用于鉴定中国南瓜

用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的ssr分子标记e201及其引物、试剂盒与方法
技术领域
1.本发明属于生物技术辅助育种领域，特别涉及用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的ssr分子标记e201及其引物、试剂盒与方法。


背景技术：

2.中国南瓜(cucurbita moschatad.)，一年生蔓生草本植物，其作为一种重要的蔬菜作物，在全球范围内广泛栽培种植。由于杂种优势的存在，杂交一代种在抗病、抗逆和果实品质等方面明显优于两亲本。但在中国南瓜杂交制种过程中，授粉期间由于母本雄花摘除不彻底或不及时，导致花粉落到母本雌花柱头上产生自交种子，从而出现假杂种，导致种子遗传纯度下降，给生产造成巨大的经济损失。因此，优良一代杂交种纯度的快速、准确鉴定成为中国南瓜生产中最为迫切解决的问题之一。
3.种子纯度鉴定常用的方法主要包括田间形态鉴定、同工酶鉴定和分子标记鉴定等。田间形态鉴定成本较高，周期较长，且鉴定结果还会受到环境因素的影响；同工酶鉴定准确性高，但由于其具有组织和器官特异性，应用常常受到限制。分子标记技术能够从dna水平上揭示子代和亲本间微小的遗传差异，不受生长季节、环境条件和栽培措施的影响，可以极大的缩短鉴定时间，其中ssr标记具有多态性高，数量多，稳定性好，并且易于检测等优点，被广泛应用于纯度鉴定和分子标记辅助育种等工作中。
4.近年来，中国南瓜
‘
中蔬砧1号’由于其生长势旺，抗病抗逆性强，根系强大等优点，常被用做砧木，用于提高黄瓜、西瓜等葫芦科作物的抗逆性，推广面积日益扩大，种子需求量随之增大。为了防止人工制种过程中出现母本自交形成假杂种这一现象，急需确定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种种子纯度鉴定方法，为中国南瓜的纯度鉴定提供技术支持。


技术实现要素：

5.基于上述领域的空白，本发明旨在提供一种用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种种子纯度的ssr分子标记；提供一种用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种种子纯度的pcr检测试剂盒；将所述的ssr标记应用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种真实性或种子纯度等方面，使得无需等待南瓜单株成长至果实成熟期再观察形态特征，在幼苗期即可提取dna，根据扩增片段区分真假杂种，有效鉴定杂种纯度。
6.本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
7.用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的ssr分子标记e201，其特征在于，检测所述ssr分子标记e201的上游引物e201-f序列如seq id no.3所示，下游引物e201-r序列如seq id no.4所示。
8.所述ssr分子标记在中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的母本
‘
823’基因组中的特征条带序列如seq id no.1。
9.所述ssr分子标记在中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的父本
‘
824’基因组中的特征条
带序列如seq id no.2；
10.优选地，所述ssr分子标记在中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种基因组的特征条带序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
11.一种检测用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的ssr分子标记e201的引物，其特征在于，其上游引物e201-f序列如seq id no.3所示，下游引物e201-r序列如seq id no.4所示。
12.一种分子鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的引物，其特征在于，包括：一种检测用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的ssr分子标记e201的引物；所述引物的上游引物e201-f序列如seq id no.3所示，下游引物e201-r序列如seq id no.4所示。
13.用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的试剂盒，其特征在于，包括：一种检测用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的ssr分子标记e201的引物；所述引物的上游引物e201-f序列如seq id no.3所示，下游引物e201-r序列如seq id no.4所示。
14.所述的用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的试剂盒还包括：pcr试剂和/或电泳试剂。
15.一种分子鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的方法，其特征在于，采用检测用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的ssr分子标记e201的引物对候选南瓜材料进行pcr。
16.所述pcr的体系包括：0.75ng/μl dna模板，正向和反向引物各5ng/μl，0.5μl/μl 2
×
3g taq master mix for page(red dye)；
17.优选地，所述pcr体系为：7.5ng dna模板，正向和反向引物各50ng，5μl 2
×
3g taq master mix for page(red dye)，加双蒸水至10μl；
18.优选地，所述pcr的程序包括：95℃预变性3分钟；以95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒为1个循环，共35个循环；72℃保温5分钟；
19.优选地，所述dna模板指候选南瓜材料的dna。
20.根据所述pcr的产物的电泳结果或测序结果判别鉴定结果；
21.电泳结果显示2条特征条带或测序结果同时测出如seq id no.1和seq id no.2所示的2条序列的候选南瓜材料为中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种；
22.优选地，所述电泳指，将pcr产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离；
23.优选地，电泳条件为150v恒功率电泳分离1h30min，电泳后银染显色。
24.本发明提供了一种所述ssr分子标记e201及其引物对e201-f和e201-r，主要应用于在南瓜杂交种子纯度鉴定和辅助鉴定、南瓜杂交种子纯度筛选和南瓜分子标记辅助育种中。
25.本发明的另一方面是提供一种用于中国南瓜品种
‘
中蔬砧1号’杂交种真实性或者鉴定
‘
中蔬砧1号’杂交种种子纯度的pcr检测试剂盒，该pcr检测试剂盒包括：dntps、taq酶、由正向引物和反向引物组成的pcr引物对，扩增缓冲液和灭菌水；其中，所述的pcr引物是上述所述的ssr分子标记e201。
26.本发明的再一方面是提供一种鉴定中国南瓜品种
‘
中蔬砧1号’真实性或种子纯度的方法：应用所述的ssr标记，通过pcr扩增，经6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，即可显示不同个体间的多态性，从而达到鉴定的目的。
27.具体的，本发明提供了一种应用所述的基于ssr标记鉴定中国南瓜品种
‘
中蔬砧1
号’种子纯度的方法，该鉴定方法包括：
28.(1)提取待检测的南瓜种子样品的基因组dna；
29.(2)以提取的样品基因组dna为模板，利用seq id no.3和seq id no.4所示的上下游引物e201-f和e201-r进行pcr扩增反应，获得pcr产物；
30.(3)对步骤(2)的pcr扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；
31.(4)对步骤(3)的电泳结果进行分析，每一种扩增产物的带型均同时具有
‘
中蔬砧1号’杂交种父母本的带型，则待检测南瓜品种为
‘
中蔬砧1号’杂交种；如果任何一种扩增产物的带型不同时具有
‘
中蔬砧1号’杂交种父母本的带型，则待检测南瓜品种则不是
‘
中蔬砧1号’杂交种；
32.(5)计算真实的
‘
中蔬砧1号’杂交种个数占总检测种子个数的比率，得到
‘
中蔬砧1号’杂交种的种子纯度。
33.所述pcr体系包括：0.75ng/μl dna模板，正向和反向引物各5ng/μl，0.5μl/μl 2
×
3g taq master mix for page(red dye)；
34.优选地，所述pcr体系为：7.5ng dna模板，正向和反向引物各50ng，5μl 2
×
3g taq master mix for page(red dye)，加双蒸水至10μl；
35.所述dna模板母本
‘
823’、父本
‘
824’和
‘
中蔬砧1号’的单株幼苗基因组dna；
36.优选地，所述pcr程序为：95℃预变性3分钟；以95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒为1个循环，共35个循环；72℃保温5分钟；
37.优选地，所述检测还包括：对pcr产物进行电泳；
38.所述电泳指，将pcr产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离；
39.优选地，电泳条件为150v恒功率电泳分离1h30min，电泳后银染显色；
40.优选地，如果每一种扩增产物的带型均同时具有
‘
中蔬砧1号’杂交种父母本的带型，则待检测南瓜品种为
‘
中蔬砧1号’杂交种；如果任何一种扩增产物的带型不同时具有
‘
中蔬砧1号’杂交种父母本的带型，则待检测南瓜品种则不是
‘
中蔬砧1号’杂交种。
41.优选地，纯度计算是指杂交种子数量占检测样品种子粒数的百分率；
42.所述的南瓜杂交种
‘
中蔬砧1号’的母本为
‘
823’，所述南瓜杂交种
‘
中蔬砧1号’的父本为
‘
824’，所述的杂交f1单株均指
‘
中蔬砧1号’杂交种的单株。
43.本发明的有益效果：
44.1、本发明开发了一对可以用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种子纯度的分子标记及引物，该分子标记可以快速区分真假杂种，且特异性强，遗传稳定，可以快速应用于南瓜纯度的分子标记辅助育种筛选。
45.2、通过本发明的引物及方法，只需要提取南瓜幼苗期叶片基因组dna，然后进行pcr扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可快速有效鉴定
‘
中蔬砧1号’杂交种子的纯度，无需进行田间观察，快速，准确，成本低，具有较高的商业价值。
46.3、利用本发明方法鉴定南瓜杂交种子纯度特异性好、准确度高，与田间种子调查结果一致，鉴定准确率高达100％。通过本发明提供的e201分子标记及引物，按照本发明提供的鉴定方法可在幼苗期快速、准确检测出
‘
中蔬砧1号’杂交种子与其父母本种子，本发明开发的分子标记可应用于中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种子大田生产和制种生产实践中。
附图说明
47.图1为父母本和
‘
中蔬砧1号’抽样电泳图谱(marker，750bp；p1，母本
‘
823’，p2，父本
‘
824’；其余条带为
‘
中蔬砧1号’杂交种条带；p1显示条带为seq id no.1；p2显示条带为seq id no.2)。
具体实施方式
48.下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。
49.生物材料的来源
50.本发明实验例所用的试验材料：母本
‘
823’、父本
‘
824’为申请人实验室自有南瓜株系，申请人承诺申请日起20年内向公众发放上述南瓜株系的种子用于验证本发明的效果；
51.杂交种
‘
中蔬砧1号’为公知公用的南瓜品种，可以商购获得。
52.主要试剂
53.pcr实验使用vazyme公司的2
×
3g taq master mix for page(red dye)；凝胶电泳使用北京酷来搏科技有限公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6％后使用。测序在北京生工公司进行。
54.第1组实施例、本发明的ssr分子标记e201
55.本组实施例提供用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的ssr分子标记e201。本组所有的实施例都具备如下共同特征：检测所述ssr分子标记e201的上游引物e201-f序列如seq id no.3所示，下游引物e201-r序列如seq id no.4所示。
56.在一些实施例中，所述ssr分子标记在中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的母本
‘
823’基因组中的特征条带序列如seq id no.1；
57.在另一些实施例中，所述ssr分子标记在中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的父本
‘
824’基因组中的特征条带序列如seq id no.2；
58.优选地，所述ssr分子标记在中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种基因组的特征条带序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。
59.第2组实施例、本发明ssr分子标记e201的引物
60.本组实施例提供一种检测用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的ssr分子标记e201的引物。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述引物的上游引物e201-f序列如seq id no.3所示，下游引物e201-r序列如seq id no.4所示。
61.第3组实施例、本发明的杂交种鉴定引物
62.本组实施例提供一种分子鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的引物。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述引物包括：一种检测用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的ssr分子标记e201的引物；所述引物的上游引物e201-f序列如seq id no.3所示，下游引物e201-r序列如seq id no.4所示。
63.第4组实施例、本发明的杂交种鉴定试剂盒
64.本组实施例提供一种用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的试剂盒。本组所有
的实施例都具备如下共同特征：所述试剂盒包括：一种检测用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的ssr分子标记e201的引物；所述引物的上游引物e201-f序列如seq id no.3所示，下游引物e201-r序列如seq id no.4所示。
65.在进一步的实施例中，所述的用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的试剂盒还包括：pcr试剂和/或电泳试剂。
66.在具体的实施例中，所述pcr试剂包括：dntp，taq酶，缓冲液，双蒸水；
67.优选地，所述电泳试剂包括：电泳缓冲液、tris-hcl、sds、丙烯酰胺、过硫酸胺、temed、双蒸水、银染试剂。
68.第5组实施例、本发明的杂交种鉴定方法
69.本组实施例提供一种分子鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：采用检测用于鉴定中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种的ssr分子标记e201的引物对候选南瓜材料进行pcr；所述引物的上游引物e201-f序列如seq id no.3所示，下游引物e201-r序列如seq id no.4所示。
70.在一些实施例中，所述pcr的体系包括：0.75ng/μl dna模板，正向和反向引物各5ng/μl，0.5μl/μl 2
×
3g taq master mix for page(red dye)；
71.优选地，所述pcr体系为：7.5ng dna模板，正向和反向引物各50ng，5μl 2
×
3g taq master mix for page(red dye)，加双蒸水至10μl；
72.所述pcr的程序包括：95℃预变性3分钟；以95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒为1个循环，共35个循环；72℃保温5分钟。
73.在进一步的实施例中，根据所述pcr的产物的电泳结果或测序结果判别鉴定结果；
74.电泳结果显示2条特征条带或测序结果同时测出如seq id no.1和seq id no.2所示的2条序列的候选南瓜材料为中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种；
75.如果只出现一个条带或者不出现条带或者测序结果只测出seq id no.1和seq id no.2的其中之一，则候选南瓜材料并非中国南瓜
‘
中蔬砧1号’杂交种。
76.优选地，所述电泳指，将pcr产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离；
77.优选地，电泳条件为150v恒功率电泳分离1h30min，电泳后银染显色。
78.实验例1、特异性分子标记的筛选
79.根据南瓜ssr引物，以母本
‘
823’和父本
‘
824’全基因组dna为模板，在亲本间筛选有多态性的引物，最终确定亲本间共显性差异标记，命名e201，序列如下：
80.e201-f:acccttcatttccgcaaaac(seq id no.3)
81.e201-r:tacggtgactttcctttccg(seq id no.4)；
82.该标记带型清晰、重复性好。引物e201可扩增出197个核苷酸母本
‘
823’的特异性扩增片段，和202个核苷酸父本
‘
824’特异性片段(见图1)。
83.实验例2、
‘
中蔬砧1号’中国南瓜杂交种纯度鉴定
84.1.鉴定方法
85.1.1叶片基因组dna的提取
86.将父母本(母本
‘
823’和父本
‘
824’)的种子和样品种子同时播种于72孔穴盘中，定期浇水，直至长出两片真叶；将父本、母本和145份杂交样品种子分别单株取样叶片。按照常规ctab方法分别提取基因组dna。
87.(1)取0.2g左右的鲜叶片于2ml离心管中，放入液氮中，然后迅速用玻璃棒研磨成粉末；
88.(2)加入800μl 2％ctab预热缓冲液；
89.(3)65℃水浴1.0h(其间每隔10min将离心管上下缓慢摇晃一次，使干粉样品和ctab充分混合)；
90.(4)室温冷却至15℃以下后，加入等体积(800μl)24:1氯仿/异戊醇，上下混匀10min，保证样品和氯仿充分混合，离心10min(13000rpm/min)；
91.(5)吸取上清液600μl到新的1.5ml离心管，重复第(4)；
92.(6)吸取上清液400μl于另一个1.5ml的离心管中，加入事先在冰箱中预冷的无水乙醇800μl，上下混匀后，于-20℃冰箱中静置30min；
93.(7)13000rpm离心10min，弃上清液，收集沉淀；
94.(8)加入500ul 70％的乙醇，清洗两遍后，室温放置5～10min；
95.(9)7500rpm离心5min，弃上清液，开口置于超净工作台中吹干；
96.(10)加入100μl ddh2o溶解dna。
97.1.2 pcr扩增及检测分析
98.以1.1所述的基因组dna为模板，以e201为引物，分别进行pcr扩增；
99.pcr反应体系为：反应体系10μl，3μl dna(5.0ng
·
μl-1)，正向和反向引物(50ng
·
μl-1)各1μl，5μl 2
×
3g taq master mix for page(red dye)(vazyme公司产品)。
100.pcr扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存。
101.pcr产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5
×
tbe，150v恒功率电泳分离1h30min，电泳后银染显色，统计带型。
102.如果每一种扩增产物的带型均同时具有
‘
中蔬砧1号’杂交种父母本的带型，则待检测南瓜品种为
‘
中蔬砧1号’杂交种，缺少两亲本中任意一条特征带或者为非亲本特异条带的均为假杂种。
103.2.结果分析
104.利用ssr引物e201对
‘
中蔬砧1号’杂交种进行pcr扩增、电泳，完成纯度鉴定，结果见图1，从图1可以清晰的看出，在母本
‘
823’中扩增出197bp的特异性条带，父本
‘
824’中扩增出202bp的特异性条带。其中被检测种子中有135个泳道图谱与
‘
中蔬砧1号’杂交种图谱一致，有10个泳道的图谱与
‘
中蔬砧1号’杂交种标准图谱不一致，说明这10株为杂株，计算得出南瓜杂交种纯度为93.1％，与田间种子纯度调查结果一致，准确率为100％。145粒
‘
中蔬砧1号’种子的样本电泳图谱如图1所示。
105.所述田间种子纯度调查指：基于南瓜植株的田间形态(主要是果实形状这一性状)对具体植株所对应的种子纯度进行区分，果实形状为梨形(上端细下端粗)的植株所对应的种子为
‘
中蔬砧1号’种子，而果实形状为圆柱形(上下端粗细一致)的植株所对应的种子非
‘
中蔬砧1号’种子。这种田间种子纯度调查方式为本领域鉴定
‘
中蔬砧1号’种子纯度的常用方法。