明致力于阐明用于预测胃癌化疗疗效的甲基化cpg位点、检测试剂盒及用途。


技术实现要素：

9.有鉴于此，本发明有必要提供用于预测胃癌化疗疗效的甲基化cpg位点，这些甲基化cpg位点源自外周血白细胞malat1和/或h19基因，通过检测这些甲基化cpg位点的甲基化水平能够有效的预测胃癌化疗疗效，为指导胃癌患者个体化治疗提供新的思路和方法。
10.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
11.本发明提供了用于预测胃癌化疗疗效的甲基化cpg位点，所述甲基化cpg位点源自目标基因h19和/或malat1，所述甲基化cpg位点选自以下所述的甲基化cpg位点中的任何一种或两种以上的组合作为生物标志物：chr11:2018130、chr11:2018096、chr11:2018085、chr11:2018082、chr11:2018019、chr11:2018003、chr11:2017925、chr11:2017920、chr11:2017916、chr11:2017855、chr11:2017802、chr11:2020030、chr11:2020036、chr11:65263453、chr11:65263469、chr11:65265002、chr11:65264972。
12.通过检测上述甲基化cpg位点的甲基化水平能够预测胃癌化疗疗效，具体的说，chr11:2018130、chr11:2018082、chr11:65263453、chr11:65264972位点高甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:2018096、chr11:2018085、chr11:2018019、chr11:2018003、chr11:2017925、chr11:2017920、chr11:2017916、chr11:2017855、chr11:2017802、chr11:2020030、chr11:2020036、chr11:65263469、chr11:65265002位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好。
13.并且上述甲基化cpg位点通过采集患者的外周血白细胞即可进行检测，具有快速、简便、有效和准确度高的优势。
14.本发明进一步提供了一种检测甲基化cpg位点的甲基化水平的试剂在制备预测胃癌化疗疗效的检测试剂盒中的用途，所述甲基化cpg位点源自目标基因h19和/或malat1，所述甲基化cpg位点选自以下所述的甲基化cpg位点中的任何一种或两种以上的组合作为生
物标志物：chr11:2018130、chr11:2018096、chr11:2018085、chr11:2018082、chr11:2018019、chr11:2018003、chr11:2017925、chr11:2017920、chr11:2017916、chr11:2017855、chr11:2017802、chr11:2020030、chr11:2020036、chr11:65263453、chr11:65263469、chr11:65265002、chr11:65264972。
15.通过检测特定目标基因甲基化cpg位点的甲基化水平，能够预测胃癌化疗疗效。
16.进一步的，检测所述甲基化cpg位点的的甲基化水平的方法包括以下步骤：
17.获取胃癌患者的外周血作为待测样品，提取外周血白细胞中的dna；
18.重亚硫酸盐转化提取的dna样本，目标片段多重pcr扩增反应；
19.在样本中添加特异性标签序列；
20.定量后上机测序；
21.根据测序数据生物信息学分析确定所述甲基化cpg位点的甲基化水平。
22.具体的说，胃癌患者的外周血采集方式采用本领域中常规方式，根据本发明的实施例，从患者前臂采集静脉血5ml放置于抗凝管中即可。利用dna提取试剂提取待测样品中的dna。
23.进一步的，利用本领域中dna甲基化分析的常用转化方式-重亚硫酸盐转化，将胞嘧啶(cytosine，c)转化为尿嘧啶(uracil，u)，而5-甲基胞嘧啶(5-methyl cytosine，5-mc)保持不变，即经过重亚硫酸盐处理，未甲基化的胞嘧啶脱氨成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不发生变化；随后经过pcr扩增放大，尿嘧啶(uracil，u)转换为胸腺嘧啶(thymine，t)，而5-mc重新恢复成c，因此可以将基因中的c和5-mc区别开。
24.然后在每个样本上添加一段特异性标签序列，以标记样本。根据本发明的实施例中，通过引入含有特异性标签序列的下游接头引物进行pcr反应，在样本上添加特异性标签序列，其中，所述的特异性标签序列由atcacg、cgatgt、ttaggc、tgacca、acagtg、gccaat、cagatc、acttga、gatcag、tagctt、ggctac和cttgta组成。
25.标记样本后，定量获得高通量测序文库，进行高通量测序。具体的，高通量测序方式可采用本领域中常规的方式进行测序。
26.最后根据测序的数据通过生物信息学分析确定所述甲基化cpg位点的甲基化水平，其中，所述的甲基化水平＝该位点甲基化的reads数目(即检测到碱基c的reads数目)/该位点总的reads数目)。
27.本发明进一步提供了用于预测胃癌化疗疗效的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于检测甲基化cpg位点的甲基化水平的试剂，具体的说，所述检测试剂盒包括用于扩增所述甲基化cpg位点的引物和测序文库构建的接头引物，还包括用于dna甲基化分析的必要试剂，如dna提取试剂、pcr扩增试剂、转化液、洗涤液、洗脱液、纯化液、缓冲液等，在本发明的一些具体的实施例中，采用的dna提取试剂、pcr扩增试剂转化液、洗涤液、洗脱液、纯化液、缓冲液等可以是本领域中任意一种常规的试剂，故这里不再具体阐述。
28.进一步的，扩增所述甲基化cpg位点的引物和测序文库构建的接头引物是检测甲基化cpg位点甲基化水平的重要部分，具体的，在本发明的实施例中，用于扩增所述的甲基化cpg位点chr11:2018130和/或chr11:2018096和/或chr11:2018085和/或chr11:2018082和/或chr11:2018019和/或chr11:2018003的引物由seq id no.18和seq id no.19所示的引物序列组成；
29.用于扩增所述的甲基化cpg位点chr11:2017925和/或chr11:2017920和/或chr11:2017916和/或chr11:2017855和/或chr11:2017802的引物由seq id no.20和seq id no.21所示的引物序列组成；
30.用于扩增所述的甲基化cpg位点chr11:2020030和/或chr11:2020036的引物由seq id no.22和seq id no.23所示的引物序列组成；
31.用于扩增所述的甲基化cpg位点chr11:65263453和/或chr11:65263469的引物由seq id no.24和seq id no.25所示的引物序列组成；
32.用于扩增所述的甲基化cpg位点chr11:65265002和/或chr11:65264972的引物由seq id no.26和seq id no.27所示的引物序列组成。
33.进一步的，所述接头引物包括上游接头引物和含有标签序列的下游接头引物，其中，所述接头引物包括上游接头引物和含有标签序列的下游接头引物，其中，所述上游接头引物的序列如seq id no.28所示；所述下游接头引物由seq id no.29-seq id no.40所示的引物序列组成。
34.本发明进一步提供了预测胃癌化疗疗效的系统，包括：
35.获取模块，所述获取模块用于获取甲基化cpg位点的甲基化水平；
36.数据处理模块，所述数据处理模块用于将甲基化cpg位点的甲基化水平与化疗疗效结果进行统计学分析；
37.以及预测模块，所述预测模块根据甲基化cpg位点的甲基化水平预测胃癌化疗疗效；
38.具体的说，所述的获取模块包括前述所述的检测试剂盒，从而对特定甲基化cpg位点的甲基化水平进行检测。所述的数据处理模块包括计算机，通过计算机对获取的检测结果获得相应甲基化cpg位点的甲基化水平，将甲基化cpg位点的甲基化水平与化疗疗效结果进行统计学分析；所述预测模块是根据甲基化水平预测胃癌化疗疗效，输出胃癌化疗疗效预测结果。可以理解的是，数据处理模块中除了包括计算机，还包括对数据进行计算和分析的必要软件，这里不再具体阐述。
39.进一步的，所述的数据处理模块将患者甲基化cpg位点的甲基化水平与化疗疗效的结果(进展或未进展)进行统计分析，采用logistic回归或cox回归分析计算得到比值比or或风险比hr。在有统计学意义的前提下，比值比or或风险比hr定义为甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加or或hr倍。
40.所述预测模块用于根据甲基化cpg位点的甲基化水平预测胃癌化疗疗效，输出胃癌化疗疗效预测结果具体为：若此位点所对应的or或hr《1，表明甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险减小，由此得出此位点高甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；若此位点对应的or或hr》1，表明甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加，由此得出此位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好。根据本发明的实施例，chr11:2018130位点、chr11:2018082位点、chr11:65263453位点、chr11:65264972位点所对应的or或hr《1，表明甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险减小1/(or或hr)倍，由此得出chr11:2018130位点、chr11:2018082位点、chr11:65263453位点、chr11:65264972位点高甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:2018096位点、chr11:2018085位点、chr11:2018019位点、chr11:2018003位点、chr11:2017925位点、chr11:2017920位点、chr11:2017916位点、chr11:
2017855位点、chr11:2017802位点、chr11:2020030位点、chr11:2020036位点、chr11:65263469位点、chr11:65265002位点对应的or或hr》1，表明甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加or或hr倍，由此得出chr11:2018096位点、chr11:2018085位点、chr11:2018019位点、chr11:2018003位点、chr11:2017925位点、chr11:2017920位点、chr11:2017916位点、chr11:2017855位点、chr11:2017802位点、chr11:2020030位点、chr11:2020036位点、chr11:65263469位点、chr11:65265002位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好。
41.此外，需要说明的是，本文中所述的胃癌化疗疗效可以采用实体瘤疗效评价标准1.1版(recist1.1)判定，化疗2个周期后(6-8周)影像学检查(ct)发现靶病灶及非靶病灶表现为疾病稳定(sd)或部分缓解(pr)或完全缓解(cr)，疾病未进展，则判定化疗疗效好；靶病灶及非靶病灶表现为疾病进展(pd)，则判定化疗疗效差。
42.所述的化疗是指采用本领域中常用的胃癌化疗药物进行药物治疗。具体的说，使用的化疗药物包括单药化疗、联合化疗中的至少一种。其中，所述的单药化疗包括：(1)氟尿嘧啶类(如氟尿嘧啶、卡培他滨、替吉奥或雷替曲塞)；(2)紫衫类(如紫杉醇、紫杉醇脂质体或多西他赛；(3)伊立替康。所述的联合化疗包括：(1)铂类联合氟尿嘧啶类；铂类可以为奥沙利铂、顺铂或洛铂，氟尿嘧啶类可以为氟尿嘧啶、卡培他滨、替吉奥或雷替曲塞；(2)紫杉类联合氟尿嘧啶类；紫杉类可以为紫杉醇、紫杉醇脂质体、多西他赛，氟尿嘧啶类可以为氟尿嘧啶、卡培他滨、替吉奥或雷替曲塞；(3)紫杉类联合铂类；紫衫类可以为紫杉醇、紫杉醇脂质体或多西他赛，铂类可以为顺铂、奥沙利铂、洛铂或卡铂；(4)伊立替康联合铂类；铂类可以为顺铂或洛铂；(5)伊立替康联合氟尿嘧啶类；氟尿嘧啶类可以为氟尿嘧啶、卡培他滨、替吉奥或雷替曲塞；(6)紫杉类联合铂类联合氟尿嘧啶类；紫杉类可以为多西他赛、紫杉醇或紫杉醇脂质体，铂类可以为顺铂或奥沙利铂，氟尿嘧啶类可以为氟尿嘧啶、卡培他滨或替吉奥；(7)表柔比星联合铂类联合氟尿嘧啶类；铂类可以为顺铂或奥沙利铂，氟尿嘧啶类可以为氟尿嘧啶、卡培他滨或替吉奥。可以理解的是，化疗药物并不局限于上述。具体的用药没有特别的限定，根据使用药物或病情等相关情况按照医生要求进行用药，这里不再具体阐述。
43.本发明具有以下有益效果：
44.本发明提供了能够预测胃癌化疗疗效的外周血白细胞malat1和h19基因的甲基化cpg位点，通过检测这些甲基化cpg位点的甲基化水平能够预测胃癌化疗疗效，由于这些甲基化cpg位点源自外周血白细胞中的malat1和h19基因，因此，具有取样方便快速、微创、需求量少的优点。
45.本发明基于上述甲基化cpg位点设计了能够特异性检测这些甲基化cpg位点的相关引物，通过dna甲基化分析技术提出了用于预测胃癌化疗疗效的检测试剂盒和系统，从而实现胃癌化疗疗效的快速、准确预测，从而为胃癌化疗疗效的预测提供了新的思路和途径。
具体实施方式
46.下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
47.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的
技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。另外，如无特别说明，未具体记载条件或者步骤的方法均为常规方法，所采用的试剂和材料均可从商业途径获得。
48.实施例1预测胃癌化疗疗效的甲基化cpg位点的筛选
49.本实施例中提供了预测胃癌化疗疗效的甲基化cpg位点，这些甲基化cpg位点源自外周血白细胞中的目标基因h19和malat1，这些甲基化cpg位点的筛选过程如下：
50.1、预测h19和malat1基因的cpg区域(包括cpg岛和cpg岛岸)：使用emboss explorer软件对h19和malat1基因的cpg区域进行预测，筛选条件为：
51.(1)观察到的cpg二核苷酸与预期的cpg二核苷酸之比(observed/expected ratio)》0.60；
52.(2)gc含量(percent g+percent c)》50.0％；
53.(3)长度(length)》200bp；
54.(4)查找范围：转录起始位点(transcriptional start site，tss)上游2k到第一外显子下游1k区域内的cpg岛。
55.按照上述条件，目的基因h19和malat1共检测7个cpg区域(5个cpg岛，2个cpg岛岸)，91个cpg位点，具体见表1。h19和malat1基因91个cpg位点的位置具体见表2。
56.表1h19和malat1基因cpg位点及岛岸的数量
[0057][0058]
表2h19和malat1基因91个cpg位点的位置
[0059]
[0060][0061]
表2中，a：基因组位置，该位点在参照基因组上的位置b：距离，该位点在参照基因组上相对转录起始位置的距离，负号表示该位点在转录起始位点的上游。
[0062]
2、经实验甲基化cpg位点甲基化水平检测及统计学分析后，筛选出与胃癌化疗疗效相关的外周血白细胞h19和malat1基因甲基化cpg位点，筛选得到的具体的甲基化cpg位点信息如表3中所示的：
[0063]
表3预测胃癌化疗疗效的甲基化cpg位点
[0064]
目标基因(染色体位置)序列号h19b5(chr11:2018130)seq id no.1h19b7(chr11:2018096)seq id no.2h19b9(chr11:2018085)seq id no.3h19b10(chr11:2018082)seq id no.4h19b14(chr11:2018019)seq id no.5h19b15(chr11:2018003)seq id no.6h19c2(chr11:2017925)seq id no.7h19c3(chr11:2017920)seq id no.8h19c4(chr11:2017916)seq id no.9h19c7(chr11:2017855)seq id no.10
h19c13(chr11:2017802)seq id no.11h19d3(chr11:2020030)seq id no.12h19d4(chr11:2020036)seq id no.13malat1a1(chr11:65263453)seq id no.14malat1a4(chr11:65263469)seq id no.15malat1b2(chr11:65265002)seq id no.16malat1b9(chr11:65264972)seq id no.17
[0065]
实施例2预测胃癌化疗疗效的检测试剂盒
[0066]
本实施例提供了一种预测胃癌化疗疗效的检测试剂盒，该检测试剂盒包括用于扩增实施例1中甲基化cpg位点的引物和接头引物。
[0067]
其中，扩增甲基化cpg位点的引物和接头引物的信息如表4和表5中所示的。
[0068]
表4扩增甲基化cpg位点的引物
[0069][0070]
表5测序文库构建的接头引物
[0071][0072]
可以理解的是，该检测试剂盒中还包括dna提取试剂、pcr扩增试剂、转化液、缓冲液、洗涤液、洗脱液和纯化液等试剂，这里不再具体阐述。
[0073]
实施例3甲基化cpg位点的甲基化水平检测
[0074]
本实施例基于实施例2中的检测试剂盒，对甲基化cpg位点的甲基化水平进行检测。
[0075]
1、采集血样
[0076]
由经过培训的医护人员从胃癌患者前臂采集静脉血5ml，放置于0.5m edta抗凝管中。
[0077]
2、提取dna
[0078]
(1)1.5ml离心管中加入750μl的buffer fg1，再向其中加入300μl全血，充分混匀；
[0079]
(2)10000g、离心20s；弃上清，将离心管倒置在干净的吸水纸上2min，注意沉淀仍留在管中；
[0080]
(3)向离心管中加入150μl buffer fg2/qiagen protease，涡旋振荡5s，混匀至沉淀完全溶解；
[0081]
(4)将样品快速离心3-5s，再放入水浴箱中，65℃水浴5min(样品颜色从红色变为橄榄绿，表明蛋白质消化)；
[0082]
(5)向离心管中加入100％的异丙醇150μl，倒置充分混匀，直至dna沉淀物变为絮状物；
[0083]
(6)10000g、离心3min；弃上清，将离心管倒置在干净的吸水纸上至少5min，将水份吸干，注意沉淀仍留在管中；
[0084]
(7)风干至少5min，直至所有液体蒸发完；
[0085]
(8)向离心管中加入200μl buffer fg3，低速震荡5s，65℃水浴1h，溶解dna，取1μ
ldna电泳质检。
[0086]
3、dna浓度和质量评估
[0087]
(1)琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna完整性：电泳条带清晰可见，无明显降解，且无rna污染；
[0088]
(2)nanodrop 2000检测基因组dna质量：浓度≥20ng/μl，总量≥1μg，od260/280＝1.7～2.0，od260/230≥1.8。
[0089]
4、重亚硫酸盐处理
[0090]
使用重亚硫酸盐(bisulfite)对外周血全基因组dna进行处理，将基因组dna未被甲基化修饰的c转化为u。
[0091]
5、目标片段多重pcr反应
[0092]
(1)引物采用实施例2中表4中公开的扩增甲基化cpg位点的引物；
[0093]
(2)pcr反应体系：反应体系(20μl)有2μl样本dna，1x hotstartaq buffer，3.0mm mg
2+
，0.2mm dntp，1u hotstartaq polymerase(qiagen inc.)和1μl多重pcr引物。
[0094]
(3)pcr扩增程序：
[0095]
step.195℃，2minstep.294℃、20s；63℃、40s；72℃、1min(11cycles，-0.5℃/cycle)step.394℃、20s；65℃、30s；72℃、1min(24cycles)step.472℃、2min；4℃、for ever
[0096]
6、样本添加特异性标签序列
[0097]
在每个样本上添加特异性的一段序列以标记样本，特异性的标签序列包含atcacg、cgatgt、ttaggc、tgacca、acagtg、gccaat、cagatc、acttga、gatcag、tagctt、ggctac、cttgta。
[0098]
(1)pcr反应体系：反应体系(20μl)有1μl多重扩增产物，1x反应缓冲液，3.0mm mg
2+
，0.2mm dntp，1u q5tm dna聚合酶，和0.3μl上游接头引物、0.3μl含标签序列的下游接头引物；其中，上游接头引物和下游接头引物具体信息如实施例2表5中所示的。
[0099]
(2)pcr扩增程序：
[0100]
step.198℃，30sstep.298℃、10s；65℃、30s；72℃、30s(11cycles)step.372℃、5min；4℃、for ever
[0101]
7、定量后上机测序
[0102]
将所有样品index pcr扩增产物等量混合，并经割胶回收获得最终的高通量测序文库，文库的片段长度分布经agilent 2100bioanalyzer验证。文库摩尔浓度精确定量后，最终于illumina高通量测序平台，以2
×
150bp的双端测序模式进行高通量测序，获得fastq数据。
[0103]
8、测序数据生物信息学分析
[0104]
(1)使用软件flash(flash:fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies.)，将经过滤的r1、r2 reads拼接为较长的reads，获得fastq文件；
[0105]
(2)用fastx(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html)处理拼
接获得的fastq文件，得到fa格式序列；
[0106]
(3)继而使用blast+(camacho c,(2009)"blast+:architecture and applications")将该fa中所有reads和目的区域参考序列进行比对，筛选能够覆盖其目标序列的90％，记为有效reads，并对其进行统计；
[0107]
(4)使用blast+(camacho c,(2009)"blast+:architecture and applications")与目的区域参考序列再次进行比对，得到有效测序序列，剔除冗余数据；统计每个样本的有效测序数据中，经重亚硫酸盐处理后，碱基c转变为t的效率；
[0108]
(5)进行cpg位点甲基化分析，最终确定外周血白细胞malat1和h19基因cpg位点甲基化水平。(甲基化水平＝该位点甲基化的reads数目(即检测到碱基c的reads数目)/该位点总的reads数目)。
[0109]
实施例4预测胃癌化疗疗效
[0110]
1、判定疗效标准
[0111]
收集150例初治胃癌患者，采用铂类联合氟尿嘧啶类化疗2个周期(6-8周)并持续随访，胃癌化疗疗效采用实体瘤疗效评价标准1.1版(recist1.1)来判定。胃癌患者化疗2个周期(6-8周)后对患者进行影像学检查(ct)评价化疗疗效，靶病灶及非靶病灶表现为疾病稳定(sd)或部分缓解(pr)或完全缓解(cr)则判定疾病未进展，即化疗疗效好，靶病灶及非靶病灶表现为疾病进展(pd)则判定化疗疗效差。(因变量：0＝疗效好；1＝疗效差；)
[0112]
2、预测胃癌化疗疗效
[0113]
表6外周血白细胞h19和malat1基因cpg位点甲基化水平与胃癌化疗疗效的关联
[0114][0115]
表6中，a：chr：染色体；2018130：基因组位置；b：甲基化水平用百分比表示，数据描述为中位数(p
25
，p
75
)；未进展包括疾病稳定、部分缓解或完全缓解。
[0116]
注：表6是根据统计学上一般认为p值小于0.05为有统计学意义得出的相关数据，其中chr11:2018130、chr11:2020030、chr11:2020036、chr11:65263453、chr11:65264972位点甲基化水平是在50例iv期胃癌患者中分析得出的(其中化疗疗效好26例，化疗疗效差24例)；chr11:2018096、chr11:2018085、chr11:2018082、chr11:2018019、chr11:2018003、chr11:2017925、chr11:2017920、chr11:2017916、chr11:2017855、chr11:2017802、chr11:65263469、chr11:65265002位点甲基化水平是在150例胃癌患者中后续长期随访数据分析得出的。
[0117]
在有统计学意义的前提下，比值比or或风险比hr定义为甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加or或hr倍。因此，chr11:2018130位点、chr11:2018082位点、chr11:65263453位点、chr11:65264972位点所对应的or或hr《1，表明甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险减小1/(or或hr)倍，由此得出chr11:2018130位点、chr11:2018082位点、chr11:65263453位点、chr11:65264972位点高甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:2018096位点、chr11:2018085位点、chr11:2018019位点、chr11:2018003位点、chr11:2017925位点、chr11:2017920位点、chr11:2017916位点、chr11:2017855位点、chr11:2017802位点、chr11:2020030位点、chr11:2020036位点、chr11:65263469位点、chr11:65265002位点对应的or或hr》1，表明甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加or
或hr倍，由此得出chr11:2018096位点、chr11:2018085位点、chr11:2018019位点、chr11:2018003位点、chr11:2017925位点、chr11:2017920位点、chr11:2017916位点、chr11:2017855位点、chr11:2017802位点、chr11:2020030位点、chr11:2020036位点、chr11:65263469位点、chr11:65265002位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好。
[0118]
从表6可以看出，chr11:2018130位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加0.431倍，相当疾病进展的风险减小2.32倍，chr11:2018130位点高甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:2018082位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加0.711倍，相当疾病进展的风险减小1.406倍，chr11:2018082位点高甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:65263453位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加0.68倍，相当疾病进展的风险减小1.471倍，chr11:65263453位点高甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:65264972位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加0.112倍，相当疾病进展的风险减小8.929倍，chr11:65264972位点高甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:2018096位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加1.143倍，chr11:2018096位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:2018085位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加1.18倍，chr11:2018085位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:2018019位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加1.322倍，chr11:2018019位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:2018003位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加1.517倍，chr11:2018003位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:2017925位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加1.087倍，chr11:2017925位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:2017920位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加1.198倍，chr11:2017920位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:2017916位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加1.254倍，chr11:2017916位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:2017855位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加1.358倍，chr11:2017855位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:2017802位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加1.32倍，chr11:2017802位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:2020030位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加1.134倍，chr11:2020030位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:2020036位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加1.106倍，chr11:2020036位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:65263469位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加1.222倍，chr11:65263469位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；chr11:65265002位点：甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加1.759倍，chr11:65265002位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好。
[0119]
实施例5用于预测胃癌化疗疗效的系统
[0120]
本实施例基于实施例1-4中的结果，提供了一种用于预测胃癌化疗疗效的系统，该系统包括获取模块、数据处理模块和预测模块：
[0121]
其中，获取模块用于获取实施例1中筛选出的甲基化cpg位点的甲基化水平。根据本实施例具体的获取方法可通过实施例2所述的检测试剂盒检测特定甲基化cpg位点的甲基化水平。
[0122]
数据处理模块用于通过计算机对获取的检测结果进行相应的分析获得甲基化水平，将患者甲基化水平与化疗疗效的结果(进展或未进展)进行统计分析，采用logistic回归或cox回归分析计算得到比值比or或风险比hr。在有统计学意义的前提下，比值比or或风险比hr定义为甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加or或hr倍。可以理解的是，数据处理模块除了包括计算机等数据采集模块，还包括一些必要的计算或分析软件，这里不再具体阐述。
[0123]
进一步的，预测模块用于根据甲基化cpg位点的甲基化水平预测胃癌化疗疗效，输出胃癌化疗疗效预测结果。具体的说，若此位点所对应的or或hr《1，表明甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险减小，由此得出此位点高甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好；若此位点对应的or或hr》1，表明甲基化水平每增加一个单位，疾病进展的风险增加，由此得出此位点低甲基化时，预测胃癌的化疗疗效好。具体的预测可参考实施例4中所述的，这里不再具体阐述。
[0124]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0125]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。