1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种毛囊干细胞的培养方法。
背景技术：
2.毛囊干细胞是成体干细胞的一种，毛囊是皮肤中重要的附属器官，毛囊上皮根鞘中的毛囊干细胞积极参与了创伤后皮肤的修复重建，可作为种子细胞参与组织工程皮肤的构建。相对胚胎干细胞和目前新兴起的诱导多能性干细胞来说，由于哺乳动物几乎所有体表都覆盖有毛囊，毛囊干细胞更容易从自身获得，不受伦理因素的制约，避免了异体干细胞移植带来的免疫排斥，因此具有很大的临床应用前景与价值。但是在体外培养过程中容易受到损伤，导致分选到的毛囊干细胞不易成活，克隆形成效率极低。随着毛囊干细胞的应用价值越来越受到人们的关注，如何获得大量的，质量稳定可控的毛囊干细胞成为人们致力研究的问题。
3.在培养皿上生长的细胞通常使用螯合剂(如乙二胺四乙酸)或蛋白水解酶来收获。但是无法增加细胞的扩增效率，而且细胞外基质、细胞膜蛋白和细胞连接容易被破坏。本发明通过研发出一种温度敏感的细胞培养皿功能剂，功能剂能与细胞培养皿进行良好的粘结，功能剂表面通过温度变化就可以无创地制备各种类型的细胞薄片。对于治疗受损的人体组织和器官具有重大的意义。
4.中国专利cn113502259a公开了一种毛囊干细胞的分离培养方法。该毛囊干细胞的分离方法包括：s1、进行毛囊的显微剥离得到毛囊；s2、在完全培养基中培养毛囊，经过纯化后得到毛囊干细胞；所述完全培养基包括基础培养基、表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松、l-谷酰胺、维生素a、维生素d2、转铁蛋白、亚油酸、牛血清白蛋白和胎牛血清。该发明中制备毛囊干细胞所需要的皮肤材料少，只用几根毛囊甚至一根即可；开始时细胞在其原来的微环境中生长，对细胞损伤小，克隆形成效率高；且能够稳定传代，可以获得足量毛囊干细胞。但是该专利存在毛囊干细胞生长受限，传代稳定性差的缺点。
5.公开号为cn102344906a的发明专利公开一种毛囊干细胞的分离培养方法。该发明提供的方法是利用器官培养的方法，采用william’s e完全培养基对毛囊进行培养并分离纯化出毛囊干细胞。该发明仅用很小的皮肤材料，通过显微剥离技术，在体视镜下剥离出大鼠触须毛囊，然后对整个触须毛囊进行培养，毛囊干细胞从隆突部长出并形成克隆，此细胞的克隆形成效率高，易纯化，能长期传代并保持毛囊干细胞特性不变，用一根触须毛囊就能获得可以长期使用的足量的毛囊干细胞。但是该方法制备的毛囊干细胞提取纯度低，增值过程中贴壁细胞少，增值速率慢。
技术实现要素：
6.有鉴于现有技术中毛囊干细胞提取纯度低、贴壁细胞少、增殖速率慢、传代稳定性差的缺点，本发明采用功能剂涂敷培养皿的方式构造一种毛囊干细胞的培养方法，增强细胞活性，提高了毛囊干细胞的再生能力，提高传代稳定性。
7.为实现上述目的，本发明提供了一种毛囊干细胞的培养方法，包括以下步骤：
8.步骤1、消化：将毛囊干细胞置入消化酶a中，在35～38℃消化0.5～2h，加入终止液终止消化，600～1000rpm离心3～8min，收集消化毛囊干细胞；
9.步骤2、培养：将功能剂均匀涂敷在完全培养基的内表面，涂敷量为5～2mg/cm2，将步骤1制备的消化毛囊干细胞接种于完全培养基中，接种浓度为5
×
103个/ml，培养温度为36～37℃、co2浓度为4.5～5.5％，每1～2天换液一次，总共培养8～15天，得到培育毛囊干细胞；
10.步骤3、纯化：在22～28℃的条件下，用消化酶a将步骤2制备的培育毛囊干细胞消化0.5～2h，吹打成单细胞悬液接种于完全培养基中，再用消化酶b在4～10℃下消化5～15h，消化后用缓冲液收集消化下来的毛囊干细胞。
11.优选的，所述毛囊干细胞取自鼠脑后枕部，在解剖显微镜下采用显微手术剪剪下毛囊外根鞘隆突部，采用pbs液冲洗1～3次。
12.优选的，所述终止液为胎牛血清。
13.优选的，所述完全培养基包括以下组分：40～45ml dmem培养基、1～10μg/ml胰岛素，1～100ng/ml egf，1～100ng/ml fgf、1～100ng/ml vegf-a、1～20ng/ml氢化可的松、0.05～0.2μg/ml维生素a、0.5～2μg/ml维生素d2、1～5mmol/l谷氨酰胺、20～40ng/ml氨基酸、50～200μl青霉素、50～200μl链霉素、2550μl羟基乙醇、10～40μg/ml牛血清白蛋白、体积百分含量14～16％的胎牛血清。
14.egf，表皮细胞生长因子，是人体内分泌的一种重要细胞生长因子，有很强的生理活性。
15.fgf，成纤维细胞生长因子，促进内皮细胞的游走和平滑肌细胞的增殖，不能使平滑肌细胞游走。能够促进新血管形成，修复损害的内皮细胞。fgf被认为是病灶形成促进因子，但从修复角度看它也有有利的一面。
16.vegf-a，血管内皮生长因子a，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。
17.优选的，所述消化酶a为胰蛋白酶，用量为0.08～0.2vt％，消化酶b为dispase酶，用量为0.2～0.3vt％。
18.优选的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，采用35～45重量份磷酸二氢钠和3～8重量份磷酸氢二钠加水配置成800～1200ml溶液制备而成。
19.毛囊干细胞是一类存在于毛囊外根鞘隆突部的干细胞，具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点。体外培养研究中的毛囊干细胞表现出高克隆形成能力，具有很高的再生潜能。由于毛囊干细胞来源于毛发，可以直接从人体自身取得，数量极其丰富，且没有任何并发症，对人完全无创，现已成为皮肤组织工程学研究的焦点。
20.实现毛囊干细胞体外扩增和长期的分化性能，需要克服毛囊干细胞体外培养时传代代数短、细胞分化严重等问题。本发明采用的毛囊干细胞的培养方法能大幅提高毛囊干细胞体外培养的细胞数目并且有效维持毛囊干细胞的分化潜能。通过利用获取的毛囊干细胞，进行分离、培养、纯化后，能够利用细胞增殖获得大量的毛囊干细胞，以弥补毛囊干细胞不足的问题。
21.优选的，所述功能剂的制备方法如下，所述份数均为重量份：
22.s1、将1～3份n-异丙基丙烯酰胺在空气中进行电子束辐照处理，电子束发生器的加速电压为0.8～1.2mev，束流为80～120ma，直到吸收剂量为30～50kgy后停止，加水配置成30～50mmol/l的n-异丙基丙烯酰胺水溶液，转移到冰水浴中继续进行辐照，直到总吸收剂量为70～90kgy后停止，得到辐照n-异丙基丙烯酰胺，在-10～-5℃保存；
23.s2、将步骤s1制备的辐照n-异丙基丙烯酰胺、0.1～0.3份0.02～0.08mmol/l 2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸水溶液和0.1～0.3份引发剂溶于1～5l溶剂中，然后加入0.5～2份9～10wt％聚丙烯酰胺水溶液，在密封环境下20～30℃用氮气脱气10～20min，然后在60～70℃的恒温水浴中反应1～3h，采用冰水冷却，在0～5℃石油醚中沉淀分离，收集沉淀用水洗涤2～4次，并在20～40℃真空干燥至恒重，得到功能剂。
24.优选的，所述引发剂为0.002～0.008mmol/l偶氮二氰基戊酸水溶液。
25.优选的，所述溶剂为甲醇：2-丙醇按体积比1：0.8～1.5混合而成。
26.本发明采用可逆失活自由基聚合(rdrp)方法，使乙烯基单体以均质或嵌段共聚物的形式在表面接枝。通过将n-异丙基丙烯酰胺进行辐照诱导构建接枝活性基团，与2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸和聚丙烯酰胺发生可逆失活自由基聚合进行扩链制备成功能剂。
27.电子束辐照可以激发/电离各种聚合物，增加了氧离子的数量，形成过氧基团，为乙烯基单体的接枝创造自由基位点。表面接枝链与培养皿中的均聚物处于动态平衡，在接枝过程中，自由基和表面接枝的聚合物通过c＝o进行连接，引入氨基作为接枝基团。进行扩链后，提高培养皿表面的粗糙度。接枝的链段物质不仅只存在于最表层，还通过“前接枝机制”向本体方向进行，功能剂中内部聚合物膨胀充当高粘度介质，与培养基进行连接，具有较强的粘性，功能剂表面接枝酰胺基团的共聚物具有由疏水异丙基和亲水酰胺基组成的化学结构，能改善n-异丙基丙烯酰胺的疏水性能，与水形成强相互作用，在临界温度以下水合膨胀，水分子通过氢键与酰胺基相互作用，增加亲水性。在在临界温度以上，开始脱水，酰胺基团之间的分子产生相互作用，功能剂的接枝链断裂，暴露出疏水异丙基，水分子不会在功能剂覆盖的表面上扩散，从而产生较高的疏水性能。这种热响应机制有利于细胞薄片的附着/剥离，温度敏感的细胞培养表面有利于细胞的移植，增强细胞的增殖能力。
28.本发明利用电子束对n-异丙基丙烯酰胺进行辐照，通过可逆失活自由基聚合成功地实现了诱导接枝，将n-异丙基丙烯酰胺链端部分进行延伸，制备成功能剂。功能剂通过延伸链段附着在培养皿上。功能剂具有高温响应的水化作用，使功能剂发生快速的亲水-疏水转变。利用可逆失活自由基聚合技术在纳米尺度上控制内外嵌段的附着力对细胞生长至关重要。有利于细胞薄片的附着/剥离，细胞活力得到提升，细胞附着量大，增值破坏小，细胞的克隆能力更强，增殖代数更多。该技术可用于构建多类型的聚合物基生物材料表面。
29.由于采用了以上的技术方案，与现有技术相比，本发明的一种毛囊干细胞的培养方法，其优点在于：1)利用电子束对n-异丙基丙烯酰胺进行辐照，通过可逆失活自由基聚合制备成功能剂，作用在生物材料表面，具有亲水-疏水转变，有利于细胞薄片的附着/剥离，增强细胞活性。2)培养皿采用科学配比，结合功能剂，规范培育，无细胞毒性，提高了毛囊干细胞的再生能力，且能够稳定传代。
具体实施方式
30.胰蛋白酶，酶活力：2.5
×
105u/g。
31.dispase酶，酶活力：5.0
×
104u/g。
32.实施例1
33.一种毛囊干细胞的培养方法，包括以下步骤：
34.步骤1、消化：取鼠脑后枕部，在解剖显微镜下采用显微手术剪剪下毛囊外根鞘隆突部，采用pbs液冲洗2次，加入体积百分比0.1％胰蛋白酶在37℃消化1h，加入血清终止消化，800rpm离心5min，收集消化毛囊干细胞；
35.步骤2、培养：将功能剂均匀涂敷在完全培养基的内表面，涂敷量为1mg/cm2，将步骤1制备的消化毛囊干细胞接种于完全培养基中，接种浓度为5
×
103个/ml，培养温度为37℃、co2浓度为5％，每2天换液一次，总共培养10天，得到培育毛囊干细胞；
36.步骤3、纯化：在25℃的条件下，用体积百分比0.1％胰蛋白酶将步骤2制备的培育毛囊干细胞消化1h，吹打成单细胞悬液接种于完全培养基中，再向完全培养基中加入体积百分比0.25％dispase酶，在4℃下消化10h，用缓冲液收集消化下来的毛囊干细胞。
37.所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，采用40.0g磷酸二氢钠和5g磷酸氢二钠加水配置成1000ml溶液制备而成。
38.所述完全培养基包括以下组分：44ml dmem培养基、5μg/ml胰岛素，5ng/ml egf，15ng/ml fgf、15ng/ml vegf-a、10ng/ml氢化可的松、0.1μg/ml的维生素a、0.8μg/ml的维生素d2、2mmol/l谷氨酰胺、30ng/ml氨基酸、100μl青霉素、100μl链霉素、25μl羟基乙醇、30μg/ml牛血清白蛋白、体积百分比15％的胎牛血清。
39.所述功能剂的制备方法如下：
40.s1、将2kg n-异丙基丙烯酰胺在空气中进行电子束辐照处理，电子束发生器的加速电压为1mev，束流为100ma，直到吸收剂量为40kgy后停止，加水配置成40.0mmol/l的n-异丙基丙烯酰胺水溶液，转移到冰水浴中继续进行辐照，直到总吸收剂量为80kgy后停止，得到辐照n-异丙基丙烯酰胺，在-10℃保存；
41.s2、将步骤s1制备的辐照n-异丙基丙烯酰胺、0.18kg 0.05mmol/l 2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸水溶液和0.15kg 0.005mmol/l偶氮二氰基戊酸水溶液溶于2l溶剂中，然后加入1kg 9.3wt％聚丙烯酰胺水溶液，在密封环境下25℃用氮气脱气15min，然后在65℃的恒温水浴中反应2h，采用冰水冷却，在3℃石油醚中沉淀分离，收集沉淀用水洗涤3次，并在30℃真空干燥至恒重，得到功能剂。
42.所述溶剂为甲醇：2-丙醇按体积比1：1混合而成。
43.实施例2
44.一种毛囊干细胞的培养方法，与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述功能剂的制备方法不一致。
45.所述功能剂的制备方法如下：
46.s1、将0.18kg 0.05mmol/l 2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸水溶液和0.15kg 0.005mmol/l偶氮二氰基戊酸水溶液溶于2l溶剂中，然后加入1kg 9.3wt％聚丙烯酰胺水溶液，在密封环境下25℃用氮气脱气15min，然后在65℃的恒温水浴中反应2h，采用冰水冷却，在3℃石油醚中沉淀分离，收集沉淀用水洗涤3次，并在30℃真空下干燥至恒重，
得到功能剂。
47.所述溶剂为甲醇：2-丙醇按体积比1：1混合而成。
48.所述缓冲液与实施例1相同。
49.所述完全培养基与实施例1相同。
50.实施例3
51.一种毛囊干细胞的培养方法，与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述功能剂的制备方法不一致。
52.所述功能剂的制备方法如下：
53.s1、将2kg n-异丙基丙烯酰胺在空气中进行电子束辐照处理，电子束发生器的加速电压为1mev，束流为100ma，直到吸收剂量为40kgy后停止，加水配置成40.0mmol/l的n-异丙基丙烯酰胺水溶液，转移到冰水浴中继续进行辐照，直到总吸收剂量为80kgy后停止，得到辐照n-异丙基丙烯酰胺，在-10℃保存；
54.s2、将步骤s1制备的辐照n-异丙基丙烯酰胺和0.15kg 0.005mmol/l偶氮二氰基戊酸水溶液溶于2l溶剂中，然后加入1kg 9.3wt％聚丙烯酰胺水溶液，在密封环境下25℃用氮气脱气15min，然后在65℃的恒温水浴中反应2h，采用冰水冷却，在3℃石油醚中沉淀分离，收集沉淀用水洗涤3次，并在30℃真空下干燥至恒重，得到功能剂。
55.所述溶剂为甲醇：2-丙醇按体积比1：1混合而成。
56.所述缓冲液与实施例1相同。
57.所述完全培养基与实施例1相同。
58.实施例4
59.一种毛囊干细胞的培养方法，与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：所述功能剂的制备方法不一致。
60.所述功能剂的制备方法如下：
61.s1、将2kg n-异丙基丙烯酰胺在空气中进行电子束辐照处理，电子束发生器的加速电压为1mev，束流为100ma，直到吸收剂量为40kgy后停止，加水配置成40.0mmol/l的n-异丙基丙烯酰胺水溶液，转移到冰水浴中继续进行辐照，直到总吸收剂量为80kgy后停止，得到辐照n-异丙基丙烯酰胺，在-10℃保存；
62.s2、将步骤s1制备的辐照n-异丙基丙烯酰胺、0.18kg 0.05mmol/l2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸水溶液和0.005mmol/l偶氮二氰基戊酸水溶液溶于2l溶剂中，在密封环境下25℃用氮气脱气15min，然后在65℃的恒温水浴中反应2h，采用冰水冷却，在3℃石油醚中沉淀分离，收集沉淀用水洗涤3次，并在30℃真空下干燥至恒重，得到功能剂。
63.所述溶剂为甲醇：2-丙醇按体积比1：1混合而成。
64.所述缓冲液与实施例1相同。
65.所述完全培养基与实施例1相同。
66.对比例1
67.一种毛囊干细胞的培养方法，与实施例1基本相同，唯一区别仅仅在于：不添加功能剂。
68.所述缓冲液与实施例1相同。
69.所述完全培养基与实施例1相同。
70.测试例1
71.细胞增长数值测试
72.在实施例和对比例步骤2中分别在培育第二天、第四天取一小滴细胞悬液从盖玻片交界处滴入计数池中，低倍镜下计数，计数板中四大格中的结构完整的细胞，小细胞团计数为1，如果细胞压在格上，则数上不数下，数左不数右；按下式计算出每毫升试样悬液中的细胞数：
73.(四大格中的细胞总数/4)
×
10000＝细胞数/ml
74.测出每格的细胞总数，求出每组试样的平均值，测试结果见表1。
75.表1、细胞增长数值测试结果
76.实验方案第二天计数(个)第四天计数(个)实施例118.2
×
10464.4
×
104实施例213.3
×
10432.0
×
104实施例315.6
×
10444.8
×
104实施例414.9
×
10439.6
×
104对比例112.0
×
10430.2
×
10477.从表1测试结果可以看出，在细胞增长数值测试中实施例1的细胞增长数量最多。可能原因在于本发明采用可逆失活自由基聚合方法，通过将n-异丙基丙烯酰胺进行辐照诱导构建接枝活性过氧基团，与2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸进行反应，然后使含有乙烯基的聚丙烯酰胺以均质或嵌段共聚物的形式在n-异丙基丙烯酰胺表面接枝，制备成功能剂。自由基和表面接枝的聚合物通过c＝o进行连接，氨基作为接枝基团，进行接枝扩链后，提高了培养皿表面的粗糙度。接枝的链段物质不仅只存在于最表层，还通过“前接枝机制”向本体方向进行，功能剂中内部聚合物膨胀充当高粘度介质，与培养基进行连接，具有较强的粘性，功能剂表面接枝酰胺基团的共聚物具有由疏水异丙基和亲水酰胺基组成的化学结构，能改善n-异丙基丙烯酰胺的疏水性能，与水形成强相互作用，在临界温度以下水合膨胀，水分子通过氢键与酰胺基相互作用，增加亲水性。在临界温度以上，开始脱水，酰胺基团之间的分子产生相互作用，功能剂的接枝链断裂，暴露出疏水异丙基，水分子不会在功能剂覆盖的表面上扩散，从而产生较高的疏水性能。这种热响应机制有利于细胞薄片的附着/剥离，温度敏感的细胞培养表面有利于细胞的移植，增强细胞的增殖能力。
78.测试例2
79.流式细胞术检测
80.cd34和β1整合素的联合应用：cd34是造血干细胞的主要标记物，通过流式细胞仪检测，虽然在毛囊干细胞中的表达较低，但是可以反映出毛囊干细胞也具有成体干细胞的特性。毛囊干细胞在培养中β1整合素的表达水平不同，β1整合素高表达的毛囊干细胞比低表达者有着更高的克隆能力，而且细胞形态更均匀一致，不论是培养的或是刚从表皮分离的富含β1整合素的皮肤基底细胞均可以很快速的粘附细胞外基质蛋白，并比未粘附的细胞具有更高的克隆形成能力。β1整合素被认为是表皮干细胞的表面标志物，cd34是目前公认的造血干细胞标志物，并且在毛囊干细胞亦有表达，因此我们在试验中联合使用二者标记后，经流式细胞术进行评判毛囊干细胞的克隆能力。
81.采用流式细胞仪进行检测，在实施例和对比例细胞培养当达到80～90％汇合，取
一部分消化细胞离心，pbs漂洗3次。计数后稀释，制成每100ul pbs中含细胞1
×
106个的细胞悬液，检测的细胞应该立即送检，以保证其有效地表达；加入pe荧光标志的cd34抗体和fitc荧光标志的β1整合素，加荧光标记物时应该将加液枪的枪头深入液面以下，并且剂量亦必须准确；避光作用30分钟，加入500ml pbs稀释后，上机检测。
82.统计方法：本实验通过收集检测数据，计量资料，以均数
±
标准差表示，采用spss17.0软件包处理。测试结果见表2。
83.表2、细胞对于两种标记物的表达测试结果
84.实验方案β1整合素cd34实施例185.72
±
5.2528.61
±
12.25实施例261.51
±
3.4814.46
±
4.03实施例375.70
±
4.3119.80
±
7.51实施例469.66
±
4.2916.52
±
6.30对比例157.42
±
2.7512.30
±
4.01
85.从表2中可以看出实施例1的fitc-β1整合素和pe-cd34的表达情况最好，可能原因在于实施例1利用电子束对n-异丙基丙烯酰胺进行辐照，通过可逆失活自由基聚合成功地实现了诱导接枝，将n-异丙基丙烯酰胺链端部分进行延伸，制备成功能剂。功能剂通过延伸链段附着在培养皿上。功能剂具有高温响应的水化作用，使功能剂发生快速的亲水-疏水转变。利用可逆失活自由基聚合技术在纳米尺度上控制内外嵌段的附着力对细胞生长至关重要。有利于细胞薄片的附着/剥离，细胞活力得到提升，细胞附着量大，增值破坏小，细胞的克隆能力更强，增值代数更多，毛囊干细胞的β1整合素和cd34分泌更多。